Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin - 1

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG LAN QUỲNH NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALLICIN TÁCH TỪ TỎI VIỆT NAM TRONG QÚA TRÌNH ĐIỀU HỊA ĐÁP ỨNG VIÊM THƠNG QUA THỤ THỂ DECTIN-1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG LAN QUỲNH NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALLICIN TÁCH TỪ TỎI VIỆT NAM TRONG QÚA TRÌNH ĐIỀU HỊA ĐÁP ỨNG VIÊM THƠNG QUA THỤ THỂ DECTIN-1 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Tất Cƣờng Hà Nội - 2013 Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn MỞ ĐẦU Các nghiên cứu gần công bố Allicin: Có khả chống viêm nhiễm mạnh, tăng cƣờng hoạt tính tế bào q trình thực bào, tăng cƣờng hoạt tính tế bào giết tự nhiên, ức chế phát triển vi sinh vật gây bệnh, ức chế phát triển tế bào ung thƣ [28, 44] Rất nhiều công bố công ty giới sản xuất Allicin từ việc tạo trình xúc tác Alliin với enzym allinase có sẵn tỏi Bằng việc sử dụng Allicin chiết xuất từ Alliin có sẵn tỏi, công ty giới sản xuất đƣợc nhiều loại thực phẩm chức cao cấp với nhiều tác dụng sinh học quí Dựa vào tín hiệu thụ thể Dectin-1, số hợp chất tách chiết từ thực vật đƣợc chứng minh có khả điều hòa đƣợc đáp ứng viêm điều trị hiệu chuột bị nhiễm khuẩn nặng choáng nhiễm trùng Chẳng hạn, chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc nhƣ Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đƣợc cơng bố có khả điều hịa tín hiệu viêm nhƣ cytokine, q trình phosphoryl hóa MAPK (mitogen activated protein kinase), phản ứng oxy hóa (ROS) thơng qua tín hiệu thụ thể Dectin-1 Tuy nhiên, chất có nguồn gốc từ nhân sâm nên đắt Do vậy, việc tìm kiếm chất có hoạt tính dƣợc học khả chống viêm vấn đề cấp bách để thay số thuốc sử dụng nay, nhƣ góp phần làm giảm bớt tỷ lệ tử vong giá thành điều trị bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Tuy nhiên, kể giới nƣớc chƣa có nghiên cứu sâu vào đánh giá vai trò Allicin đƣờng tín hiệu thụ thể Dectin-1 q trình điều hòa phản ứng viêm mức vật chủ Đặc biệt, Việt Nam quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, lƣợng dân số vào loại cao giới nên khả mắc bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng viêm (inflammation) cao Cho đến nay, nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng nguyên nhân ca tử vong bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU) Các trƣờng hợp tiếp tục gia tăng rộng Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn khắp giới Với thực trạng nay, thị trƣờng nƣớc chủ yếu thuốc nhập ngoại, giá thành đắt bị phụ thuộc vào cơng ty nƣớc ngồi Việt nam lại có tài ngun vơ đa dạng thực vật mà khả ứng dụng vào dƣợc học vơ phong phú Ngồi việc sử dụng thuốc cách tự ý đặc biệt kháng sinh để chống bệnh nhiễm trùng vấn đề cần đƣợc giải Do vậy, việc tìm kiếm phƣơng pháp tá dƣợc chữa bệnh vấn đề cần thiết cấp bách để điều trị hiệu trình viêm hệ thống, hỗ trợ cải thiện đƣợc khả điều trị bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu vai trò Allicin tách từ tỏi Việt Nam trình điều hồ đáp ứng viêm thơng qua thụ thể Dectin – 1” Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung - Đánh giá đƣợc phần hoạt tính dƣợc học Allicin nhƣ loại thuốc q trình điều hóa đáp ứng viêm Nội dung - Có qui trình sản xuất Allicin từ tỏi - Xác định đƣợc chức điều hịa q trình đáp ứng viêm Allicin tổng hợp từ Alliin tỏi - Đánh giá đƣợc hiệu Allicin trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ Miễn dịch bẩm sinh miễn dịch đáp ứng hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng động vật có xƣơng sống Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trò nhƣ hàng rào bảo vệ nhƣng lại khơng có khả nhận dạng lập lại mầm bệnh trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc vùng cụ thể nhờ vô số tế bào lymphocyte mang nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch nhận dạng kháng ngun bên ngồi xâm nhập vào thể Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô số thụ thể để nhận dạng đáp ứng tới mầm bệnh giai đoạn ban đầu thể Quá trình nhận dạng mầm bệnh thụ thể có vai trị vơ quan trọng q trình truyền tín hiệu tới đáp ứng viêm, sản xuất tế bào hiệu tham gia vào trình viêm cục bắt đầu đáp ứng trình miễn dịch đáp ứng Vô số thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 thụ thể scavenger định tới khả sống xót vật chủ trình nhận dạng mẫu phân tử mầm bệnh nhƣ vi khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống nhƣ thụ thể riêng biệt đƣợc gọi PAMP (pathogenic associated molecules pattern) Quá trình nhận dạng mầm bệnh q trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh cytokine, chemokine tiền viêm, trí kích thích q trình ban đầu miễn dịch đáp ứng 1.2 KHÁI NIỆM VIÊM Viêm (inflammation) phần đáp ứng sinh học phức tạp mao mạch với vị trí bị tổn thƣơng thể bị kích thích mầm bệnh tế bào bị hỏng Quá trình nhằm bảo vệ quan, loại bỏ hay sửa chữa vị trí kích thích bị thƣơng bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào đƣợc hoạt hóa tập trung đến ổ viêm nhờ loại tế bào di chuyển (migrating cells ) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân , tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào giải phóng hàng loạt chất trung gian, phần lớn Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu interleukin-1 Các chất lại tiếp tục hoạt hoá tế bào khác làm giải phóng hàng loạt enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein nhờ proteinase, interleukin, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), superoxide, H+, hydroperoxide gây tổn thƣơng mơ, qua khép kín q trình viêm mạn tính Q trình tiết chất trung gian nhƣ làm tăng dòng chảy máu tới vùng bị xâm nhập dẫn tới tƣợng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết làm hẹp dòng chảy máu dẫn tới bị sƣng Khi trình viêm kéo dài dẫn tới hiệu tích lũy trạng thái cân qúa trình viêm chiếm ƣu trình kháng viêm q trình đơng tụ chiếm ƣu trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, mô bị tổn thƣơng hậu tiếp sau dẫn tới viêm nặng choáng viêm, chức đa quan tử vong [25] 1.3 NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHỐNG NHIỄM TRÙNG Nhiễm trùng đƣợc định nghĩa nhƣ phổ điều kiện lâm sàng gây đáp ứng miễn dịch bệnh nhân tới trình nhiễm trùng mà đƣợc đặc trƣng viêm hệ thống q trình đơng tụ [6,7,8] Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] Thời kỳ đầu biểu đáp ứng viêm ạt tới q trình nhiễm trùng Hầu hết, cytokine tiền viêm nhƣ TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, interferon gamma (IFN gamma) Sau đó, thể điều hòa đáp ứng sản xuất cytokine kháng viêm (IL-10), chất ức chế thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, IL-1RA (một dạng bất hoạt IL-1) [12] Các lớp đáp ứng viêm hệ thống vật chủ đƣợc bắt đầu số sản phẩm vi khuẩn Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố proteases; vi khuẩn gram dƣơng nhƣ ngoại độc tố, siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) số chất vỏ tế bào nấm (zymosan đƣợc phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết thụ thể macrophage Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn vật chủ kích hoạt protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (NFқB)) [12] Chẳng hạn, thụ thể Toll like (TLR4) nhận dạng LPS, thụ thể Dectin-1 nhận dạng zymosan [8,15] Sau đó, thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào Hiệu tích lũy lớp viêm hệ thống dẫn tới trạng thái cân bằng, với trình viêm chiếm ƣu q trình kháng viêm q trình đơng tụ chiếm ƣu trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, mô bị tổn thƣơng hậu tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng, chức đa quan tử vong [25, 21] Hình 1: Bệnh nhân bị shock nhiễm trùng Bé T.T.T.P (11 tuổi, ngụ tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu) cấp cứu tình trạng shock nhiễm trùng Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 1.4 MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số thành phần khác để chống lại trình xâm nhập vi sinh vật Thứ nhất, chức hàng rào biểu bì thể cản trở q trình gây viêm nhiễm mầm bệnh Thứ hai, tế bào phân tử kiểm soát phá hủy mầm bệnh mà trốn khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên Thứ ba hàng rào quan trọng hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh mơ tế bào macrophage truyền tín hiệu bảo vệ tế bào vùng ngoại biên hệ thống bổ thể protein truyền tín hiệu hệ thống miễn dịch bẩm sinh dƣới dạng dịch nằm khoảng khơng mơ máu Q trình nhận dạng hệ thống miễn dịch loại bỏ mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số chế hiệu khác Hệ thống miễn dịch bẩm sinh xem nhƣ có vai trị quan trọng trình viêm nhiễm 1.4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) 1.4.1.1 Định nghĩa: Thụ thể protein biệt hoá để tiếp nhận phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất) 1.4.1.2 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) đƣợc chia làm ba nhóm bắt nguồn từ vị trí tế bào là: Thụ thể huyết phần dịch mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm màng dịch tế bào đƣợc xem thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19] Mỗi nhóm thụ thể PRR có phối tử đặc hiệu để nhận dạng loại vi sinh vật định [19] Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh cách trực tiếp (không thông qua opsonin) gián tiếp (thông qua oposonin) [19] Đối với In vivo, nhiều thụ thể tham gia để nhận dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng đa vị trí Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn đƣợc nhận PRR giống nhƣ thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể (CR3), dectin-1 [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh PRR kích thích q trình sản xuất cytokine chemokine dẫn tới Lớp cao học K20 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn trình hoạt động sinh tế bào khác tham gia tới vị trí trình bị viêm nhiễm Từ đây, dẫn tới phản ứng miễn dịch đáp ứng [12] Hình 2: Các thụ thể RRP nấm nhận dạng phần cacbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans 1.4.1.3 Thụ thể Toll- like (TLR) Thụ thể Toll- like (TLR) protein màng mà nhận dạng phân tử có sẵn mầm bệnh (PAMP) [20] Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bao gồm 10 loại khác Chúng có vai trò tới nhận dạng phối tử có nguồn gốc từ mầm bệnh [20] TLR2 nhận dạng lipoproteins gốc đƣờng có gắn lipid-(lipoarabinomannan) từ thành tế bào vi khuẩn nấm [13] TLR4 nhận dạng lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào vi khuẩn gram âm [15,35,37] TLR9 nhận dạng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG) có deoxyribonucleic acid (DNA) vi khuẩn [13] Một vi sinh vật đƣợc nhận nhiều TLR Thực tế, tổ hợp TLR tham gia vào đáp ứng viêm macrophage tế bào dendritic sinh trình thể bị nhiễm mầm bệnh [20] TLR bao gồm đoạn nằm bên tế bào đƣợc gọi thụ thể Toll/IL-1 (TIR) Đoạn trƣờng với đoạn TIR khác Lớp cao học K20 10 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 3.10 A icin Tỏi Lý Sơn giảm khả sản xuất cytokine chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Để đánh giá khả điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng thƣờng có hai tiêu quan trọng đƣợc đánh giá huyết áp nồng độ cytokine Do vậy, huyết chuột sau bị gây nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng đƣợc tiêm Allicin 20mg/kg chuột không nhận đƣợc Allicin đánh giá nồng độ TNF IL – Kết hình cho thấy nồng độ giảm đáng kể chuột nhận đƣợc Allicin so với chuột không nhận đƣợc Allicin Những kết Allicin có khả làm giảm lƣợng cytokine huyết chuột bị nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng Hình 15: A icin ức chế trình cytokin tiền viê nhiễ tr ng nặng choáng nhiễ chuột ị tr ng Máu chuột bị nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng nhận Allicin chuột khơng nhận Allicin tách huyết ly tâm (10000vòng/phút) Sau mẫu huyết xác định cytokine đo ELISA Chuột không nhận Allicin, ĐC; Chuột nhận Allicin, W; Zymosan, Zym Lớp cao học K20 43 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã xây dựng đƣợc quy trình cơng nghệ sản xuất Allicin Allicin với nồng độ 20 µg/ml có khả ức chế q trình sinh cytokine tiền viêm (IL-6, TNF) BMDM gây kích thích zymosan thông qua thụ thể Dectin-1 Allicin với nồng độ 20 µg/ml có khả ức chế q trình phospho hóa MAPK (p38 ERK1/2) BMDM đƣợc kích thích zymosan thông qua thụ thể Dectin-1 Allicin với nồng độ 20 µg/ml có khả ức chế q trình tạo gốc oxy hóa BMDM đƣợc kích thích zymosan thông qua thụ thể Dectin-1 Allicin với liều lƣợng 30mg/kg có khả tăng cƣờng khả sống chuột bị shock zymosan gây KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sâu chế chống viêm thử đối tƣợng khác ngồi chuột Xác định thêm Allicin có phải cấu tử thụ thể glucocorticoid hay khơng Lớp cao học K20 44 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nguyễn Minh Thanh, Châu Văn Minh, Nguyễn Trọng Thông (2008), “Nghiên cứu khả kháng viêm từ rong tảo biển Việt Nam”, Tạp chí Hố học, 46(5A):Tr 81-90 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội Đỗ Thị Oanh, Phạm Thanh Kỳ , Nguyễn Thị Bích Hằng , Nguyễn Trọng Thơng, Phạm Thị Vân Anh (2010), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm bảo vệ gan cao sói rừng (Sapium sebiferum) thực nghiệm, Tạp chí Dược học, 50(411): Tr 36-39 Hà Vân Oanh , Phạm Xuân Sinh , Nguyễn Thai An , Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thị Vân Anh (2010), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm cao lỏng bạch đông (Clerodendrum Chinese var simplex (Mold) SL Chen) thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 50(414): Tr 20-23 Nguyễn Thị Bích Hằng , Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Trọng Thơng , Phạm Thị Vân Anh , Nguyễn Thị Hoa Hiên (2009), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm cao lỏng vọng cách (Premna corymbosa Rotteneen) thựcc nghiệm”, Tạp chí Dược học, 48(389): Tr 22-24 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ahn, J Y., Song, J Y., Yun, Y S., Jeong, G., Choi, I.S., et al (2006), “Protection of Staphylococcus aureus infected septic mice by suppression of Early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan”, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 46:p 187-197 Annane, D., Sebille, V., Bellissant, E., the Ger-Inf Study Group (2006), “Effects of low dose corticosteroids in septic shock patients with or without early acute respiratory distress syndrome”, Crit Care Med, 34:p 22-30 Lớp cao học K20 45 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn Ariizumi,K.,Shen,G.L., Shikano, S., Xu, S., Ritter, R., Kumamoto, T.Edelbaum, D., Morita, A., Bergstresser, P.R., Takashima, A (2000), “Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, dectin-1, by subtractive cDNA cloning”, Journal of Biological Chemistry, 275:p 20157- 20167 Attele, A.S., Wu, J.A., Yuan, C.S (1999), Ginseng pharmacology: “Multiple constituents and multiple actions”, Biochemical Pharmacology, 58: p16851693 10 Babior, B.M (1999), NADPH oxidase: an update Blood, 93:p146476 11 Bailey, J.M (1991), “New mechanisms for effects of anti-inflammatory glucocorticoids”, Biofactors, 3:p 97-102 12 Barnes, P.J., Karin, M (1997), “Nuclear factor-kappaB: A pivotal transcription factor in chronic inflammatory disease”, The England new journal of medicine, 336:p 1066-1071 13 Bauer, S., Kirschning, C.J., Häcker, H., Redecke, V., Hausmann, S., Akira, S., Wagner, H., Lipford, G.B (2001), “Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition”, Proc Natl Acad Sci, 98:p 9237–9242 14 Bedard, K., Krause, K-H (2007), “The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology”, Physiol Rev, 87: p245– 313 15 Blanqué R, Meakin C, Millet S, Gardner CR (1998), “Selective enhancement of LPS-induced serum TNF-alpha production by carrageenan pretreatment in mice”, General Pharmacology, 31(2):p301-6 16 Brown GD (2006), “Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor”, Nature, 6: p33-43 17 Briegel, J., Kellermann, W., Forst, H., Haller, M., Bittl, M., Hoffmann, G.E., et al (1994), “Low-dose hydrocortisone infusion attenuates the systemic inflammatory response syndrome The phospholipase A2 study group”, Clin Invest, 72:p 782-7 Lớp cao học K20 46 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 18 Boguski MS (2002), “News and views comparative genomics: The mouse that roared”, Nature, 420:p 515-516 19 Brown, G.D., Gordon, S (2001), “Immune recognition A new receptor for beta- glucans”, Nature, 413: p36-37 20 Brown, G.D (2006), “Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor”, Natrure, 6:p 33-43 21 Cohen J., (2002), “The immunopathogenesis of sepsis”, Nature, 420: 885–91 22 Choi, K.T (2008), “Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C A Meyer”, Acta Pharmacol Sin, 29: p1109–1118 23 Clark, A.R (2007), “Anti-inflammatory functions of glucocorticoid-induced genes”, Molecular and Cellular Endocrinology, 275: p79-97 24 Cuong, T.T., et al (2009), “Glucocorticoid receptor agonist compound K regulates dectin-1-dependent inflammatory signaling through inhibition of reactive oxygen species”, Life Sciences, 85: 625-633 25 Cuzzocrea, S., Di, Paola R., Mazzon, E., Patel, N.S., Genovese, T., Muia, C., Crisafulli, C., Caputi, A.P., et al Thiemermann,C.,et “Erythropoietin al (2006), reduces the development of nonseptic shock induced by zymosan in mice”, Critical Care Medicine, 34: p1168-1177 26 Cuzzocrea, S., Filippelli, A., Zingarelli, B., Falciani, M., Caputi, A.P., Rossi, F., et al (1997), “ Role of nitric oxide in a nonseptic shock model induced by zymosan in the rat”, Shock, 7: p351-357 27 Dang, P.M., Stensballe, A., Boussetta, T., Raad, H., Dewas, C., Kroviarski Y, Hayem G, Jensen ON, Gougerot-Pocidalo MA, El-Benna J (2006), “A specific neutrophil p47phox-serine phosphorylated by convergent MAPKs mediates NADPH oxidase priming at inflammatory sites”, Journal of Clinical Investigation, 116:p2033-2043 28 Dipaolo, J.A, Carrathers, C (1960), “ The Effect of Allicin from Garlic on Tumor Growth”, Cancer Research, (20): p431-434 Lớp cao học K20 47 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 29 Donini, M., Zenaro, E., Tamassia, N., Dusi, S (2007), “NADPH oxidase of human dendritic cells: role in Candida albicans killing and regulation by interferons, dectin-1 and CD206”, European Journal of Immunology, 37: p1194-203 30 Doyle, S., et al (2002), IRF3 mediates a TLR3/TLR4- specific antiviral gene program, Immunity, 17: p251–263 31 El Benna, J., Faust, L.P., Babior, B.M (1994), “The phosphorylation of the respiratory burst oxidase component p47phox during neutrophil activation Phosphorylation of sites recognized by protein kinase C and by prolinedirected kinases”, Journal of Biological Chemistry, 269:p 23431-6 32 Goldstein SA, Shemano I, Daweo R, Betler JM (1967), “Cotton pellet granuloma pouch method for evaluation anti-inflammatory activity”, Arc International Pharmcodynamic Therap, 165: p294-301 33 Heinrich P.Koch- Larry D.Lawson (2000), p431-434 34 Iliev DB., et al (2005), “Endotoxin recognition: in fish or not in fish?”, FEBS Lett, 579: 519–28 35 Kobori M (2004), “Wedelolactone suppresses LPS-induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK complex”, Cell Death and Differentiation, 11: p123– 130 36 Lee, M.H., Yuk, J.M., Shin, D.M., Jo, E.K (2009), “Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells”, J Clin Immunol, 29 (6): p795-805 37 Mackman N., et al (1991), “Lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the human tissue factor gene in THP-1 monocytic cells requires both activator protein and nuclear factor kappa B binding sites”, J Exp Med, 174:p 117–26 38 Oommen S, Anto RJ, Srinivas G, Karunagaran D (2004), “Allicin (from garlic) induces caspase-mediated apoptosis in cancer cells”, Eur J Pharmacol, (13):p 97-103 Lớp cao học K20 48 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 39 Opal SM, Esmon CT (2003), “Bench-to-bedside review: functional relationships between coagulation and the innate immune response and their respective roles in the pathogenesis of sepsis”, Crit Care, 7: p 23–38 40 Parrillo JE (2005), “ Severe sepsis and therapy with activated protein C”, N Engl J Med; 353:p 1398–400 41 Riedemann NC., et al (2003), “Novel strategies for the treatment of sepsis”, Nat Med, 9:p 17–24 42 Slofstra SH., et al (2005), “Low molecular weight heparin attenuates multiple organ failure in a murine model of disseminated intravascular coagulation”, Crit Care Med, 33:p 1365–70 43 Sun, L., Zhao, Y (2007), “The biological role of dectin-1 in immune response”, International Reviews of Immunology, 26:p 349-364 44 Sun, L., Wang, X (2003), “Effects of allicin on both telomerase activity and apoptosis in gastric cancer SGC-7901 cells”, Gastric cancer:p 1930-1934 45 Taylor PR., et al (2007), “Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection”, Nature Immunology, (1):p 31–38 46 Vane J and Botting R (1987), “Inflammation and the mechanism of action of anti-inflammatory drugs”, The FASEB Journal, 1(2):p 89-96 47 Wagner H., et al (1986), “ Coumestans as the Main Active Principles of the Liver Drugs Eclipta alba and Wedelia calendulacea”, Planta Med, 5: p370-4 48 Wheeler AP., Bernard GR (1999), “Treating patients with severe sepsis”, N Engl J Med, 340:p 07–14 49 Winter CA, Risely EA, Nuss GW (1962), “Carregeenan induced edema in hind paw of the rat as assay for anti-inflammatory drugs”, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,111:p 544–547 Clinical Investigation, 116: p2033-2043 50 Yang, C-S., et al (2008), “The ginsenoside metabolite compound K, a novel agonist of glucocorticoid receptor, induces tolerance to endotoxin-induced lethal shock”, J Cell Mol Med ,12 (1): p 1-17 Lớp cao học K20 49 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn Nguồn trích dẫn qua internet URL1:http://www.allimax.ca URL2:http://www.ykhoanet.com/yhoccotruyen/voha/vh062.htm URL3:http://www.inspiredliving.com/allimax-allicin-garlic URL4: Http://www.childrenshospital.org/holistic URL5: Http://www.childrenshospital.org/holistic URL6: Http://wwang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/Alli URL7 : http://www.restekcorp.com Lớp cao học K20 50 Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trịnh Tất Cường – người thầy tận tâm, truyền cho tơi lịng say mê khoa học, nhiệt tình bảo cho tơi nhiều kiến thức mẻ q trình tơi học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin cảm ơn quý thầy tổ Hóa sinh, phịng thí nghiệm trọng điểm, quý thầy cô Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN – Đại học Quốc Gia Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền thụ kiến thức cho suốt năm học tập trường Tôi xin cảm ơn phòng Sau đại học, BGH Trường ĐHKHTN – Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin gửi lời chi ân đến gia đình, tất bạn bè, đồng nghiệp, người thân yêu bên quan tâm, chia sẻ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Đề tài hoàn thành với giúp đỡ từ kinh phí đề tài mang mã số: QG.12.13 Hà Nội, Ngày 10 tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Hoàng Lan Quỳnh Lớp cao học K20 i Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Mục tiêu đề tài Chƣơng 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ 1.2 KHÁI NIỆM VIÊM .6 1.3 NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG 1.4 MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN 1.4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) 1.4.1.1 Định nghĩa: Thụ thể protein biệt hoá để tiếp nhận phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất) 1.4.1.2 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh 1.4.1.3 Thụ thể Toll- like (TLR) 10 1.4.1.4 Thụ thể Dectin-1 11 1.4.1.5 Thụ thể Dectin-1 hoạt động với TLR2 để nhận dạng phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật 12 1.4.1.6 Glucocorticoid 14 1.4.1.7 ROS .14 1.4.1.8 Vai trò đại thực bào đáp ứng viêm .15 1.5 Mơ hình nghiên cứu viêm thực nghiệm in vivo sử dụng Zymosan 16 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC 17 1.6.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 17 1.6.1.1 Các chất kháng viêm khơng có chất steroid (NSAID) 17 1.6.1.2.Các chất kháng viêm có chất steroid .18 1.6.1.3 Các chất khác 18 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 18 1.7 CÂY TỎI VÀ VAI TRỊ CỦA ALLICIN TRONG Q TRÌNH KHÁNG VIÊM 20 Lớp cao học K20 ii Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 1.7.1 Cây tỏi .20 1.7.1.1 Phân loại thực vật – Đặc điểm sinh thái .21 1.7.2 Allicin sản phẩm chứa Allicin .23 1.7.3 Sản xuất Allicin từ alliin có tỏi 25 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 27 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Động vật thí nghiệm 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng chuột .27 2.2.2 Đánh giá hoạt tính độc tố Allicin tới khả sống BMDM kít CCK-8 .27 2.2.3 Sản xuất Allicin từ tỏi .28 2.2.4 Đánh giá khả sản xuất cytokine ELISA Kit 29 2.2.4.1 Giới thiệu phƣơng pháp .29 2.2.4.2 Nguyên tắc 29 2.2.4.3 Qui trình thí nghiệm .29 2.2.4.4 Pha dung dịch chuẩn 30 2.2.5 Phân tích hiệu ức chế đƣờng tín hiệu MAPK (p38) Allicin gây viêm zymosan sử dụng kỹ thuật western blot 31 2.2.6 Phân tích ức chế Allicin trình tạo phản ứng oxy hóa .31 2.2.7 Xây dựng mơ hình in vivo gây bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng chuột sử dụng zymosan 31 2.2.8 Phân tích thống kê 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Đánh giá khả tinh Allicin 33 3.2 Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tƣơi 33 3.3 Khả sống tế bào không bị ảnh hửơng Allicin .35 Lớp cao học K20 iii Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn 3.4 Đánh giá khả zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine .36 3.5 Allicin ức chế trình sinh cytokine tiền viêm BMDM đƣợc kích thích zymosan 37 3.6 Allicin điều hịa q trình sinh cytokine tiền viêm thơng qua thụ thể Dectin-1 .38 3.7 Allicin có khả ức chế q trình phospho hóa MAPK (p38 ERK1/2) BMDM đƣợc kích thích zymonsan thông qua thụ thể Dectin-1 40 3.8 Allicin điều khiển q trình sinh ROS zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1 .40 3.9 Allicin bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng gây zymosan 42 3.10 Allicin làm giảm khả sản xuất cytokine chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Lớp cao học K20 iv Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn DANH MỤC HÌNH Hình 1: Bệnh nhân bị shock nhiễm trùng Hình 2: Các thụ thể RRP nấm nhận dạng phần cacsbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans Hình 3: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác TLR để nhận dạng nấm .11 Hình 4: Biểu thụ thể tế bào bạch cầu 14 Hình 5: Cây tỏi 21 Hình 6: Sắc ký đồ dịch tỏi trƣớc sau sản xuất Allicin từ dịch tỏi 31 Hình 7: Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tƣơi 32 Hình 8: Allicin khơng gây độc tế bào BMDMs 33 Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm kháng viêm 34 Hình 10: Allicin ức chế trình sinh cytokine tiền viêm BMDM đƣợc kích thích zymosan .35 Hình 11: Allicin C-K điều hịa q trình đáp ứng viêm kích thích zymosan thông qua thụ thể dectin-1 37 Hình 12: Kết thực kỹ thuật Westernt blot 38 Hình 13: Allicin C-K ức chế trình sản sinh ROS đƣợc kích thích zymosan thơng qua Dectin-1 .39 Hình 14: Allicin bảo vệ chuột nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng 40 Hình 15: Allicin ức chế trình cytokine tiền viêm chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng .41 Lớp cao học K20 v Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT STT AP – Activation Protein – 1 BMDM Bone Marrow – Derived Macrophage DHE Fluorescent Dyes (dihydroethidium) ELISA Enzyme – linked Immuno Sorbent Assay GR Glucocorticoid receptor IL Interleukin LPS Lipopolysaccharides LT Leukotrienes NSAID/NSAIDs Nonesteroidal anti – ìnlammatory drugs NF – KB Nuclear factor kappa – light – chain – enhancer of activated B cells 10 ICU Intensive – care unit 11 PG Prostaglandins 12 ROS Reactive oxygen species 13 TLR Toll – like receptor 14 TNF Tumor necrosis factor 15 PRR Pattenr recognition receptor 16 PAMP Pathogenic associated molecules pattern 17 NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 18 ERK Extracellular signal –regulated kinase 19 Bcl – 10 B – cell lymphoma – 10 20 OD Optical density 21 RNS Reactive nitrogen species 22 TX Thromboxane Lớp cao học K20 vi Khóa 2011 - 2013 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Tỏi Lý Sơn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HỒNG LAN QUỲNH NGHIÊN CỨU VAI TRỊ CỦA ALLICIN TÁCH TỪ TỎI VIỆT NAM TRONG QÚA TRÌNH ĐIỀU HỊA ĐÁP ỨNG VIÊM THƠNG QUA THỤ THỂ DECTIN-1 Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Tất Cƣờng Hà Nội - 2013 Lớp cao học K20 vii Khóa 2011 - 2013