Nghiên cứu vi khuẩn trong chất nhầy san hô ở hai quần đảo Cát Bà và Long Châu, Việt Nam: Luận án TS. Sinh học: 62 42 01 07

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======== PHẠM THẾ THƢ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN TRONG CHẤT NHẦY SAN HÔ Ở HAI QUẦN ĐẢO CÁT BÀ VÀ LONG CHÂU, VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======== PHẠM THẾ THƢ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN TRONG CHẤT NHẦY SAN HÔ Ở HAI QUẦN ĐẢO CÁT BÀ VÀ LONG CHÂU, VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Yvan Bettarel PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Thế Thƣ, nghiên cứu sinh Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh vật học, mã số 62 42 01 07, khóa học 2011 – 2014, xin cam đoan: Đề tài luận án Tiến sĩ Sinh học cơng trình nghiên cứu riêng thực dƣới hƣớng dẫn Tiến sĩ Yvan Bettarel PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Các tài liệu tham khảo kết nghiên cứu tác giả khác sử dụng luận án với mục đích phân tích so sánh đƣợc trích dẫn đầy đủ, minh bạch, theo quy định nguồn cơng bố Tồn nội dung kết nghiên cứu luận án đảm bảo tính trung thực, có đủ độ tin cậy, đảm bảo tính mẻ, khơng trùng lặp chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Nghiên cứu sinh Phạm Thế Thư LỜI CẢM ƠN Hồn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Yvan Bettarel PGS.TS Bùi Thị Việt Hà tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Tài nguyên Môi trƣờng biển, Phòng Sinh vật Phù du Vi sinh vật biển, thầy cô thuộc Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi q trình tơi học tập thực luận án Xin chân thành cảm ơn TS Thierry Bouvier (Viện Nghiên cứu Phát triển - IRD, Pháp) việc hƣớng dẫn phân tích mẫu máy đo dịng tế bào (Flow Cytometry); ThS Corrine Bouvier (IRD, Pháp) việc hƣớng dẫn phân tích đa dạng vi khuẩn phƣơng pháp điện di biến tính (DGGE); ThS Nguyễn Thị Thanh Thủy (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng) việc phân tích mẫu kính hiển vi điện tử; PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh ThS Cung Thị Ngọc Mai thuộc Viện Công nghệ Sinh học (IBT) tạo điều kiện cho tơi phân tích mẫu máy DGGE Phịng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng (IBT); ThS Nguyễn Đăng Ngải, Viện Tài nguyên Môi trƣờng (IMER) việc thu mẫu phân loại lồi san hơ; ThS Justine Brune (IRD, Pháp), TS Chu Văn Thuộc, ThS Cao Văn Lƣơng, ThS Phạm Văn Lƣợng CN Trịnh Văn Quảng (IMER) việc khảo sát thu mẫu đo thông số môi trƣờng Luận án thực với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (mã số VAST07.03/11-12); đề tài Nghị định thƣ Việt – Pháp nghiên cứu ảnh hưởng muội than tới hệ vi sinh vật biển Vịnh Hạ Long đề tài ―CORINE‖ thuộc chƣơng trình EC2CO (Pháp) Cuối cùng, xin cảm ơn ngƣời thân yêu gia đình, nguồn động viên lớn giúp tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu sinh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 13 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 1.1 San hô rạn san hô 16 1.1.1 Khái niệm san hô rạn san hô 16 1.1.2 Giá trị thực trạng san hô 18 1.2 Dinh dƣỡng quan hệ đối tác holobiont san hô 20 1.3 Đặc điểm chức lớp chất nhầy đời sống san hô 22 1.4 Bệnh tác nhân gây bệnh san hô 24 1.4.1 Một số khái niệm quan điểm bệnh 24 1.4.2 Thực trạng bệnh san hô 26 1.4.3 Bệnh dải trắng (White plague) san hô 29 1.5 Vi khuẩn, vi rút sức khỏe san hô 30 1.6 Vi khuẩn hệ thống phịng vệ lớp chất nhầy san hơ 34 1.7 Đặc điểm môi trƣờng tự nhiên san hô vùng nghiên cứu 37 1.7.1 Đặc điểm môi trƣờng tự nhiên vùng nghiên cứu 37 1.7.2 Thực trạng xu hƣớng biến động san hô vùng nghiên cứu 39 1.7.3 Tình hình dịch bệnh san hơ vùng nghiên cứu 41 1.8 Luận giải vấn đề giả thuyết nghiên cứu luận án 42 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Địa điểm, thời gian đối tƣợng nghiên cứu 45 2.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 45 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 45 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 48 2.2.1 Phác đồ nghiên cứu luận án 48 2.2.2 Phƣơng pháp thu xử lý mẫu thực địa 49 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích chất lƣợng nƣớc 51 2.2.4 Phƣơng pháp định lƣợng vi rút vi khuẩn (Leruste cs, 2012; Patel cs, 2007) 51 2.2.5 Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn dị dƣỡng Vibrio 55 2.2.6 Phƣơng pháp xác định tỉ lệ tế bào vi khuẩn có hoạt động hơ hấp máy đo dòng tế bào – Flow Cytometry (Marine cs, 2013) 55 2.2.7 Phƣơng pháp đánh giá đa dạng chức vi khuẩn đĩa sinh thái - Biolog Ecoplate (Christian Lind, 2006) 56 2.2.8 Phƣơng pháp xác định đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn kỹ thuật điện di biến tính (DGGE) 59 2.2.8.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số (Muyzer cs, 1993) 59 2.2.8.2 Phƣơng pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (Muyzer cs, 1993) 59 2.2.8.3 Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số sản phẩm PCR 60 2.2.8.4 Phƣơng pháp điện di biến tính - DGGE (Marine cs, 2013; Muyzer cs, 1993) 60 2.2.9 Phƣơng pháp hình thái học so sánh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 61 2.2.10 Phƣơng pháp đọc trình tự nucleotide 62 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 63 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 64 3.1 Đặc điểm quần xã vi khuẩn lớp chất nhầy san hô khỏe mạnh 64 3.1.1 Mật độ vi khuẩn vi rút tổng số lớp chất nhầy san hơ 64 3.1.2 Tỉ lệ nhóm hình thái vi khuẩn 69 3.1.3 Mật độ vi khuẩn dị dƣỡng nhóm vi khuẩn Vibrio 70 3.1.4 Đặc điểm hoạt động vi khuẩn chất nhầy san hơ 72 3.1.4.1 Tỷ lệ vi khuẩn có hoạt động hô hấp 72 3.1.4.2 Hoạt động chuyển hóa chất hữu 73 3.1.5 Đa dạng di truyền vi khuẩn chất nhầy san hô 77 3.1.5.1 Số lƣợng đơn vị phân loại phân tử quần xã vi khuẩn 77 3.1.5.2 Mật độ DNA đơn vị phân loại 80 3.1.5.3 Sự phân bố đơn vị phân loại quần xã vi khuẩn 81 3.1.5.4 Hệ số đa dạng Shannon (H’) quần xã vi khuẩn 83 3.1.6 Đặc điểm phân loại học vủa vi khuẩn lớp chất nhầy san hô 84 3.2 Đặc điểm quần xã vi khuẩn lớp chất nhầy san hô bị bệnh 97 3.2.1 Mật độ vi khuẩn tổng số lớp chất nhầy san hô bị bệnh 98 3.2.2 Vi khuẩn dị dƣỡng nhóm Vibrio chất nhầy san hơ bị bệnh 99 3.2.3 Tỷ lệ vi khuẩn có hoạt động hô hấp chất nhầy san hô bị bệnh 100 3.2.4 Số lƣợng đơn vị phân loại phân tử quần xã vi khuẩn chất nhầy san hô bị bệnh 102 3.2.5 Khả chuyển hóa chất hữu vi khuẩn chất nhầy san hô bị bệnh 102 3.2.6 Hình thái vi khuẩn phân bố lớp chất nhầy san hô bị bệnh 105 3.3 Bàn luận kết nghiên cứu 110 3.3.1 Sự khác biệt quần xã vi khuẩn lớp chất nhầy lồi san hơ 110 3.3.2 Sự khác biệt quần xã vi sinh vật chất nhầy san hô so với môi trƣờng nƣớc vai trị chúng sức khỏe san hơ 111 3.3.3 Sự khác biệt quần xã vi sinh vật chất nhầy san hô hai khu vực nghiên cứu vai trò chúng sức khỏe san hô 114 3.3.4 Hoạt động vi khuẩn vi rút liên quan tới sức khỏe san hô 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 Kết luận 123 Kiến nghị 124 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 126 Tài liệu tiếng Việt 125 Tài liệu tiếng Anh 125 PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung đƣợc viết tắt AWCD Average Well Color Development – Giá trị trung bình tăng độ mầu giếng thí nghiệm BAC Mật độ tổng tế bào vi khuẩn BAM Bacteriophage Adherence to Mucus – Thể thực khuẩn gắn với dịch nhầy BOD Biochemical Oxygen Demand – Nhu cầu ô xy sinh hóa C-BAC Counting bacteria – Số lƣợng tế bào vi khuẩn đƣợc đếm CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc Chl a Chlorophyll a CNRS Centre National de la Recherche Scientifique – Trung tâm nghiên cứu khoa học quốc gia (Pháp) COD Chemical Oxygen Demand – Nhu cầu xy hóa học CTC 5-cyano-2, 3-ditolyl tetrazolium clorua CTD Conductivity, Temperature and Depth – Độ dẫn điện, nhiệt độ, độ sâu CV Phần trăm độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình C-VIB Counting viruse – Số lƣợng hạt vi rút đƣợc đếm DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – Điện di biến tính DNA Deoxyribonucleic Acid DO Dissolved Oxygen – Ơ xy hịa tan DOC Dissolved Organic Carbon – Các bon hữu hòa tan DOM Dissolved Organic Matter – Chất hữu hòa tan HST Hệ sinh thái Ig Immunoglobulin IRD Institute of Research for the Development – Viện Nghiên cứu Phát triển (Pháp) ISI International Scientific Indexing – Chỉ số khoa học quốc tế MCB Mean for Cat Ba area – Giá trị trung bình đƣợc tính cho khu vực Cát Bà MLC Mean for Long Chau area – Giá trị trung bình đƣợc tính cho khu vực Long Chau Mmuc Mean for coral mucus - Giá trị trung bình đƣợc tính cho mẫu chất nhầy san hơ Msw Mean for sea water - Giá trị trung bình đƣợc tính cho mẫu môi trƣờng nƣớc MT Môi trƣờng nƣớc xung quanh NCBI National Center for Biotechnology Information – Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học quốc gia (Mỹ) DN Dịch nhầy san hô ND Not done - Không xác định OD Optical density – Mật độ quang OTU Operational Taxonomic Unit – Đơn vị phân loại PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp QXVK Quần xã vi khuẩn RNA Ribonucleic Acid – Axit ribonucleotit SDS Đệm sodium dodecylsulfate SH San hô TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar - Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Vibrio TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 144 Rosenberg E., Koren O., Reshef L., Efrony R., Zilber-Rosenberg I (2007b), "The role of microorganisms in coral health, disease and evolution", Nature reviews Microbiology 5, pp 355-362 145 Rosenberg E., Kushmaro A., Kramarsky-Winter E., Banin E., Yossi L (2009), "The role of microorganisms in coral bleaching", The ISME journal 3, pp 139-146 146 Rypien K.L., Ward J.R., Azam F (2010), "Antagonistic interactions among coral-associated bacteria", Environmental microbiology 12, pp 2839 147 Sanders R.W., Caron D.A., Berninger U.G (1992), "Relationships between bacteria and heterotrophic nanoplankton in marine and fresh water- an inter-ecosystem comparison", Mar Ecol Prog Ser 86, pp 1-14 148 Santavy D.a.E.C.P (1997), "Microbial pests: coral diseases in the western Atlantic, " In: H.A Lessios and I.G Macintyre (eds.) Proceedings of the 8th International Coral Reef Symposium Vol Smithsonian Tropical Research Institute, Panama , pp 55-68 149 Sekar R., Mills D.K., Remily E.R., Voss J.D., Richardson L.L (2006), "Microbial communities in the surface mucopolysaccharide layer and the black band microbial mat of black band-diseased Siderastrea siderea", Applied and environmental microbiology 72, pp 5963-5973 150 Servais P., Agogué H., Courties C., Joux F., Lebaron P (2001), "Are the actively respiring cells (CTC+) those responsible for bacterial production in aquatic environments?", FEMS microbiology ecology 35, pp 171-179 151 Shao-Qiang T., Qiang X., Lin Z., Jing-Jing C., Ya-Nan W., Bing Q (2012), ―Analysis of the Bacterial Communities in Lime Concretion Black Soil upon the Incorporation of Crop Residues‖, Open Journal of Soil Science, 9, 312-319 143 152 Sharon G., Rosenberg E (2008), "Bacterial growth on coral mucus", Current microbiology 56, pp 481-488 153 Sharon G., Segal D., Ringo J.M., Hefetz A., Zilber-Rosenberg I., Rosenberg E (2010), "Commensal bacteria play a role in mating preference of Drosophila melanogaster", Proceedings of the National Academy of Sciences 107, pp 20051-20056 154 Sherr B.F., del Giorgio, P., Sherr, E.B (1999), "Estimating abundance and single-cell characteristics of respiring bacteria via the redox dye CTC", Aquatic Microbial Ecology 18, pp 117-131 155 Shnit-Orland M., Kushmaro A (2008), Coral mucus bacteria as a source for antibacterial activity, Proceedings of the 11th International Coral Reef Symposium, Ft Lauderdale, Florid, pp 257-259 156 Shnit-Orland M., Sivan A., Kushmaro A (2012), "Antibacterial Activity of Pseudoalteromonas in the Coral Holobiont", Microbial ecology 64, pp 851-859 157 Snieszko S (1974), "The effects of environmental stress on outbreaks of infectious diseases of fishes*", Journal of fish biology 6, pp 197-208 158 Soffer N., Brandt M.E., Correa A.M., Smith T.B., Thurber R.V (2014), "Potential role of viruses in white plague coral disease", The ISME journal 8, pp 271-283 159 Sokolow S (2009), "Effects of a changing climate on the dynamics of coral infectious disease: a review of the evidence", Diseases of aquatic organisms 87, pp 5-18 160 Stocker R., Seymour J.R (2012), "Ecology and physics of bacterial chemotaxis in the ocean", Microbiology and Molecular Biology Reviews 76, pp 792-812 161 Sunagawa S., DeSantis T.Z., Piceno Y.M., Brodie E.L., Voolstra C.R., Weil E., Andersen G.L., Medina M (2009), "Bacterial diversity and White 144 Plague Disease-associated community changes in the Caribbean coral Montastraea faveolata", The ISME journal 3, pp 512-521 162 Sutherland K.P., Porter J.W., Torres C (2004), "Disease and immunity in Caribbean and Indo-Pacific zooxanthellate corals", Marine Ecology Progress Series 266, pp 265-272 163 Suttle C.A (2007), "Marine viruses - major players in the global ecosystem", Nature Rev Microbiol 5, pp 801-812 164 Suzanne F., Tove L.J., Ngai D.N., Magnus N., Michael T (2011), "Differences in physiologic al response to increased seawater temperature in nearsh ore and offshore corals in northern Vietnam", Marine environmental research 71(3): pp 225-33 165 Sweet M., Bythell J (2012), "Ciliate and bacterial communities associated with White Syndrome and Brown Band Disease in reef‐building corals", Environmental microbiology 14, pp 2184-2199 166 Thurber R.L.V., Barott K.L., Hall D., Liu H., Rodriguez-Mueller B., Desnues C., Edwards R.A., Haynes M., Angly F.E., Wegley L (2008), "Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa", Proceedings of the National Academy of Sciences 105, pp 18413-18418 167 Tran D.T., Tran D.L., Dang H.N., Nguyen T.K.A (2004), "An overview of the geological values and sedimentary environment of Ha Long Bay", Marine Resources and Environment 10, pp 38 - 64 168 Tremblay P., Weinbauer M.G., Rottier C., Guérardel Y., Nozais C., Ferrier-Pagès C (2011), "Mucus composition and bacterial communities associated with the tissue and skeleton of three scleractinian corals maintained under culture conditions", Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 91, pp 649-657 145 169 Vega-Thurber R., Willner-Hall D., Rodriguez-Mueller B., Desnues C., Edwards R.A., Angly F., Dinsdale E., Kelly L., Rohwer F (2009), "Metagenomic analysis of stressed coral holobionts", Environmental microbiology 11, pp 2148-2163 170 Voss J., Richardson L (2006), "Nutrient enrichment enhances black band disease progression in corals", Coral Reefs 25, pp 569-576 171 Weil E (2004), "Coral reef diseases in the wider Caribbean: status and prognosis", In: Rosenberg E, Loya Y (eds) Coral health and disease Springer-Verlag, Heildelberg 172 Weinbauer M., Bettarel Y., Cattaneo R., Luef B., Maier C., Motegi C., Peduzzi P., Mari X (2009), "Viral ecology of organic and inorganic particles in aquatic systems: avenues for further research", Aquatic Microbial Ecology 57, p 321 173 Weinbauer M.G (2004), "Ecology of prokaryotic viruses", FEMS microbiology reviews 28, pp 127-181 174 Wild C., Naumann M., Niggl W., Haas A (2010), "Carbohydrate composition of mucus released by scleractinian warm- and cold-water reef corals", Aquatic Biology 10, pp 41-45 175 Willis B.L., Page C.A., Dinsdale E.A (2004), "Corals disease on the Great Barrier Reef ", In: Rosenberg E, Loya Y (eds) Coral health and disease Springer-Verlag Heildelberg 176 Willner D., Haynes M.R., Hanson N., Kirby B., Lim Y.W., Rainey P.B., Schmieder R., Youle M., Conrad D (2012), "Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung", American journal of respiratory cell and molecular biology 46, pp 127-131 177 Wilson W.H., Dale A.L., Davy J.E., Davy S.K (2005), "An enemy within? Observations of virus-like particles in reef corals", Coral Reefs 24, pp 145-148 146 178 Wilson W.H.F., I ; Ryan, K ; Davy, S K (2001), "Temperature induction of viruses in symbiotic dinoflagellates ", Aquatic Microbial Ecology 25, pp 99-102 179 Work T.M., Aeby G.S (2006), "Systematically describing gross lesions in corals", Diseases of aquatic organisms 70, p 155 147 PHỤ LỤC i MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG Hoạt động thu mẫu Thu mẫu nƣớc cho phân tích hóa lý phân tích vi sinh vật mơi trƣờng Hình ảnh thu mẫu san hơ phƣơng pháp lặn có khí tài SCUBA Thu mẫu dịch nhầy san hô ii Thu mẫu dịch nhầy san hô Dấu hiệu bệnh dải trắng san hô Dấu hiệu bệnh đốm đỏ san hô Hoạt động nuôi trồng thủy sản Vịnh Cát Bà iii Hình ảnh xử lý mẫu ngồi thực địa Xử lý mẫu vật phịng thí nghiệm thực địa (tại Khách sạn Cát Bà Plaza) Thí nghiệm Biolog, ni cấy vi khuẩn xử lý mẫu sau thu (trong vịng giờ) Phân tích mẫu phịng thí nghiệm Hoạt động ni cấy vi khuẩn phịng thí nghiệm iv a b K K B B Định lƣợng nhóm vi khuẩn mơi trƣờng chọn lọc Đo mật độ quang thí nghiệm Biolog Ecoplate máy Microplate reader Tách chiết DNA tổng số v Điện di mẫu DNA gel agarose Kiểm tra chụp ảnh gel buồng tia UV Phân tích mẫu máy DGGE vi Hình ảnh mẫu vi sinh vật Vi khuẩn Vi rút Vi rút Hình ảnh vi rút tế bào vi khuẩn mẫu nƣớc quan sát kính hiển vi huỳnh quang với độ phóng đại 10.000X sau đƣợc nhuộm SYBR Gold Hình ảnh vi khuẩn bám dính vi tảo cộng sinh san hơ (zooxanthellae) dƣới kính hiển vi huỳnh quang Hình ảnh phân tích mẫu kính hiển vi điện tử xuyên (TEM) Phân tích mẫu kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) vii Bảng i.1 Thành phần đơn vị phân loại (OTU) mẫu dịch nhầy san hô mẫu nƣớc đƣợc nghiên cứu Dạng OUT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 Tổng OTU1 - - - - - - - - - - - - - - - + - + - - - - - - - + - OTU2 + - - - - - - - - - - - + + + - + - + + - + - - - - + OTU3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - + + - OTU4 - + - + + + + - - - - + - + + + + + + + + + + + - - - 17 OTU5 + + - + - + + + + + + + + - - + + + - + - - - - - + - 16 OTU6 - - - + - - + + - + - + + + + - + + + - - + + + + + - 16 OTU7 - - - - - + - + - + + - + + + + - - - + - - - - - - - OTU8 + - - - + - - - - + - - - - + - - - - + + - - - - + - OTU9 - - - - - - - + - - + - - + + + - - + + - + - - - - - OTU10 + + - + + + + - + + + + + + + + + + - - + + - - - - - 18 OTU11 - - - - - - + + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - OTU12 + + - + - - + + - + - + + + + - - - + - - - - - - + + 13 OTU13 - - - - - + - + + - + - - - + + - + - - - - - - - - - OTU14 - + + + + - - + + + + - - - + - + - + + - - - - - + + 14 OTU15 - - + - - + + + - - - - + - - - + - - + - - - - - - - OTU16 + - + - + + + + + - + - - + + + + + + - + - - - - - - 15 OTU17 + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + - 24 OTU18 + + + - + + + + + + + + + + + - - + + + - + + + + + - 22 OTU19 - - + + - + + + + + + + - - - + - + + - + + + + - - - 16 OTU20 + - + + + - - + - - + - + + - + + + + - + - + - - + + 16 OTU21 - - - - - - + - - + - - + - + + + - - + - - - - - - - OTU22 - - - - - - - + - - + + + - + - + + - + - - + + - + + 12 OTU23 + - - - + - + + - + + + - - + + + + + + + + + - - - + 17 OTU24 + - + - - - + + - + - + + + + + + + - - - + + + - + - 16 OTU25 + - + - - + - - - + + + + + + + - - - + + + - - - - + 14 OTU26 - - - - + - - + + - - - + + - - - - + + - - + + - - - OTU27 - + + - + + + + - + + + + + + + - - - - + + + - - + + 18 OTU28 + + + + - + + + + + + - - + + - - - + + + + + + - + + 20 OTU29 + - - + + - + + + + + + - + + + + + + - - + + + - + - 19 OTU30 + - - - + - + - - - + - - - + + - - - + + + + - + - + 12 viii Tiếp theo bảng i.1 OTU31 - + + - OTU32 OTU33 + + - - - - - + - - + OTU34 - + - + - OTU35 - - - - OTU36 + + + OTU37 - + OTU38 + OTU39 - OTU40 + - + + - - + - - - + - - + - - - + + + + - + + + + - + - - + + - - + - + - - - - + + + + + - + + + - + - - + + + + - + + - - - - + - - - - - - - - - OTU41 - - + + + + OTU42 + + - + + OTU43 - + + + OTU44 + - + - - + - + - - + - + - + + + - - - - - + + + + + + + + - + + - + - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + - + + + + - + + - + - + + + + + - + + + - + + + - - - - - - + - - - + + - - + - - - - + + - + - + + - + + + + - + - - - - + + - + - + + - - - - - - - + 10 - - - - + - 10 + + - - - - 13 + + - - - + 17 - - - - - + - + - - - - - + + 19 + - - - - + + - - 15 + + + + + + - - + + 22 - - - + + + + + - + 13 - - - - + + + + - - - - - + - - + + + + + + + 15 + + + + + + + + + + - + + 22 - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - + - + - + + + 13 OTU45 - - - + + - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - + + OTU46 + + + + + + + + - + + + + + + + - - - - + - - - + - + 18 OTU47 + - - + + + + + + + - - + + - + - + + + - - + - - - - 15 OTU48 + + + + + + + + + + + + + + + + + - - + - - + + - + + 22 OTU49 - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - + OTU50 - + - + + - + + - - - - - - - + - + + - + - + + + + + 14 OTU51 - - - - - - - - + - - - - - + - + + + - - - + - + - - OTU52 + - - - + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + 23 OTU53 - + + + + + - - - - - + - - + + + + + + + - + + + + + 18 OTU54 - - - + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - + 20 OTU55 - - - - + + + + + + - + + + + + - - + - + + + + - - - 16 OTU56 - - - - - - - + - + - - - - + - - + - - - - - - - - - OTU57 + - + + + + + + + - + + - + + + + + - + - + - - + + - 19 OTU58 + + + + + + + - - + - + + - - - - - - - - - - - - - - 10 OTU59 + + + + + - + - + + - + + - + + + - - + + - - - - + - 16 OTU60 - + - + - + - + - + - - - + - - - - - - + - - - - - - OTU61 + - + - + - - + + - - - - - - - + - - - + + + + - - - 10 OTU62 - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - ix Tiếp theo bảng i.1 OTU63 + + - - + - - - + + - + + - + + + - + - - - - - - - - 11 OTU64 - + + - + + - + + + + + - + + + + + + + + - + - - + - 19 OTU65 - - - - - - - - + - - - - + - - - - - - - - - - - - - OTU66 + + + + + - + - - - - - + - + + + - + - + + + + + - - 16 OTU67 - - - - - - - + + + + - - - - - - - - + - - - - - - - OTU68 + - - + + + + - - - - + + + - - - - - - - - - - - - - OTU69 - - - - - - - - - - + - - - + + + + + + + - - - - + + 10 OTU70 + + + - + + + + - + - - - - - - - - - - + + + + + - - 13 OTU71 + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - - - - + + + 22 OTU72 - - - - - - - - - - + + + + + - + - + - - + + - - - - OTU73 - - + - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - OTU74 + - + - - + - + - + - - + - + + - + + + + - - - + - - 13 OTU75 - - - - + + + + - + - - + + - - + - - - - - + + - - + 11 OTU76 + - - + - + + + + + + + + + + - - - - - - + - - - + - 14 OTU77 + - - + + + + + + - - + - - - + + + - - - + + - - + + 15 OTU78 + - + - - + + - - + + + + + + + - - + + - - - + + - - 15 OTU79 + - + - - - + + + - - + + + + + + - + - - + + + + - - 16 OTU80 - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - OTU81 - - - + + + - + - + - - + - + - + - - + - + + - - + - 12 OTU82 - - - - - - - - - + + - - - + - - - - - - - - - - - - OTU83 + - - + + + + - + - - - - - - - + - - - - + + - - + - 10 OTU84 - - - - - + - - + + - - - - - - + - + + - - + - - - + OTU85 - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + OTU86 - - - - - + + - - - - - - - - - - - + - - - - - - - + x