Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm : Luận văn ThS. Hóa học: 60 44 29

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Trung tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy mơn Hố Phân Tích, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, năm 2012 Học viên Vũ Thị Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………… ………………………….… 1.1 Giới thiệu kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)…………………………… 1.1.1 Lịch sử phát hiện………………………………………………………… ….3 1.1.2 Phân loại SAs……………………………………………………………… 1.1.3 Cấu tạo SAs……………………………………………………………….4 1.1.4 Tác dụng SAs…………………………………………………………… 1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid 1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs thực phẩm .9 1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs 1.2.1 Trong nƣớc .10 1.2.2 Thế giới 10 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng……………………………………… …19 2.2.2 Detector khối phổ………………………………………………………….…21 2.2.3 Phân tích định tính định lƣợng LC/MS…………………………….26 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu…………………… …26 2.3.1 Thiết bị dụng cụ……………………………………………………… …26 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn…………………………………………………… …27 2.4 Lấy mẫu .28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Tối ƣu điều kiện tách xác định Sulfonamid thiết bị LC/MS/MS 29 3.1.1 Tối ƣu điều kiện detector khối phổ (MS)………………………… 29 3.1.2 Lựa chọn cột tách……………………………………………………… …32 3.1.3 Khảo sát chƣơng trình gradient………………………………………… …32 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động .36 3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic pha động 38 3.2 Tối ƣu q trình xử lý mẫu phân tích SAs 40 3.2.1 Khảo sát qui trình chiết 43 3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết .46 3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH dung môi chiết 48 3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA 49 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích .52 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn 52 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp 56 3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ (độ thu hồi) 58 3.3 Phân tích mẫu thực .65 KẾT LUẬN 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC .80 Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic pha động 80 Phụ lục 2: Kết khảo sát qui trình chiết mẫu .82 Phụ lục 3: Kết khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết 87 Phụ lục 4: Kết khảo sát nồng độ MeOH dung môi chiết khối lƣợng PSA 92 Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) 94 Phụ lục 6: Một số sắc đồ tế 104 phân tích mẫu thực DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học số SAs đƣợc xác định đề tài Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs số thị trƣờng Bảng 3.1: Các thơng số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu cho nguồn khí 29 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 38 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết SAs 44 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi SAs 45 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs 46 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs 48 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs 49 Bảng 3.9 : Cách pha dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS 53 Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn SAs (có IS) 53 Bảng 3.11: Đƣờng chuẩn SAs (khơng có IS) 55 Bảng 3.12: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng SAs 56 Bảng 3.13: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 5ppb 59 Bảng 3.14: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 10ppb 61 Bảng 3.16: Qui định độ chụm phƣơng pháp định lƣợng phụ thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC 65 Bảng 3.17: Kết phân tích mẫu thực 67 DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 2.1: Sơ đồ khối khối phổ kế 21 Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 23 Hình 2.3: Cấu tạo phân tích khối tứ cực MS/MS 25 Hình 3.1: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 33 Hình 3.2: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 34 Hình 3.3: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 34 Hình 3.4: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 35 Hình 3.5: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 35 Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,2 ml/phút 36 Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,3 ml/phút 37 Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,4 ml/phút 37 Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,5 ml/phút 37 Hình 3.10: Sắc đồ SAs nồng độ acid formic 0,15% 39 Hình 3.11: Ảnh hƣởng quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi SIM 45 Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs 47 Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs nồng độ acid acetic 1% 47 Hình 3.14: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs 49 Hình 3.15: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs 50 Hình 3.16: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ STZ khoảng 0,5-500ppb 52 Hình 3.17: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ SDM khoảng 0,5-500ppb 52 Hình 3.18: Đƣờng chuẩn SMM (R2 = 1,0000) 54 Hình 3.19: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9991) 54 Hình 3.20: Đƣờng chuẩn SIM (R2 = 0,9999) 55 Hình 3.21: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9998) 56 Hình 3.22: Sắc đồ SMM giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,5) 57 Hình 3.23: Sắc đồ STZ giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,3) 57 Hình 3.24: Sắc đồ SP giới hạn định lƣợng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5) 58 Hình 3.25: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 5ppb 60 Hình 3.26: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 10ppb 62 Hình 3.27: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 20ppb 64 Hình 3.28: Sắc đồ mẫu gan lợn khơng nhiễm SAs 72 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM 73 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile CE Collision energy Năng lƣợng va chạm EI Electron Ionization Ion hóa dịng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol metanol MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dƣ lƣợng tối đa PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SPE solid phase extraction Chiết pha rắn U.S NRP United States Program National UPLCMS/MS Ultral performance chromatography tandem spectrometry UV Ultraviolet liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Residue Chƣơng trình quốc gia tồn dƣ chất độc Mỹ liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu kết mass nối khối phổ Tử ngoại MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm mối quan tâm hàng đầu toàn xã hội An toàn thực phẩm sản phẩm chăn nuôi không đơn sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà cịn chỗ sản phẩm chứa chất gây ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất) Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , vấn đề dƣ lƣợng thuốc kháng sinh tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng thịt gia súc gia cầm thực trạng nan giải đáng báo động Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đƣơ ̣c tiêu thu ̣ thi ̣trƣờng , nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh Nguyên nhân ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng Sulfonamid (SAs) nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng vai trò quan trọng hiệu việc hạn chế nhiễm trùng vi khuẩn vi sinh vật hệ thống tiêu hóa vật ni Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn điều trị loạt bệnh gia súc gia cầm nhƣ bệnh tiêu hóa hay hơ hấp Song hệ khơng thể tránh khỏi sử dụng nhóm chất kháng sinh tồn dƣ chúng thịt gia súc gia cầm, gây nguy kháng thuốc kháng sinh vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng vật nuôi, gây hại cho sức khỏe ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ kháng thuốc [1] Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy thiếu sót cơng tác kiểm tra, tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, sơ xuất nấu nƣớng, vệ sinh 10 Hình P3.10: Sắc đồ phân tích SAs nồng độ acid acetic 1% Phụ lục 4: Kết khảo sát nồng độ MeOH dung môi chiết khối lƣợng PSA Hình P4.1: Hiệu suất thu hồi SD phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.2: Hiệu suất thu hồi SM phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.3: Hiệu suất thu hồi SP phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.4: Hiệu suất thu hồi SMM phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Hình P4.5: Hiệu suất thu hồi SMX phụ thuộc nồng độ MeOH, khối lƣợng PSA Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) Hình P5.1: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 1) Hình P5.2: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 2) Hình P5.3: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 3) Hình P5.4: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 4) Hình P5.5: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 5) Hình P5.6: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn ppb (lần 6) Hình P5.7: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 1) Hình P5.8: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 2) Hình P5.9: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 3) Hình P5.10: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 4) Hình P5.11: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 5) Hình P5.12: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 10 ppb (lần 6) Hình P5.13: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 1) Hình P5.14: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 2) Hình P5.15: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 3) Hình P5.16: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 4) Hình P5.17: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 5) Hình P5.18: Sắc đồ 10 SAs nồng độ thêm chuẩn 20 ppb (lần 6) Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế Hình P6.1: Sắc đồ mẫu thịt bị khơng phát SAs Hình P6.2: Sắc đồ mẫu thịt gà khơng phát SAs Hình P6.3: Sắc đồ mẫu thận lợn không phát SAs