MÉu b×a luËn v¨n th¹c sÜ cã in ch÷ nhò khæ 210x297mm 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Trung tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy mơn Hố Phân Tích, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, năm 2012 Học viên Vũ Thị Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………… ………………………….… 1.1 Giới thiệu kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)…………………………… 1.1.1 Lịch sử phát hiện………………………………………………………… ….3 1.1.2 Phân loại SAs……………………………………………………………… 1.1.3 Cấu tạo SAs……………………………………………………………….4 1.1.4 Tác dụng SAs…………………………………………………………… 1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid 1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs thực phẩm .9 1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs 1.2.1 Trong nƣớc .10 1.2.2 Thế giới 10 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng……………………………………… …19 2.2.2 Detector khối phổ………………………………………………………….…21 2.2.3 Phân tích định tính định lƣợng LC/MS…………………………….26 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu…………………… …26 2.3.1 Thiết bị dụng cụ……………………………………………………… …26 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn…………………………………………………… …27 2.4 Lấy mẫu .28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Tối ƣu điều kiện tách xác định Sulfonamid thiết bị LC/MS/MS 29 3.1.1 Tối ƣu điều kiện detector khối phổ (MS)………………………… 29 3.1.2 Lựa chọn cột tách……………………………………………………… …32 3.1.3 Khảo sát chƣơng trình gradient………………………………………… …32 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động .36 3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic pha động 38 3.2 Tối ƣu q trình xử lý mẫu phân tích SAs 40 3.2.1 Khảo sát qui trình chiết 43 3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết .46 3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH dung môi chiết 48 3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA 49 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích .52 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn 52 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp 56 3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ (độ thu hồi) 58 3.3 Phân tích mẫu thực .65 KẾT LUẬN 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC .80 Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic pha động 80 Phụ lục 2: Kết khảo sát qui trình chiết mẫu .82 Phụ lục 3: Kết khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết 87 Phụ lục 4: Kết khảo sát nồng độ MeOH dung môi chiết khối lƣợng PSA 92 Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) 94 Phụ lục 6: Một số sắc đồ tế 104 phân tích mẫu thực DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học số SAs đƣợc xác định đề tài Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép SAs số thị trƣờng Bảng 3.1: Các thơng số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu cho nguồn khí 29 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 38 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết SAs 44 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi SAs 45 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs 46 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs 48 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs 49 Bảng 3.9 : Cách pha dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS 53 Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn SAs (có IS) 53 Bảng 3.11: Đƣờng chuẩn SAs (khơng có IS) 55 Bảng 3.12: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng SAs 56 Bảng 3.13: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 5ppb 59 Bảng 3.14: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi SAs mẫu thịt lợn 10ppb 61 Bảng 3.16: Qui định độ chụm phƣơng pháp định lƣợng phụ thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC 65 Bảng 3.17: Kết phân tích mẫu thực 67 DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 2.1: Sơ đồ khối khối phổ kế 21 Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 23 Hình 2.3: Cấu tạo phân tích khối tứ cực MS/MS 25 Hình 3.1: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 33 Hình 3.2: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 34 Hình 3.3: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 34 Hình 3.4: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 35 Hình 3.5: Sắc ký đồ SAs theo chƣơng trình gradient 35 Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,2 ml/phút 36 Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,3 ml/phút 37 Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dịng 0,4 ml/phút 37 Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,5 ml/phút 37 Hình 3.10: Sắc đồ SAs nồng độ acid formic 0,15% 39 Hình 3.11: Ảnh hƣởng quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi SIM 45 Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs 47 Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs nồng độ acid acetic 1% 47 Hình 3.14: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs 49 Hình 3.15: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs 50 Hình 3.16: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ STZ khoảng 0,5-500ppb 52 Hình 3.17: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ SDM khoảng 0,5-500ppb 52 Hình 3.18: Đƣờng chuẩn SMM (R2 = 1,0000) 54 Hình 3.19: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9991) 54 Hình 3.20: Đƣờng chuẩn SIM (R2 = 0,9999) 55 Hình 3.21: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9998) 56 Hình 3.22: Sắc đồ SMM giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,5) 57 Hình 3.23: Sắc đồ STZ giới hạn phát LOD 0,025ppb (S/N = 3,3) 57 Hình 3.24: Sắc đồ SP giới hạn định lƣợng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5) 58 Hình 3.25: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 5ppb 60 Hình 3.26: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 10ppb 62 Hình 3.27: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs mức nồng độ 20ppb 64 Hình 3.28: Sắc đồ mẫu gan lợn khơng nhiễm SAs 72 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM 73 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile CE Collision energy Năng lƣợng va chạm EI Electron Ionization Ion hóa dịng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol metanol MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dƣ lƣợng tối đa PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SPE solid phase extraction Chiết pha rắn U.S NRP United States Program National UPLCMS/MS Ultral performance chromatography tandem spectrometry UV Ultraviolet liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Residue Chƣơng trình quốc gia tồn dƣ chất độc Mỹ liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu kết mass nối khối phổ Tử ngoại MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm mối quan tâm hàng đầu toàn xã hội An toàn thực phẩm sản phẩm chăn nuôi không đơn sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà cịn chỗ sản phẩm chứa chất gây ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất) Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , vấn đề dƣ lƣợng thuốc kháng sinh tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng thịt gia súc gia cầm thực trạng nan giải đáng báo động Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đƣơ ̣c tiêu thu ̣ thi ̣trƣờng , nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh Nguyên nhân ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng Sulfonamid (SAs) nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng vai trò quan trọng hiệu việc hạn chế nhiễm trùng vi khuẩn vi sinh vật hệ thống tiêu hóa vật ni Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn điều trị loạt bệnh gia súc gia cầm nhƣ bệnh tiêu hóa hay hơ hấp Song hệ khơng thể tránh khỏi sử dụng nhóm chất kháng sinh tồn dƣ chúng thịt gia súc gia cầm, gây nguy kháng thuốc kháng sinh vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng vật nuôi, gây hại cho sức khỏe ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ kháng thuốc [1] Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy thiếu sót cơng tác kiểm tra, tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, sơ xuất nấu nƣớng, vệ sinh 10 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động Tốc độ pha động ảnh hƣởng đến thời gian rửa giải lƣợng dung môi tiêu tốn Đặc biệt, với hệ UFLC, tốc độ dòng ảnh hƣởng nhiều đến ổn định chƣơng trình gradient độ lặp lại trình sắc ký Nếu tốc độ nhỏ, chƣơng trình gradient ổn định Tốc độ dòng cao, ảnh hƣởng đến áp suất toàn hệ thống Sau lựa chọn đƣợc chƣơng trình rửa giải gradient 1, thời gian rửa giải SAs muộn (từ phút), tiến hành khảo sát tốc độ pha động khoảng từ 0,2 – 0,5 ml/phút Cố định điều kiện: - Cột C18 (150mm × 2,1mm × 3,5µm) - Pha động: kênh A (H2O chứa 0,1% acid formic), kênh B: ACN theo chƣơng trình gradient Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn 10SAs, nồng độ: 10 ng/ml XIC of +MRM (22 pairs): 250.000/92.000 Da ID: SP1 from Sample (mix 10ppb) of Data.wiff (T Max 4.6e4 cps 7.8e4 7.6e4 7.4e4 7.2e4 7.0e4 6.8e4 6.6e4 6.4e4 6.2e4 6.0e4 5.8e4 5.6e4 5.4e4 5.2e4 5.0e4 4.8e4 9.76 4.6e4 4.4e4 Intensity, cps 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 0.0 1.13 1.96 1.0 2.26 2.0 3.24 4.33 3.0 4.0 4.66 5.0 5.64 6.0 6.66 6.93 7.0 8.19 8.0 10.60 8.55 9.0 10.0 Time, 11.0 12.07 12.0 13.01 13.0 14.75 14.0 15.0 16.15 16.93 16.0 17.0 18.0 Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,2 ml/phút XIC of +MRM (22 pairs): 279.000/124.000 Da ID: SIM1 from Sample 19 (mix 10ppb-g1-formic 0.1%-TF0.3) of Data.wiff (Turbo Spray) Max 4.3e4 cps 4.7e4 4.6e4 4.4e4 6.98 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 I n t e n s it y , c p s 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 46 9.0 Time, 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,3 ml/phút XIC of +MRM (22 pairs): 279.000/124.000 Da ID: SIM1 from Sample 20 (mix 10ppb-g1-formic 0.1%-TF0.4) of Data.wiff (Turbo Spray) Max 4.6e4 cps 5.2e4 5.0e4 4.8e4 6.87 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 I n t e n s it y , c p s 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Time, 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,4 ml/phút XIC of +MRM (22 pairs): 279.000/124.000 Da ID: SIM1 from Sample 21 (mix 10ppb-g1-formic 0.1%-TF0.5) of Data.wiff (Turbo Spray) Max 8.7e4 cps 7.89 8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 I n t e n s it y , c p s 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Time, 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải SAs tốc độ dòng 0,5 ml/phút Nhận xét: Khi tăng tốc độ dịng pha động, pic sắc ký có xu hƣớng nhọn rõ nét Tại tốc độ dòng 0,5 pic sắc nhọn Tuy nhiên, tốc độ này, áp suất hệ cao, ảnh hƣởng lớn đến áp suất đầu vào cột làm giảm tuổi thọ cột Do đó, chúng tơi định lựa chọn tốc độ dòng 0,4ml/phút Tại tốc độ này, SAs bắt đầu đƣợc rửa giải từ phút 3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic pha động Các SAs có giá trị pKa khác nhau, khoảng 4,83 – 8,54 (bảng 1) Do đó, thành phần acid formic ảnh hƣởng lớn đến khả tách chất Mặt khác, phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không ảnh hƣởng tới 47 q trình tách chất mà cịn ảnh hƣởng tới q trình ion hóa, tín hiệu chất phân tích Chúng tơi khảo sát tỉ lệ acid formic kênh A, với tỉ lệ: – 0,2% Cố định điều kiện sắc ký: - Cột C18 (150mm ì 2,1mm ì 3,5àm) - Pha ng: kờnh A (H2O chứa 0,1% acid formic), kênh B: ACN - Tốc độ dịng: 0,4ml/phút - Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn 10SAs, nồng độ: 10 ng/ml Thu đƣợc kết sau: Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs Diện tích pic (× 105) Nồng độ acid formic SIM STZ SD SP SM SMX SSA SDM SCP SMM 4,36 2,94 4,08 3,18 4,74 1,56 1,10 5,96 3,21 3,60 0,05 10,4 5,70 5,05 4,63 5,53 3,41 3,39 6,98 5,77 4,13 0,1 9,48 8,78 5,83 5,69 6,62 5,13 5,47 7,11 6,85 4,54 0,15 9,80 6,47 5,70 4,72 6,44 5,13 4,13 5,59 6,88 3,74 0,2 8,99 5,71 4,59 3,80 4,84 3,24 3,10 7,12 5,35 2,76 (%) 1.20E+06 SIM diện tích pic 1.00E+06 STZ SD 8.00E+05 SP 6.00E+05 SM 4.00E+05 SMX SSA 2.00E+05 SDM 0.00E+00 SCP 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 SMM nồng độ acid formic (%) Hình 13: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 48 Nhận xét: Nếu pha động khơng chứa acid formic, cƣờng độ tín hiệu tất SAs thấp Khi tăng nồng độ acid formic từ 0,05 – 0,2%, diện tích pic tăng, nhƣng mức độ tăng SAs khác giá trị pKa chúng khác Khi nồng độ acid formic cao, số lƣợng ion vào buồng ion detector MS tăng, gây cạnh tranh với ion chất phân tích, làm giảm tín hiệu Tất SAs cho tín hiệu cao nồng độ acid formic 0,1% (ngoại trừ SIM cho tín hiệu cao nồng độ 0,05%) Chúng định chọn nồng độ acid formic 0,1% Nồng độ phù hợp với hệ LC/MS/MS Hình 3.10: Sắc đồ SAs nồng độ acid formic 0,15% Tóm lại: Các thơng số tối ưu cho q trình tách sắc ký là: - Cột Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm) - Pha động kênh A (nƣớc chứa 0,1% acid formic); kênh B (acetonitril) theo chƣơng trình gradient: Thời gian (phút) % ACN - 4,6 10,5 10,7 11,7 12 18 20 27 37 100 100 4 Tốc độ dịng: 0,4 ml/phút 49 - Thể tích bơm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: 30oC 3.2 Tối ƣu q trình xử lý mẫu phân tích SAs Có số quy trình đƣợc áp dụng để chiết tách SAs Phổ biến phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng, sử dụng dung môi ACN, etylacetat, n-hexan; phƣơng pháp chiết pha rắn, sử dụng cột chiết silica, HLB… Tuy nhiên, phƣơng pháp phức tạp, sử dụng lƣợng lớn dung môi gây ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời môi trƣờng Hiện nay, QuEChERS phƣơng pháp mới, ban đầu đƣợc ứng dụng để xử lý mẫu phân tích đa dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật Gần đây, đƣợc cải tiến, đƣợc phát triển thẩm định để xử lý mẫu phân tích dƣ lƣợng thuốc thú y (hormone, kháng sinh, chất kích thích tăng trọng…) QuEChERS viết tắt từ Quick (nhanh), Easy (dễ), Cheap (rẻ), Efficient (hiệu quả), Rugged (ổn định) Safe (an toàn) tên đƣợc đặt cho kỹ thuật xử lý mẫu dựa chiết phân tán pha rắn (d-SPE - dispersive Solid Phase Extraction) Phƣơng pháp lần đƣợc Anastassiade cộng phát triển thành công vào năm 2003 để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật rau với mục đích làm cho phƣơng pháp dễ thực tốn Về sau, phƣơng pháp đƣợc thƣơng mại hóa đƣợc gọi tên QuEChERS Ngày nay, QuEChERS tiếp tục đƣợc nghiên cứu để ứng dụng phân tích hợp chất khác nhƣ PAHs môi trƣờng; tồn dƣ kháng sinh, hormon thực phẩm Về nguyên tắc thực hiện, mẫu phân tích đƣợc chiết cách sử dụng phân tán lỏng lỏng với dung môi chiết acetonitril đƣợc acid hóa Dịch chiết sau đƣợc trộn với loại pha rắn đóng vai trị chất hấp phụ tạp chất Dịch mẫu sau loại tạp chất phân tích ln sắc ký khối phổ Trong kỹ thuật QuEChERS, hợp chất PSA (primary secondary amine) đóng vai trị chất hấp phụ quan trọng nhất, ngồi phối hợp thêm hợp chất khác nhằm tăng cƣờng làm cho nhóm đặc biệt Các hợp chất 50 bao gồm: MgSO4 để loại nƣớc dƣ, C18 đƣợc dùng để loại chất béo, bột than chì đƣợc dùng để loại hợp chất hữu dạng phẳng Ngoài ra, pH q trình chiết đƣợc tối ƣu thông qua thay đổi pH dịch chiết ban đầu cách sử dụng hệ đệm phù hợp Ƣu nhƣợc điểm QuEChERS Bản thân tên kỹ thuật nói lên ƣu điểm nó: Nhanh, dễ thực hiện, rẻ tiền, hiệu quả, ổn định an toàn - Nhanh: Việc tối giản bƣớc phân tích rút ngắn nhiều thời gian thực kỹ thuật Tổng thời gian thực xử lý mẫu khoảng 10 phút - Dễ thực hiện: Quy trình đơn giản, bƣớc đƣợc cụ thể hóa khơng có kỹ thuật khó - Rẻ: So với kỹ thuật chiết lỏng - lỏng chiết pha rắn chi phí dành cho QuEChERS thấp nhiều - Hiệu quả: Kết xác nhận hiệu lực phƣơng pháp cho thấy độ độ chụm tốt nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật có chất khác nhau, ứng dụng để xác định nhiều hợp chất lần thực - Ổn định: Phƣơng pháp đƣợc tổ chức tiêu chuẩn quốc tế chấp nhận nhƣ EN, ISO, AOAC - An tồn: Sử dụng dung mơi hữu độc hại hơn, thời gian tiếp xúc ngắn Tuy nhiên, phƣơng pháp có nhƣợc điểm định gây hạn chế ứng dụng phƣơng pháp này: - Kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản khơng thực đƣợc q trình làm giầu mẫu, phải phối hợp với kỹ thuật phân tích đủ mạnh (nhƣ khối phổ) để đảm bảo độ nhạy 51 - Do phân tích nhiều loại hợp chất khác nên thiết bị cần phải có độ phân giải cho đảm bảo đƣợc tính đặc hiệu Kỹ thuật QuEChERS ngày đƣợc phát triển theo nhiều hƣớng khác nhau, nhiều nhà sản xuất thay đổi số điều kiện nhƣ loại dung dịch đệm, bổ sung thêm chấp hấp phụ Dựa sở này, chúng tơi tiến hành khảo sát q trình chiết mẫu theo phƣơng pháp QuEChERS Phƣơng pháp bao gồm bƣớc: - Chiết tách chất phân tích khỏi mẫu đệm muối - Làm phân tán pha rắn dSPE (dispersive SPE) Hệ đệm chiết khối lƣợng pha rắn cần đƣợc nghiên cứu cho qui trình Dự kiến qui trình nhƣ sau: 52 Sơ đồ : Sơ đồ dự kiến chiết SAs Mẫu (5g)/ống ly tâm 50ml + dung môi chiết Lắc, đồng + chất làm khô + đệm chiết Lắc Ly tâm, 6000v/ph, 10oC, 10 phút Phần trên/ống nghiệm 2ml chứa PSA Lắc Ly tâm, 14.000v/ph, 10oC, 10 phút Phần chuyển vào vial 1,8ml Tiêm 10µL vào LC/MS/MS 3.2.1 Khảo sát qui trình chiết Từ qui trình QuEChERS trên, cần phải khảo sát dung môi chiết, đệm chiết lƣợng PSA phù hợp để thu đƣợc mẫu hiệu suất chiết tối ƣu Chúng tiến hành khảo sát số qui trình chiết nhƣ sau: 53 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết SAs Quy trình chiết E1 E2 E3 Dung mơi chiết Đệm chiết Khối lƣợng PSA 15ml ACN Không 200mg Không 200mg 1,5g natri acetat 200mg 1,5g natri acetat 200mg 10ml acid acetic 1% ACN 10ml acid acetic 1% ACN 10ml acid acetic 1% E4 ACN : MeOH (75/25) Sử dụng mẫu thịt lợn không phát SAs Sau cân mẫu, thêm chuẩn hỗn hợp SAs (để thu đƣợc nồng độ 10 ng/ml dịch chiết cuối trƣớc bơm vào máy LC/MS/MS) Để yên phút Tiến hành chiết theo qui trình trên, qui trình làm lặp mẫu tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau: H Ctt 100 (1) Clt Trong đó: H: hiệu suất thu hồi (%) Ctt: Nồng độ thực tế SAs thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) (ng/ml) Clt: Nồng độ lý thuyết SAs tính tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào (10 ng/ml) Sử dụng phần mềm định lƣợng máy, mẫu đƣợc định dạng dạng mẫu “quality control” với nồng độ biết trƣớc 10 ng/ml Phần mềm tự động lập 54 đƣờng chuẩn, tính tốn nồng độ thực mẫu đƣa hiệu suất thu hồi theo cơng thức Hình 3.11: Ảnh hƣởng quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi SIM Tính hiệu suất thu hồi trung bình lần làm lặp, thu đƣợc kết sau: Bảng 3.5: Ảnh hƣởng qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi SAs Quy Hiệu suất thu hồi (%) trình SIM STZ SD SP SM SMX SSA SDM SCP SMM E1 13,7 56,6 50,2 83,5 41,5 58,1 68,3 59,0 55,8 50,0 E2 39,3 105,3 100,2 100,7 96,6 109,0 98,4 103,0 97,6 94,9 E3 28,7 106,0 101,3 105,0 108,0 100,5 91,5 108,0 89,0 96,3 E4 56,7 74,7 69,0 83,6 66,1 63,5 86,0 69,4 71,4 85,1 chiết Nhận xét: Nếu dung môi chiết ACN hiệu suất chiết thấp (13,7 83,5%) Khi thêm acid acetic vào dung môi chiết, hiệu suất chiết tăng lên rõ rệt (39,3 – 109,0%) Điều giải thích: hợp chất nhóm SAs có 55 nhóm –NH2 phân tử Khi thêm H+ vào dung môi chiết, chuyển hợp chất thành dạng NH3+, dễ tan dung dịch Khi thêm thành phần đệm chiết (natri acetate) hiệu suất chiết không bị ảnh hƣởng nhiều Tuy nhiên, dung môi chiết acid acetic ACN SIM bị ảnh hƣởng nhiều nhất, hiệu suất đạt 39,3% Khi bổ sung thêm thành phần MeOH vào dung môi chiết, hiệu suất chiết tất hợp chất SAs đồng đều, thấp (56,786,0%) Cần phải khảo sát thành phần MeOH nồng độ acid dung môi chiết để thu đƣợc hiệu suất chiết cao 3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic dung môi chiết Sử dụng mẫu thịt lợn không phát SAs Sau cân mẫu, thêm chuẩn hỗn hợp SAs (để thu đƣợc nồng độ 10 ng/ml dịch chiết cuối trƣớc bơm vào máy LC/MS/MS) Để yên phút Tiến hành chiết theo qui trình 4, với nồng độ acid acetic: 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5% ACN/MeOH (75/25) Tại nồng độ, làm lặp mẫu Tính tốn tƣơng tự nhƣ công thức (1), thu đƣợc hiệu suất thu hồi trung bình lần làm lặp nhƣ sau: Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs Nồng độ Hiệu suất thu hồi (%) acid acetic SIM STZ SD SP SM SMX SSA SDM SCP SMM 0,05 55,8 56,8 63,8 67,7 62,3 57,3 51,2 58,9 48,5 49,2 0,1 59,7 65,2 70,4 76,7 64,5 63,4 57,8 68,1 55,2 57,1 0,5 72,3 76,3 75,8 63,7 81,7 77,4 65,1 81,3 67,6 69,8 1,0 76,5 85,3 82,7 86,6 84,8 74,5 69,7 85,9 72,4 69,6 1,5 67,7 63,3 95,7 80,8 78,0 87,5 77,0 83,6 83,0 65,1 (%) 56 Hiệu suất thu hồi (%) 120.0 SIM 100.0 STZ 80.0 SD SP 60.0 SM SMX 40.0 SSA 20.0 SDM SCP 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 SMM nồng độ acid acetic (%) Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi SAs Nhận xét: Khi tăng nồng độ acid acetic, hiệu suất thu hồi SAs tăng Tuy nhiên, nồng độ tăng cao (1,5%), số SAs bị ảnh hƣởng, hiệu suất thu hồi giảm xuống (SIM, STZ, SMM) Cũng giống nhƣ việc khảo sát nồng độ acid formic pha động, nồng độ acid acetic cao, nồng độ ion mẫu cao, lƣợng ion vào buồng ion tăng, cạnh tranh với ion chất phân tích, làm giảm tín hiệu Tại nồng độ 1%, hiệu suất thu hồi SAs đồng đạt ≥70% Chúng lựa chọn nồng độ acid acetic 1% nồng độ tối ƣu Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs nồng độ acid acetic 1% 3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH dung môi chiết 57 Nếu thành phần dung môi chiết acid acetic ACN hiệu suất thu hồi SIM bị ảnh hƣởng nhiều Việc thêm MeOH vào thành phần dung môi chiết làm cải thiện đáng kể hiệu suất thu hồi SIM Chúng tiến hành khảo sát thành phần MeOH dung môi chiết để thu đƣợc hiệu suất tốt cho tất SAs Tải FULL (123 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phịng: fb.com/KhoTaiLieuAZ Sử dụng mẫu thịt lợn khơng phát SAs Sau cân mẫu, thêm chuẩn hỗn hợp SAs (để thu đƣợc nồng độ 10 ng/ml dịch chiết cuối trƣớc bơm vào máy LC/MS/MS Để yên phút Tiến hành chiết theo qui trình với tỉ lệ ACN/MeOH lần lƣợt là: 90/10, 80/20, 70/30, 60/40 Tại tỉ lệ, làm lặp mẫu Tính tốn tƣơng tự nhƣ cơng thức (1), thu đƣợc hiệu suất thu hồi trung bình lần làm lặp nhƣ sau: Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs Hiệu suất thu hồi (%) Tỉ lệ ACN/MeOH SIM STZ SD SP SM SMX SSA SDM SCP SMM 92,9 83,6 79,9 82,9 94,5 110 89,8 83,9 83,4 106 101 88,2 89,7 85,7 82,2 99,3 78,1 93,4 65,8 82,9 70, (90/10) 78,2 90,5 88,0 90,8 89, (80/20) 86,8 98,7 101 85,7 74, (70/30) 81,1 98,6 103 79,3 71, (60/40) 79,9 75,6 101 67,8 58 120 SIM hiệu suất thu hồi (%) 100 STZ 80 SD SP 60 SM SMX 40 SSA 20 SDM SCP 0 SMM tỉ lệ MeOH Hình 3.14: Đồ thị ảnh hƣởng nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi SAs Nhận xét: Việc thêm MeOH vào thành phần dung môi chiết làm cho hiệu suất thu hồi SAs đồng hơn, đặc biệt, làm tăng hiệu suất thu hồi SIM Khi thành phần MeOH từ 10 – 30%, hiệu suất thu hồi SAs đạt > 70% (từ 70,7 – 110%) Khi tăng tiếp thành phần MeOH, hầu hết hiệu suất thu hồi số SAs giảm xuống Mặt khác, thành phần MeOH cao làm tăng khả chiết chất gây ảnh hƣởng Do đó, chúng tơi lựa chọn tỉ lệ ACN/MeOH (80/20) điều kiện tối ƣu Tải FULL (123 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ 3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA Pha rắn PSA đóng vai trị hấp thụ chất ảnh hƣởng q trình chiết Chúng tơi tiến hành khảo sát khối lƣợng khác PSA: 50, 100, 150, 200, 250, 300mg Sử dụng dịch chiết tỉ lệ ACN/MeOH (80/20) từ trình khảo sát thành phần MeOH Tính tốn tƣơng tự nhƣ cơng thức (1), thu đƣợc hiệu suất thu hồi sau: Bảng 3.8: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs Khối Hiệu suất thu hồi (%) lƣợng PSA SIM STZ SD SP SM (mg) 59 SMX SSA SDM SCP SMM 50 83,8 90,6 102 90,9 67,4 95,5 98,2 92,8 97,1 86,5 100 80,9 95,9 95,4 91,5 77,1 102 95,1 85,1 104 86,1 150 82,7 106 109 85,3 71,8 98,7 77,5 95,3 97,2 91,5 200 85,4 105 105 108 103 92,9 89,4 81,6 87,3 101 250 60,3 105 109 102 71,9 78,3 79,8 74,6 69 101 hiệu suất thu hồi (%) 120 SIM 100 STZ 80 SD SP 60 SM SMX 40 SSA 20 SDM SCP 0 50 100 150 200 250 300 SMM khối lượng PSA (mg) Hình 3.15: Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi SAs Nhận xét: Tại khối lƣợng PSA từ 50 - 200mg, hiệu suất thu hồi SAs tốt Tuy nhiên, tăng lƣợng PSA lên > 200mg (250mg), hiệu suất thu hồi số SAs bị giảm xuống, SAs bị hấp thụ vào PSA Để hiệu suất thu hồi tốt tăng khả loại tạp chất, lựa chọn khối lƣợng PSA 200mg 60 6732673 ... ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC -MS/ MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chun ngành: Hóa. .. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ phƣơng pháp đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh xác Vì vậy, tiến hành đề tài: ? ?Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ( LC -MS/ MS) xác đinh dư lượng số kháng sinh nhóm. .. khác nhóm kháng sinh phù hợp với tách sắc ký lỏng Do vậy, tiến hành xác định dƣ lƣợng 10 kháng sinh nhóm SAs thịt gia súc gia cầm phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC -MS/ MS) Đây phƣơng pháp đại,