Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ơ ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ơ ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: HDC: TS PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG HDP: PGS.TS TẠ THỊ THẢO Hà Nội - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Tạ Thị Thảo tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu anh chị, bạn cơng tác khoa Hố phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá k22, đặc biệt ngƣời bạn nhóm hố phân tích k22 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Hà Ly MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 01 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 03 1.1.Tổng quan dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………………………… 03 1.1.1 Cây hà thủ ô đỏ…………………………………………………… 03 1.1.2 Dƣợc liệu hà thủ ô đỏ……………………………………………… 04 1.1.2.1 Thành phần hoá học………………………………………… 04 1.1.2.2 Công dụng tác dụng sinh học hà thủ ô đỏ………… 05 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học…………… 07 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu …… 07 1.2.2 Phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu hà thủ ô đỏ ………… 08 1.2.3 Kiểm nghiệm dƣợc liệu hà thủ ô đỏ….…………………………… 11 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu…………………………………… 12 1.4 Các vấn đề cần giải quyết………………………………………………… 13 1.5 Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………… 14 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 15 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………… 15 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị……………………………………………… 16 2.2.1 Chất chuẩn………………………………………………………… 16 2.2.2 Hóa chất…………………………………………………………… 17 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ…………………………………………………… 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu.………… …………………………………… 18 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn mẫu đối chiếu………………… 18 2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………… 18 2.3.3 Phƣơng pháp phân tích…………………………………………… 19 2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu đánh giá phƣơng pháp phân tích………… 21 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho trình phân tích HPLC………………………………………………………………… 21 2.4.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích…………………………………… 22 2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại…………………………… 22 2.4.2.2 Đánh giá độ phƣơng pháp……………………… 22 2.4.3 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………… 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện đo hệ thống sắc ký…………… 24 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu….… 24 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động…………………………………… 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH pha động loại axit dùng pha động……………………………………………………………………… 32 3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 36 3.1.5 Điều kiện tối ƣu cho trình tách anthaquinon stilben…… 38 3.1.6 Định tính hợp chất THSG, RV EM mẫu hà thủ ô đỏ… 38 3.2 Đƣờng chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………… 39 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đƣờng chuẩn…………… 39 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………………… 42 3.2.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………… 43 3.2.3.1 Kiểm tra khác có nghĩa hệ số a giá trị 0… 43 3.2.3.2 Kiểm tra sai khác b b′…………………………… 45 3.3 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………………… 46 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết……………………………………… 47 3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………… 48 3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm…………………………… 48 3.3.2.2 Khảo sát thời gian chiết siêu âm…………………………… 48 3.3.3 Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu……………………………… 49 3.3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết hồi lƣu…………… 49 3.3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết số lần chiết…… 50 3.3.4 Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ…………………… 51 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích………………………………………… 52 3.4.1 Đánh giá độ phƣơng pháp……………………………… 52 3.4.1.1 Đánh giá độ thu hồi phƣơng pháp……………………… 52 3.4.1.2 Đánh giá sai khác giá trị phân tích lại giá trị thêm chuẩn………………………………………………………………… 54 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại…………………………………… 55 3.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị……………………………… 55 3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp phƣơng pháp phân tích……………………………………………… 56 3.5 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………… 58 3.5.1 Mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ………………………………………… 58 3.5.2 Mẫu sản phẩm từ hà thủ ô đỏ……………………………………… 61 BÀN LUẬN…………………………………………………………………… 63 KẾT LUẬN…………………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thông tin mẫu phân tích………………………………………… 16 Bảng 2.2: Chƣơng trình dung mơi rửa giải………………………………………… 21 Bảng 3.1: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nƣớc………………… 27 Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chế độ gradient……………………………………………………………… 27 Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc…………………… 29 Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chế độ gradient……………………………………………………………… 29 Bảng 3.5: Các gradient thử nghiệm với pha động ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric……………………………………………………………………… 31 Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chế độ gradient…………………………………………………… …… 31 Bảng 3.7: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH (axit axetic)……………………… 34 Bảng 3.8: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH (axit fomic)……………… 34 Bảng 3.9: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH (axit photphoric)………… 35 Bảng 3.10: Kết khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột…………… 37 Bảng 3.11: Nồng độ diện tích pic trung bình chất……………………… 40 Bảng 3.12: Phƣơng trình đƣờng chuẩn chất……………………………… 41 Bảng 3.13: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng chất……………… 43 Bảng 3.14: Kết so sánh giá trị a với giá trị phƣơng trình đƣờng chuẩn THSG…………………………………………………………………… 44 Bảng 3.15: Kết so sánh b b′ phƣơng trình đƣờng chuẩn THSG………………………………………………………………………… 45 Bảng 3.16: Kết khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết……………………… 47 Bảng 3.17: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm……………… 48 Bảng 3.18: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm……………… 49 Bảng 3.19: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết hồi lƣu……………… 50 Bảng 3.20: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết số lần chiết……… 51 Bảng 3.21: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích THSG…………………………………………………………………… 54 Bảng 3.22: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích EM……………………………………………………………………… 54 Bảng 3.23: Kết phân tích lặp lại mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thêm chuẩn… 55 Bảng 3.24: Các đại lƣợng thống kê………………………………………………… 55 Bảng 3.25: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất………………… 56 Bảng 3.26: Kết hàm lƣợng THSG EM tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác nhau………………………………………… 56 Bảng 3.27: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba kỹ thuật viên khác nhau……………………………………… 57 Bảng 3.28: Các kiện đánh giá độ tái lặp lại phƣơng pháp phân tích……… 58 Bảng 3.29: Kết phân tích mẫu dƣợc liệu hà thủ đỏ………………………… 59 Bảng 3.30: Kết phân tích mẫu sản phẩm hà thủ ô công ty Traphaco……… 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh hà thủ đỏ……………….……………………………… 03 Hình 1.2: Hình ảnh dƣợc liệu phiến dƣợc liệu hà thủ ô đỏ…………………… 04 Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo số thành phần hóa học dƣợc liệu hà thủ đỏ…………………………………………………………………………………… 05 Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu hà thủ đỏ sản phẩm từ hà thủ đỏ…………… 16 Hình 3.1: Phổ UV-VIS chất……………………………………………… 24 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi MeOH – nƣớc……………………………………………………… 28 Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN – nƣớc………………………………………………………… 30 Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric………………………… 32 Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính THSG, RV, EM mẫu hà thủ đỏ…………… 39 Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……………………………………………………… 40 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn chất………………………………………………… 41 Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) EM (B) mẫu dƣợc liệu hà thủ đỏ………………………………………………………… 60 Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) EM (B) mẫu thuốc T-TPC……………………………………………………………………… 62 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt AC ACN Abs AS BuOH DĐVN DĐTQ EM EtOH GC HPLC HPLC-ESI-MS/MS HPLC-DAD/FLD HPLC-DADAPCI/MSn LOD LOQ MeOH PDA ppm ppb ppt R RS RP-HPLC % RSD % RSDR RV SD tR THSG UV-VIS VWD IR Aceton Acetonitril Absorbance: Độ hấp thụ quang Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic n-Butanol Dƣợc Điển Việt Nam Dƣợc Điển Trung Quốc Emodin Etanol Gas chromatography: Sắc ký khí High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA phát quang Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA khối phổ với hệ ion hóa hóa học áp suất khí Limit of Detection: Giới hạn phát Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng Metanol Photo-diode-array: Mảng điot điện tử Parts per million: Phần triệu Parts per billion: Phần tỷ Parts per trillion: Phần nghìn tỷ Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan Resolution: Độ phân giải Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối Resveratrol Standard deviation: Độ lệch chuẩn Retention time: Thời gian lƣu 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-Glucosid Ultraviolet-Visible: Tử ngoại khả kiến Variable Wavelength Detector Infrared: Hồng ngoại 10 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 3.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị Với hệ máy có độ nhạy cao ổn định lặp lại đóng vai trị quan trọng phân tích Lặp lại tốt cho độ xác tốt, phạm vi cho phép Đối với hệ máy sắc ký, lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho trình tách, yếu tố quan trọng định hiệu phân tích độ lặp thiết bị, bao gồm độ lặp diện tích pic thời gian lƣu Bảng 3.25 độ lặp lại hệ sắc ký chọn diện tích pic thời gian lƣu Dung dịch chuẩn để khảo sát độ lặp có nồng độ chất xấp xỉ 10 ppm Quá trình khảo sát đƣợc thực điều kiện cố định nhƣ sau: + Chƣơng trình rửa giải gradient + Tốc độ dòng: ml/phút + Detector UV-VIS: bƣớc sóng 320 nm 254 nm + Hệ dung môi pha động: ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) + Thể tích mẫu tiêm: 10 µl Mỗi dung dịch đƣợc bơm lần vào cột để xác định độ lặp diện tích pic thời gian lƣu Kết đƣợc biểu diễn bảng 3.25 Bảng 3.25: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất Chất THSG EM S TR S TR Lần 1204667 11,306 694129 24,180 Lần 1204669 11,307 688232 24,189 Lần 1209653 11,329 688207 24,204 Lần 1207764 11,341 701172 24,229 Lần 1207750 11,341 695150 24,233 Lần 1208671 11,345 786748 24,237 Giá trị trung bình 1207196,0 11,33 708939,7 24,21 RSD (%) 0,2 0,01 0,5 0,02 65 Kết cho thấy giá trị RSD < 1% chứng tỏ điều kiện hệ thống sắc ký HPLC lựa chọn ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính định lƣợng THSG, RV EM 3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp phương pháp phân tích Để xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp phân tích, chúng tơi tiến hành đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp Thông thƣờng, trình đánh giá đƣợc thực thiết bị khác cho kỹ thuật viên khác thực phép thử nghiệm (đổi tay kỹ thuật viên) Trong điều kiện phịng thí nghiệm cho phép, lựa chọn phƣơng pháp đổi tay kỹ thuật viên Kết phân tích đƣợc đánh giá dựa vào kết phân tích kỹ thuật viên phép thử nghiệm nhƣ sau: Mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ đƣợc thêm chuẩn 200 ppm THSG 140 ppm EM Mẫu đƣợc xử lý nhƣ mục 3.3.4 phân tích hệ thống HPLC Q trình phân tích đƣợc thực song song với mẫu khơng thêm chuẩn Từ đó, xác định đƣợc nồng độ THSG EM thêm vào dựa phƣơng trình đƣờng chuẩn Mỗi kỹ thuật viên làm lặp lại 10 lần Kết đƣợc thể bảng 3.26 Bảng 3.26: Kết hàm lƣợng THSG EM tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác KTV-1 STT KTV-2 KTV-3 THSG EM THSG EM THSG EM (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) 198,1 140,9 199,1 139,0 195,7 139,8 199,2 137,6 200,0 139,1 197,7 140,7 198,8 139,7 196,6 140,0 199,1 139,0 199,1 139,1 197,8 140,6 195,5 138,0 199,5 139,2 198,1 138,4 196,5 139,2 197,9 138,5 198,2 139,2 199,4 139,2 197,7 139,2 202,0 138,1 198,2 138,1 66 198,1 138,7 198,9 140,2 199,1 139,9 199,9 138,8 198,7 139,0 199,0 140,1 10 201,6 138,0 198,9 141,2 198,0 142,5 Từ kết trên, sử dụng phần mềm minitab 14, thu đƣợc bảng kiện thống kê nhƣ bảng 3.27 Bảng 3.27: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba KTV khác Đại lƣợng đánh giá KTV-1 KTV-2 KTV-3 THSG EM THSG EM THSG EM Xtb 199,0 139,0 199,1 139,5 198,6 139,7 Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) 1,175 0,914 1,310 0,986 1,128 1,311 0,590 0,658 0,607 0,707 0,568 0,938 -0,500 -0,714 -0,450 -0,357 -0,700 -0,214 Độ lệch chuẩn tƣơng đối (% RSD) Sai số tƣơng đối (ER) (%) Phƣơng sai 1,38 0,836 2,05 0,973 2,11 1,72 Nhƣ vậy, vào giá trị % RSD KTV kết luận, phép định lƣợng THSG, độ chụm (hay độ lặp lại) KTV-3 tốt KTV-2 Tuy nhiên, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ ba KTV làm thí nghiệm cho độ chụm (độ lặp lại) tốt Dựa vào sai số tƣơng đối giá trị trung bình tìm đƣợc giá trị μ kết luận kết phân tích ba KTV mắc sai số hệ thống âm Độ đánh giá qua sai số tƣơng đối cho thấy kết phân tích THSG KTV-2 tốt KTV-3 Tuy nhiên, ba giá trị sai số tƣơng đối thấp (< 1%), chứng tỏ KTV làm Nói cách khác, kết phân tích ba KTV xác (độ chụm tốt, độ cao) Từ kết bảng 3.27, chúng tơi tiếp tục tính tốn độ lệch chuẩn tái lặp PTN theo công thức: - Phƣơng sai mẫu (within-sample estimation of variance): 67 k S r = MS within  S j 1 i k k x  x j 1 i - Trung bình tập hợp - Phƣơng sai mẫu (between-sample estimation of variance): k k MS between  - k  ( x j  x) j 1 k 1 Phƣơng sai tái lặp S2R= S2L + S r = MSwithin + MSbetween - Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối %RSDR = 100.SR/ x (%) Dùng công thức trên, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.28 Bảng 3.28: Các kiện đánh giá độ tái lặp phƣơng pháp phân tích Đại lƣợng THSG EM Phƣơng sai mẫu MSwithin 1,85 1,18 Trung bình tập hợp 198,9 139,4 Phƣơng sai mẫu MSbetween 0,21 0,39 Phƣơng sai tái lặp 2,06 1,57 Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối (% RSDR) 0,722 0,899 Nhận xét thấy, giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phƣơng pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích nhiều phịng thí nghiệm khác 3.5 Phân tích mẫu thực tế 3.5.1 Mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Áp dụng điều kiện tối ƣu đƣợc khảo sát, tiến hành phân tích số mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thu hái số vùng khác nhƣ: Sơn La, 68 Quảng Ninh, Hà Giang,… mẫu dƣợc liệu hà thủ ô thị trƣờng (mua phố Lãn Ơng) Tại vùng chúng tơi phân tích 03 mẫu ngẫu nhiên, mẫu đƣợc phân tích lặp lại lần Kết đƣợc trình bày bảng 3.29 hình 3.8 Bảng 3.29: Kết phân tích mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ Mẫu HTO Sơn La HTO Quảng Ninh HTO Cao Bằng Độ ẩm (%) 12,17 8,48 11,72 HTO thị 10,09 trƣờng HTO Hà Giang HTO Lai Châu HTO Hƣng Yên 11,56 12,43 12,00 Khối lƣợng cân (mg) 542,7 555,0 549,8 509,6 514,9 512,2 650,2 659,9 670,0 637,7 601,2 650,9 500,1 505,4 500,9 557,6 540,4 535,9 530,3 531,0 504,9 Diện tích pic (S) trung bình (AU.s) Hàm lƣợng THSG (%)* Hàm lƣợng EM (%)* THSG EM Lặp lại TB Lặp lại 1544524 1623876 1577901 2018593 2112875 2102176 2557014 2557733 2654091 1872588 1819132 1900300 2282463 2267698 2290210 1998654 1890018 1909035 1860021 1889803 1776554 499203 500501 4998921 551234 565672 567301 868542 879032 878365 < LOD < LOD < LOD 1143993 1144402 1142264 621087 604213 613218 439802 447120 399043 2,23 2,29 2,24 2,95 3,05 3,06 3,04 2,99 3,06 2,22 2,29 2,21 3,54 3,52 3,56 2,84 2,82 2,85 2,71 2,74 2,76 2,25 ± 0,01 0,070 0,069 0,069 ± 0,067 0,001 0,079 0,080 0,080 ± 0,081 0,001 0,101 0,105 0,113 ± 0,100 0,005 < LOD < LOD