Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB ) MAKINO[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: HDC: TS PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG HDP: PGS.TS TỪ BÌNH MINH Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Từ Bình Minh tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu anh chị, bạn cơng tác khoa Hố phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu mơi trƣờng với nhiều máy móc, trang thiết bị đại Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy cô môn Hố Phân tích, cho em kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học Hố khóa K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm Hố phân tích khóa K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, tháng 03 năm 2016 Học viên Vũ Văn Tuấn MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 01 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 03 1.1.Tổng quan dƣợc liệu Giảo cổ lam… ………………………………… 03 1.1.1 Đặc điểm thực vật… …………………………………………… 03 1.1.2 Phân bố sinh thái.……………………………………………… 04 1.1.3 Thành phần hóa học Giảo cổ lam……………………………… 05 1.1.4 Công dụng tác dụng sinh học Giảo cổ lam…… ………… 07 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học…………… 08 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu …… 08 1.2.2 Phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu Giảo cổ lam ……… 09 1.2.3 Kiểm nghiệm dƣợc liệu Giảo cổ lam.……………………………… 12 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu…………………………………… 13 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………… 14 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị……………………………………………… 16 2.2.1 Chất chuẩn………………………………………………………… 16 2.2.2 Hóa chất… ……………………………………………………… 16 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ… ……………………………………………… 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu.………… …………………………………… 17 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn………………… ……………… 17 2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu ………………………………………… 17 2.3.3 Phƣơng pháp phân tích…………………………………………… 18 2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu đánh giá phƣơng pháp phân tích………… 19 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích HPLC……….………………………………………………………… 19 2.4.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 19 2.4.3 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………… 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện đo hệ thống sắc ký…………… 22 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu….… 22 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động…………………………………… 24 3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 29 3.1.4 Điều kiện tối ƣu cho trình tách hai hợp chất Rutin 31 Ginsenoside Rb1………………………………………………………… 3.1.5 Định tính hợp chất Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo 31 cổ lam…………………………………………………………………… 3.2 Đƣờng chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………… 32 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đƣờng chuẩn…………… 32 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………………… 34 3.2.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………… 36 3.3 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………………… 39 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết……………………………………… 39 3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………… 40 3.3.3 Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu……………………………… 42 3.3.4 Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam………………… 44 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích………………………………………… 45 3.4.1 Đánh giá độ phƣơng pháp……………………………… 45 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại…………………………………… 48 3.5 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………… 52 BÀN LUẬN…………………………………………………………………… 56 KẾT LUẬN…………………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thơng tin mẫu phân tích………………………………………… 15 Bảng 2.2: Chƣơng trình dung mơi rửa giải………………………………………… 19 Bảng 3.1: Chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH–nƣớc……… 24 Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chƣơng trình gradient………………………………………………………… 25 Bảng 3.3: Các chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động ACN–nƣớc… … 26 Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chƣơng trình gradient……………………………………………………… 26 Bảng 3.5: Chƣơng trình gradient tối ƣu với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric……………… 28 Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric ……………………… …… 28 Bảng 3.7: Kết khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột…………… 30 Bảng 3.8: Nồng độ diện tích pic trung bình chất……………………… 32 Bảng 3.9: Phƣơng trình đƣờng chuẩn chất……………………………… 34 Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng chất……………… 35 Bảng 3.11: Kết so sánh giá trị a với giá trị phƣơng trình đƣờng chuẩn Rutin…………………………………………………………………… 36 Bảng 3.12: Kết so sánh b b′ phƣơng trình đƣờng chuẩn Rutin 38 Bảng 3.13: Kết khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết……………………… 40 Bảng 3.14: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm……………… 41 Bảng 3.15: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm……………… 42 Bảng 3.16: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết hồi lƣu……………… 43 Bảng 3.17: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết số lần chiết……… 44 Bảng 3.18: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích Rutin…………………………………………………………………… 46 Bảng 3.19: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích Ginsenoside Rb1…………………………………………………………………… 46 Bảng 3.20: Kết phân tích lặp lại mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thêm chuẩn… 47 Bảng 3.21: Các đại lƣợng thống kê………………………………………………… 47 Bảng 3.22: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất………………… 48 Bảng 3.23: Kết hàm lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác nhau………….……………… 49 Bảng 3.24: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba kỹ thuật viên khác nhau……………………………………… 50 Bảng 3.25: Các kiện đánh giá độ tái lặp lại phƣơng pháp phân tích……… 51 Bảng 3.26: Kết phân tích mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam……………… ……… 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Dƣợc liệu Giảo cổ lam………………….……………………………… 03 Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo vài saponin flavonoid có Giảo cổ lam ………………………………………………………………………………… 06 Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu Giảo cổ lam sản phẩm trà Giảo cổ lam………… 15 Hình 3.1: Phổ UV-VIS hai hợp chất Rutin Ginsenoside Rb1……… …… 22 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung mơi MeOH–nƣớc……………………………………………………… 25 Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung mơi ACN–nƣớc………………………………………………………… 26 Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC cấu tử ứng với chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric…………… 29 Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo cổ lam 32 Vĩnh Phúc…………………………………………………………… …………… Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……………………………………………………… 33 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn chất………………………………………………… 34 Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam ……………………………………… 54 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt ACN Abs AS EtOH GC HPLC HPLC-ESI-MS/MS HPLC-DAD/FLD HPLC-DADAPCI/MSn LOD LOQ MeOH PDA ppm ppb ppt R RS RP-HPLC % RSD % RSDR SD tR UV-VIS VWD IR Tên đầy đủ Acetonitril Absorbance: Độ hấp thụ quang Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic Etanol Gas chromatography: Sắc ký khí High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA phát quang Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA khối phổ với hệ ion hóa hóa học áp suất khí Limit of Detection: Giới hạn phát Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng Metanol Photo-diode-array: Mảng điot điện tử Parts per million: Phần triệu Parts per billion: Phần tỷ Parts per trillion: Phần nghìn tỷ Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan Resolution: Độ phân giải Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối Standard deviation: Độ lệch chuẩn Retention time: Thời gian lƣu Ultraviolet-Visible: Tử ngoại khả kiến Variable Wavelength Detector Infrared: Hồng ngoại MỞ ĐẦU Theo số liệu thống kê Viện Dƣợc liệu, nƣớc ta có gần 5000 loài thực vật đƣợc ngƣời dân sử dụng y học cổ truyền, y học dân gian, chiếm gần 1/3 tổng số loài thực vật biết Việt Nam Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuốc quý đƣợc ngƣời dân sử dụng việc điều trị bệnh biến chứng tim mạch, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, hạ mỡ máu Uống nƣớc từ thuốc Giảo cổ lam hàng ngày giúp giảm căng thẳng, tăng cƣờng sức khỏe, chống lại q trình lão hóa, hạ đƣờng huyết, bảo vệ tế bào gan, tăng tiết mật, tăng cƣờng chức giải độc cho gan, hỗ trợ điều trị bệnh ung thƣ Thậm chí Nhật Bản Trung Quốc, ngƣời ta coi Giảo cổ lam nhƣ phƣơng thuốc trƣờng sinh Theo nghiên cứu cơng bố hai nhóm hoạt chất có tác dụng Giảo cổ lam flavonoid saponin Nƣớc ta có 05 lồi thuộc chi Gynostemma [3] Các lồi có đặc điểm hình thái giống Các dƣợc liệu khơng phải lồi Gynostemma pentaphyllum đƣợc thƣơng gia gọi với tên "Giảo cổ lam" quảng cáo tác dụng chữa bệnh dƣợc liệu Giảo cổ lam Trên thị trƣờng nay, vị thuốc quý chủ yếu đƣợc bán dƣới dạng túi trà, sản phẩm từ Giảo cổ lam không rõ nguồn gốc đƣợc bày bán nhiều Điều ảnh hƣởng đến hiệu điều trị, sức khỏe quyền lợi ngƣời bệnh mà gây lòng tin ngƣời tiêu dùng sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung Giảo cổ lam nói riêng Ngồi ra, thành phần hóa học, hàm lƣợng hoạt chất Giảo cổ lam vùng có điều kiện thổ nhƣỡng, khí hậu khác khác Đây vấn đề cần phải nghiên cứu Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV (2009) chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam [3] Do đó, việc kiểm soát, đánh giá chất lƣợng mẫu Giảo cổ lam sản phẩm từ dƣợc liệu gặp nhiều khó khăn Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học Giảo cổ lam cơng bố nƣớc dừng mức định tính xác định nhóm chất [9], [10], [12] Các nghiên cứu cơng bố nƣớc ngồi sử dụng kỹ CHƢƠNG II - THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu Giảo cổ lam đƣợc xác định tên khoa học có 02 thành phần Rutin Ginsenoside Rb1 Trong nghiên cứu lựa chọn mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu hái Tam Đảo (Vĩnh Phúc) để tiến hành khảo sát nhằm xây dựng phƣơng pháp phân tích Từ đó, tiếp tục định lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo cổ lam thu hái vùng khác, vùng lấy 03 mẫu để phân tích Ngồi ra, chúng tơi cịn tiến hành phân tích 02 mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu mua thị trƣờng mẫu sản phẩm trà Giảo cổ lam Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh Dƣợc liệu Giảo cổ lam dùng làm mẫu nghiên cứu đƣợc thu hái vùng khác Việt Nam Mẫu đƣợc lấy phần mặt đất Giảo cổ lam Các mẫu thu hái tự nhiên đƣợc xác định tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, họ Bầu bí (Curcubitaceae) chuyên gia thực vật Viện Dƣợc liệu Mẫu thu hái đƣợc rửa sạch, sấy tủ sấy chân không 600C đến khô bảo quản túi nilon kín Các mẫu nghiên cứu đƣợc lƣu giữ Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu Mỗi mẫu phân tích đƣợc lấy đồng đều, nghiền thành bột mịn, kích thƣớc 1mm, đủ dùng cho nghiên cứu Mẫu sản phẩm trà Giảo cổ lam công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh từ dƣợc liệu Giảo cổ lam đƣợc thái nhỏ, sấy khô chuẩn bị cho nghiên cứu (Xem hình 2.1 Bảng 2.1) 14 A B Hình 2.1 Hình ảnh dƣợc liệu Giảo cổ lam (A) sản phẩm trà Giảo cổ lam (B) Bảng 2.1 Thơng tin mẫu phân tích STT Tên mẫu GCL-Vĩnh Phúc GCL Quảng Bình GCL-Hịa Bình GCL-Lào Cai GCL thị trƣờng GCL thị trƣờng GCL-BM Nơi thu Tam Đảo, Vĩnh Phúc Vƣờn Quốc gia Phong Nha–Kẻ Bàng, Quảng Bình Khu bảo tồn thiên nhiên Ngọc Sơn–Ngổ Lng, Hịa Bình Trạm nghiên cứu trồng thuốc Sapa, Viện Dƣợc liệu Chợ Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội Chợ Lãn Ơng, Hồn Kiếm, Hà Nội Cơng ty cổ phần dƣợc phẩm Bình Minh 15 Ngày lấy Độ ẩm mẫu (%) 15/7/2015 11,17 23/10/2015 9,48 18/6/2015 10,72 21/8/2015 11,56 17/8/2015 12,34 17/8/2015 10,09 06/09/2015 6,08 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 2.2.1 Chất chuẩn - Chất chuẩn Ginsenoside Rb1 hãng Shyuanye–Trung Quốc, độ tinh khiết 98,0%; Công thức phân tử: C54H92O3; Khối lƣợng phân tử: 1109,29 ĐvC - Chất chuẩn Rutin hãng Sigma–Aldrich, độ tinh khiết 95,0%; Công thức phân tử: C27H50O16; Khối lƣợng phân tử: 610,52 ĐvC 2.2.2 Hóa chất - Các dung mơi dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nhƣ MeOH, ACN hãng Merck - Axit photphoric (H3PO4) hãng Merck (Đức) - Các dung mơi hóa chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) - Nƣớc cất sử dụng nƣớc cất hai lần đƣợc deion hóa 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ * Thiết bị - Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC–20AD, tiêm mẫu tự động SIL–20AHT, detector UV-VIS, phần mềm Labsolution để điều khiển chƣơng trình, truy xuất hình ảnh số liệu máy HPLC - Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm × 4,6 mm; µm) cột bảo vệ Supelguard Ascentis C18 (20 mm ì 4,0 mm; àm) - Cõn phõn tớch Precisa XT 220A, độ xác 0,0001 g - Máy đo pH MP220K hãng Toledo với điện cực thủy tinh điện cực calomen bão hòa - Máy rung siêu âm, có gia nhiệt hãng Power Sonic 405 - Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) UV 1800 hãng Shimadzu, Nhật Bản * Dụng cụ - Bình cầu đáy có nút nhám, dung tích 100 ml hãng Isolab - Đức 16 - Bình định mức 5, 10, 25, 50 ml, pipetman loại từ 0–100 µl, bình nón 100 ml, cốc thủy tinh loại 25, 50, 100 ml - Tất dụng cụ thủy tinh đƣợc rửa sạch, tráng nƣớc cất, sau tráng axeton, sấy nhiệt độ 60oC vòng trƣớc sử dụng 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn 2.3.1.1 Dung dịch chuẩn gốc Ginsenoside Rb1 (khoảng mg/ml): cân xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn Ginsenoside Rb1, hòa tan 5,00 ml MeOH Các dung dịch chuẩn Ginsenoside Rb1 có nồng độ nhỏ đƣợc chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc MeOH 2.3.1.2 Dung dịch chuẩn Rutin (1mg/ml): chuẩn bị tƣơng tự dung dịch chuẩn gốc Ginsenoside Rb1 2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu Theo nhƣ tính chất biết saponin (Ginsenoside Rb1) flavonoid glycosid (Rutin) tan tốt dung môi hữu nhƣ EtOH, MeOH, hỗn hợp MeOH/nƣớc EtOH/nƣớc Các nghiên cứu định lƣợng Ginsenoside Rb1 Rutin Giảo cổ lam trƣớc sử dụng dung môi MeOH làm dung môi chiết xuất với phƣơng pháp chủ yếu chiết hồi lƣu chiết siêu âm [23], [25], [28], [40] Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát điều kiện chiết xuất nhƣ dung môi chiết, phƣơng pháp chiết suất, thời gian chiết xuất, số lần chiết, từ lựa chọn đƣợc quy trình xử lý mẫu Đối với mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam, khảo sát đƣa phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau: Cân xác khoảng 2,0 g mẫu thử cân phân tích (độ xác 0,0001 gam), chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung mơi MeOH 80% (v/v), thấm ẩm dƣợc liệu 10 phút, cân ghi lại khối lƣợng (m1) Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lƣu đặt nhiệt độ 70oC Tiến hành chiết hồi lƣu 1h Sau để nguội bình cầu nhiệt độ phịng, cân bình cầu bổ sung 17 MeOH 80% đến khối lƣợng ban đầu (m1) Lọc, thu đƣợc dịch chiết mẫu thử (dung dịch A) Lọc dịch chiết qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B) 2.3.3 Phương pháp phân tích Phép phân tích Rutin Ginsenoside Rb1 đƣợc thực hệ sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Shimadzu, điều khiển, lò cột, trộn dung mơi detector UV–VIS Detector phận có vai trò theo dõi, phát chất tan từ cột sắc ký rửa giải Đây phận thu nhận phát hợp chất dựa theo tính chất chất phân tích Trên thực tế, hầu hết chất nghiên cứu hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại UV–VIS, detector UV–VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu Hiện nay, hệ thống Photodiod–Array (PDA) phát triển, chúng có vai trị nhƣ detector UV–VIS nhƣng có khả theo dõi chất nhiều bƣớc sóng khác thời điểm, độ nhạy cao detector UV–VIS Tuy nhiên giá thành detector PDA đắt nhiều so với detector UV– VIS, khơng phải đơn vị kiểm nghiệm, sản xuất trang bị đƣợc Dựa vào điều kiện phịng thí nghiệm nhằm xây dựng phƣơng pháp ứng dụng rộng rãi đơn vị kiểm nghiệm sản xuất, định lựa chọn detector UV–VIS sử dụng chế độ theo dõi bƣớc sóng để thuận lợi cho việc định lƣợng đồng thời hợp chất Cột tách đóng vai trị quan trọng phép tách sắc ký, định hiệu tách trình Để lựa chọn đƣợc pha tĩnh hay cột tách phù hợp nhất, ta phải dựa đặc điểm nhƣ: độ phân cực chất phân tích, pha động, pH định lựa chọn pha tĩnh phù hợp Trong điều kiện phịng thí nghiệm, sử dụng cột tách Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; µm) để tách hợp chất saponin flavonoid Giảo cổ lam, sau tiến hành định lƣợng chúng Các điều kiện phân tích hệ thống HPLC đƣợc tóm tắt nhƣ sau: 18 - Nhiệt độ cột: t0phịng (200C–250C) - Detector UV-VIS: bƣớc sóng 203 nm 257 nm - Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 μl - Pha động gồm kênh Kênh A: pha nƣớc chứa H3PO4 0,01% (pH ≈ 3,3); Kênh B ACN - Chế độ gradient tỷ lệ dung mơi: nhƣ bảng 2.2 Bảng 2.2 Chƣơng trình dung môi rửa giải T (phút) ACN (%) - 10 10 - 20 20 – 25 25 - 30 30 - 40 45 10 - 15 20-30 30 – 30 30-100 100 Stop 2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu đánh giá phƣơng pháp phân tích 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trình phân tích HPLC Thứ khảo sát để chọn hệ dung môi pha động, với hệ dung môi là: MeOH-nƣớc, ACN-nƣớc, ACN- nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) Chế độ chạy gradient đƣợc khảo sát nhiều chƣơng trình khác để chọn đƣợc chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu tách tốt Với tốc độ dòng cố định ml/phút Thể tích mẫu tiêm vào cột đƣợc khảo sát khoảng từ μl đến 50 μl Các kết thu đƣợc ứng với khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh thời gian lƣu chất định phân tích (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic (AS) Phƣơng pháp đánh giá dựa lý thuyết Van Deemter cho 1,5 < RS < 2, 0,9 < AS < 1,2, tR chất phải không lớn nhƣng đảm bảo phải tách xa [21] 2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích 2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại Sau có đầy đủ điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn thu đƣợc 02 phƣơng trình đƣờng chuẩn Đánh giá sai số hệ thống hệ số 19 phƣơng trình hồi quy sử dụng chuẩn Student Fisher để đánh giá kết luận, sau tiến hành phân tích mẫu thực tế Một phƣơng pháp phân tích đƣợc gọi tối ƣu trƣớc tiên phải thể độ lặp lại tốt Trong nghiên cứu này, khảo sát độ lặp lại hệ thiết bị HPLC sau chọn điều kiện tối ƣu, đánh giá độ lặp hệ thiết bị dựa độ lặp diện tích pic thời gian lƣu cấu tử dung dịch khảo sát Dung dịch khảo sát mẫu có nồng độ xác định nằm giới hạn tuyến tính đƣờng chuẩn xây dựng, đƣợc bơm vào hệ sắc ký lần sau lấy diện tích pic thời gian lƣu trung bình lần tính giá trị % RSD Giá trị đánh giá độ lặp cần khảo sát [13] Khi phân tích mẫu thực độ lặp lại tái lặp lại trình xử lý mẫu đƣợc khảo sát đánh giá Để đánh giá độ lặp lại, mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý điều kiện Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm lần để thu đƣợc kết trung bình Các giá trị trung bình đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp phƣơng pháp xử lý mẫu Giá trị % RSD đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp phƣơng pháp xử lý mẫu Để đánh giá độ tái lặp lại, kỹ thuật viên (KTV) khác thực phép phân tích mẫu Các kết thu đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối (% RSDR) 2.4.2.2 Đánh giá độ phương pháp Ngoài độ lặp độ yếu tố để đánh giá phƣơng pháp phân tích Phƣơng pháp thêm chuẩn đƣợc thực để đánh giá độ thu hồi phƣơng pháp xử lý mẫu Mẫu thực đƣợc thêm vào lƣợng định chất chuẩn mức nồng độ cho tổng hàm lƣợng chất phân tích sau xử lý không bị vƣợt đƣờng chuẩn Xử lý mẫu theo quy trình lựa chọn phân tích hệ thống HPLC thu đƣợc hàm lƣợng chất đƣợc thêm vào đánh giá độ thu hồi phƣơng pháp xử lý mẫu Sau đó, tiến hành đánh giá, kiểm tra sai khác khác giá trị phân tích lại giá trị thêm chuẩn Nếu sai khác khơng có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ phƣơng pháp phân tích khơng mắc sai số hệ thống (và ngƣợc lại) 20 2.4.3 Phân tích mẫu thực tế Mẫu thử sau đƣợc xử lý thu đƣợc dung dịch chạy sắc ký HPLC Mỗi mẫu đƣợc phân tích lặp lại lần lấy kết trung bình Hàm lƣợng % Rutin Ginsenoside Rb1 tính theo dƣợc liệu khơ tuyệt đối đƣợc tính theo cơng thức (CT 1): (CT 1) Trong C nồng độ Rutin Ginsenoside Rb1 dung dịch mẫu thử tính theo phƣơng trình hồi quy (ppm); P độ tinh khiết chất chuẩn; V hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử; m khối lƣợng mẫu thử đem phân tích (mg); B độ ẩm mẫu thử (%) 21 CHƢƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tối ƣu hoá điều kiện đo hệ thống sắc ký 3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu Nhóm nghiên cứu tiến hành xác định phổ UV-VIS hai hợp chất đối chiếu Rutin Ginsenoside Rb1 Hình 3.1 biểu diễn phổ UV – VIS chất Hình 3.1 Phổ UV 02 hợp chất Ginsenoside Rb1 Rutin Kết hình 3.1 cho thấy hợp chất Ginsenoside Rb1 có đỉnh hấp thụ cực đại 203,3 nm, hợp chất Rutin có 02 đỉnh hấp thụ cực đại 256,7 nm 353,5 nm Kết hợp với việc tham khảo nghiên cứu trƣớc [28], [40], chúng tơi lựa chọn bƣớc sóng 203 nm để theo dõi, định lƣợng hợp chất Ginsenoside Rb1, lựa chọn bƣớc sóng 257 nm để theo dõi, phát hợp chất Rutin dƣợc liệu Giảo cổ lam 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động Thành phần pha động ảnh hƣởng lớn đến hiệu tách sắc ký Pha động ảnh hƣởng tới vấn đề sau phép tách sắc ký: + Độ chọn lọc hệ pha 22 + Thời gian lƣu trữ chất phân tích + Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef) + Độ phân giải chất pha tĩnh + Độ rộng pic sắc ký Pha động sắc ký lỏng hiệu cao thƣờng nƣớc có trộn với số dung mơi hữu để thu đƣợc dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp với trình tách Căn theo tài liệu số [11] ta có số độ phân cực nƣớc 10,2 đơn vị, MeOH 5,1 đơn vị, từ ta tính đƣợc độ phân cực hệ dung môi chọn ứng với thời điểm trình sắc ký Cơng thức tính độ phân cực là: PI = P1V1+P2V2 (CT 2) Chúng nghiên cứu thử nghiệm hệ dung môi sau: + Hệ dung môi 1: MeOH–nƣớc + Hệ dung môi 2: ACN–nƣớc + Hệ dung môi 3: ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) Đối với trình rửa giải chất khỏi cột, có hai chế độ rửa giải là: + Rửa giải đẳng dòng (isocratic) + Rửa giải gradient Chế độ rửa giải đẳng dòng thƣờng đƣợc sử dụng phân tích chất mẫu có thành phần đơn giản Đối với hỗn hợp có nhiều chất, phân tích HPLC sử dụng chế độ rửa giải đẳng dịng, q trình rửa giải thời gian (thời gian lƣu chất lớn) chất khơng tách khỏi nhau, nên dùng chế độ rửa giải gradient để tách chất khỏi rút ngắn thời gian lƣu chất sau Với mục tiêu đặt luận văn nhằm định tính, định lƣợng chất mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam sản phẩm chế biến từ dƣợc liệu Giảo cổ lam, nên thành phần mẫu thƣờng phức tạp Vì vậy, nghiên cứu này, tiến hành khảo sát để chọn chƣơng trình rửa giải gradient tối ƣu 23 3.1.2.1 Dung môi pha động MeOH–nước Đối với hệ dung môi này, thời gian lƣu cấu tử đƣợc xác định cách bơm hai cấu tử vào hệ thống HPLC Thứ tự khỏi cột là: Rutin → Ginsenoside Rb1 Trên sở đó, chúng tơi khảo sát thu đƣợc kết theo dõi 02 bƣớc sóng cho thấy đƣờng nhiễu, bị dâng, không ổn định Pic 02 hợp chất Ginsenoside Rb1 Rutin không cân đối dẫn tới q trình định lƣợng khơng xác Chúng tơi thử thay đổi số chƣơng trình rửa giải gradient khác để nhằm thay đổi khả tách, nhiên hiệu tách chƣa đƣợc cải thiện Bảng 3.1 cho biết chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH – nƣớc Bảng 3.1 Chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH–nƣớc Gradient Gradient T (phút) MeOH (%) PI (đơn vị) T (phút) MeOH (%) PI (đơn vị) 10 9,69 15 9,44 10 20 9,18 10 20 9,18 15 30 8,67 20 40 8,16 20 40 8,16 25 40 8,16 30 70 6,63 30 60 7,14 40 100 5,10 40 100 5,10 50 Stop 45 Stop Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic cấu tử sắc ký đồ HPLC ứng với chế độ gradient đƣợc thể bảng 3.2 hình 3.2 24 Bảng 3.2 Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic (AS) cấu tử ứng với chƣơng trình gradient Gradient Gradient Tên chất tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS Rutin 14,125 1,358 0,764 11,786 1,831 0,874 Ginsenoside Rb1 25,133 1,684 0,658 20,384 1,634 0,559 Tải FULL (72 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ uV(x100,000) -4.75 uV(x100,000) -4.75 -5.00 -5.00 -5.25 -5.25 -5.50 -5.50 -5.75 -5.75 -6.00 Rutin -6.00 -6.25 -6.25 -6.50 -6.50 Ginsenoside Rb1 -6.75 -6.75 -7.00 -7.00 -7.25 -7.25 -7.50 -7.50 -7.75 -7.75 -8.00 UV-203 nm -8.00 -8.25 -8.25 -8.50 -8.50 -8.75 UV-257 nm -8.75 -9.00 -9.00 -9.25 -9.25 -9.50 -9.50 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 5.0 Gradient 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Gradient Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi MeOH–nƣớc Kết cho thấy, hệ dung môi rửa giải MeOH - nƣớc, hiệu tách chƣa tốt Vì vậy, chúng tơi thay hệ dung mơi khác có hiệu tách tốt Hệ dung môi pha động ACN–nƣớc đƣợc lựa chọn để khảo sát 3.1.2.2 Dung môi pha động ACN–nước Đối với hệ dung môi này, thời gian lƣu cấu tử đƣợc xác định cách bơm hai cấu tử vào hệ thống HPLC Thứ tự hai chất khỏi cột là: 25 Rutin → Ginsenoside Rb1 Các chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi pha động ACN–nƣớc đƣợc biểu diễn bảng 3.3 Bảng 3.3 Các chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động ACN–nƣớc Gradient Gradient Gradient T ACN PI T ACN PI T ACN PI (phút) (%) (đơn vị) (phút) (%) (đơn vị) (phút) (%) (đơn vị) 10 9,76 10 9,76 15 9,37 10 25 9,10 10 15 9,37 10 25 9,10 15 30 8,88 20 30 8,88 15 40 8,44 20 70 7,12 25 30 8,88 25 70 7,12 30 100 5,80 30 100 5,80 30 100 5,80 40 100 5,80 40 100 5,80 40 100 5,80 45 Stop 45 Stop 45 Stop Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic (AS) cấu tử sắc ký đồ HPLC ứng với chế độ gradient đƣợc thể bảng 3.4 Tải FULL (72 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phịng: fb.com/KhoTaiLieuAZ hình 3.3 Bảng 3.4 Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (R) hệ số đối xứng pic (As) cấu tử ứng với chƣơng trình gradient Tên chất Rutin Ginsenoside Rb1 Gradient tR (phút) RS Gradient As tR (phút) RS Gradient As tR (phút) RS As 9,273 2,942 0,954 14,054 2,964 0,768 8,528 1,238 0,889 16,824 3,472 1,677 23,052 3,684 0,884 16,148 1,762 1,112 26 uV(x100,000) uV(x100,000) -4.5 -4.5 -5.0 -5.0 -5.5 Rutin -5.5 Ginsenoside Rb1 -6.0 -6.0 -6.5 -6.5 -7.0 -7.0 -7.5 -7.5 UV-203 nm -8.0 -8.0 -8.5 -8.5 UV-257 nm -9.0 -9.0 -9.5 -9.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 5.0 7.5 10.0 Gradient 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Gradient uV(x100,000) -4.5 -5.0 -5.5 -6.0 -6.5 -7.0 -7.5 -8.0 -8.5 -9.0 -9.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Gradient Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung mơi ACN–nƣớc ACN dung mơi rửa giải có nhiều ƣu điểm so với MeOH Tuy nhiên, kết cho thấy, quan sát 02 bƣớc sóng, đƣờng xấu, pic 02 hợp chất Ginsenoside Rb1 Rutin khơng cân đối, chân pic bị dỗng, điều gây ảnh hƣởng đến kết định lƣợng Chúng tơi thử thay đổi số chƣơng trình gradient nhƣng hiệu tách chƣa đƣợc cải thiện rõ rệt Các nghiên cứu định tính nhƣ định lƣợng hai hợp chất dƣợc liệu Giảo cổ lam công bố sử dụng hệ dung 27 môi ACN–nƣớc chứa axit photphoric làm pha động [28], [40] Tham khảo phƣơng pháp tài liệu trên, tiến hành thử nghiệm với hệ dung môi ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric với số chƣơng trình rửa giải gradient lựa chọn đƣợc chƣơng trình tối ƣu Kết cho thấy, với điều kiện đƣợc lựa chọn pic chuẩn thu đƣợc sắc ký đồ sắc nhọn, cân đối, thời gian lƣu tƣơng đối ngắn Đƣờng sắc ký đồ ổn định quan sát bƣớc sóng Chƣơng trình rửa giải đƣợc biểu diễn bảng 3.5 Bảng 3.5 Chƣơng trình gradient tối ƣu với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric T (phút) 10 20 25 30 40 45 ACN (%) 10 15 30 30 100 100 Stop PI (đơn vị) 9,76 9,37 8,88 8,88 5,80 5,80 Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic (AS) hai cấu tử sắc ký đồ HPLC đƣợc thể bảng 3.6 hình 3.4 Bảng 3.6 Thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS) hệ số đối xứng pic (AS) cấu tử với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric Chất tR (phút) RS As Rutin 14,063 1,977 1,099 Ginsenoside Rb1 23,057 1,785 1,158 28 6734282 ... đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino? ?? với mục tiêu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất Rutin... VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO Chuyên ngành: Hóa phân tích... ngƣời nên dƣợc liệu Giảo cổ lam đƣợc gọi trƣờng sinh [17] Trong nghiên cứu định tính nhƣ định lƣợng dƣợc liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) , hai hợp chất đƣợc lựa chọn làm chất đối chiếu