Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta trong nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán bằng LC-MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DOPING NHÓM CHẸN BETA TRONG NƢỚC TIỂU SỬ DỤNG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN PHÂN TÁN BẰNG LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DOPING NHÓM CHẸN BETA TRONG NƢỚC TIỂU SỬ DỤNG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN PHÂN TÁN BẰNG LC/MS/MS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn : PGS.TS Từ Bình Minh Hướng dẫn : TS Nguyễn Thành Đồng Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Từ Bình Minh tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thành Đồng - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu môi trường đại Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy, giáo giảng dạy khoa Hóa, đặc biệt thầy mơn Hóa Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hóa k25, đặc biệt người bạn nhóm hóa phân tích k25 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn suốt q trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .2 1.1 Giới thiệu chung doping 1.1.1 Định nghĩa doping .2 1.1.2 Các hình thức sử dụng doping 1.1.3 Các chất cấm doping theo quy định WADA .4 1.2 Giới thiệu chất phân tích 1.2.1 Giới thiệu nhóm chẹn beta 1.2.2 Một số tác dụng ảnh hưởng chất chẹn beta 1.3 Tổng quan phương pháp phân tích nhóm chẹn beta nước tiểu 1.3.1 Phương pháp xử lý mẫu phân tích nhóm chẹn beta 1.3.2 Phương pháp phân tích chất nhóm chẹn beta LC/MS/MS .11 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .13 2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 13 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp chiết pha rắn phân tán .13 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (bổ sung tài liệu) 14 2.2.3 Định lượng nhóm chẹn beta LC/MS/MS 17 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.3.1 Thiết bị dụng cụ 19 2.3.2 Hóa chất 19 2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 20 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện vận hành hệ thiết bị LC/MS/MS 21 3.1.1 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện phần khối phổ (MS/MS) 21 3.1.1.1 Lựa chọn phân tách mảnh cho chất nghiên cứu .21 3.1.1.2 Lựa chọn ion (Mother ion) cho chất nghiên cứu 23 3.1.1.3 Lựa chọn ion chuyển hóa hóa (MRM) 24 3.1.1.4 Lựa chọn lượng bắn phá (Collision energy) cho ion chuyển hóa…………………… 34 3.1.2 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện cho phần LC 35 3.1.2.1 Lựa chọn pha động 35 3.1.2.2 Lựa chọn điều kiện nhiệt độ 39 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng trình chuẩn bị mẫu 42 3.2.1 Dự kiến bước tiến hành chuẩn bị mẫu .42 3.2.2 Ảnh hưởng trình thủy phân enzyme 42 3.2.3 Lựa chọn dung môi chiết 44 3.2.4 Ảnh hưởng pH tới trình chiết tách 45 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu 47 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng chất làm 48 3.3 Xây dựng quy trình phân tích 50 3.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 50 3.3.2 Tổng kết quy trình phân tích thiết bị 51 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 52 3.4.1 Khoảng tuyến tính/đường chuẩn 52 3.4.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 53 3.4.3 Độ thu hồi độ lệch chuẩn tương đối 54 3.5 Ứng dụng thử nghiệm phƣơng pháp cho phân tích mẫu nƣớc tiểu vận động viên đội tuyển Taekwondo số giải thi đấu 55 KẾT LUẬN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 61 DANH MỤC BẢNG Bảng Danh mục chất nhóm chẹn beta Bảng Điều kiện xử lý mẫu cho phân tích chất nhóm chẹn beta .9 Bảng Điều kiện phân tích nhóm chẹn beta LC/MS/MS 11 Bảng 4: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao .16 Bảng Điều kiện máy xác định phân tách mảnh chất nghiên cứu .21 Bảng Thế phân tách mảnh thích hợp cho chất nhóm chẹn beta .23 Bảng Lựa chọn ion thích hợp cho chất nhóm chẹn beta .23 Bảng Lựa chọn ion chuyển hố thích hợp cho chất nhóm chẹn beta .33 Bảng Năng lượng bắn phá thích hợp cho nhóm chẹn beta 34 Bảng 10 Các điều kiện cho phần MS .35 Bảng 11 Các chương trình gradient thí nghiệm .36 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ phân giải nhóm chẹn beta 39 Bảng 13: Độ thu hồi sử dụng enzyme trình thuỷ phân .43 Bảng 14 Độ thu hồi, độ lệch chuẩn chất nhóm chẹn beta theo dung môi chiết khác 44 Bảng 15 Độ thu hồi với giá trị pH khác 46 Bảng 16 Độ thu hồi với thể tích mẫu khác .47 Bảng 17 Độ thu hồi sử dụng chất hấp thụ cho công tác chiết mẫu .49 Bảng 18 Các điều kiện cho phần MS chất nghiên cứu .52 Bảng 19 Giới hạn phát giới hạn định lượng nhóm chẹn beta .53 Bảng 20 Độ thu hồi độ lệch chuẩn tương đối chất nhóm chẹn beta .54 Bảng 21 Danh sách tên vận động viên đội tuyển Taekwondo 55 Bảng 22 Kết nhóm chẹn beta mẫu nước tiểu vận động viên 56 DANH MỤC HÌNH Hình Sơ đồ thiết bị HPLC .17 Hình Hệ thống MSMS (Q1, Q3 : mass spectrometer ; q2: collision cell) 18 Hình Thế phân tách mảnh cho Acebutalol 22 Hình Ion chuyển hố cho Acebutalol 24 Hình Ion chuyển hố cho Alprenolol 25 Hình Ion chuyển hoá cho Atenolol .26 Hình Ion chuyển hố cho Betaxolol .27 Hình Ion chuyển hố cho Celiprolol .28 Hình Ion chuyển hoá cho Esmolol 29 Hình 10 Ion chuyển hố cho Labetolol 30 Hình 11 Ion chuyển hố cho Labetolol 31 Hình 12 Ion chuyển hoá cho Metoprolol 32 Hình 13 Ion chuyển hố cho Propranolol .33 Hình 14 Năng lượng bắn phá cho Acebutalol (0 – 30) 34 Hình 15 Sắc đồ phân tách 10 chất chẹn beta 38 Hình 16 Ảnh hưởng nhiệt độ tới cường độ tín hiệu nhóm chẹn beta 41 Hình 17 Ảnh hưởng độ pH tới độ thu hồi chất nhóm chẹn beta 46 Hình 18 Ảnh hưởng thể tích mẫu tới độ thu hồi nhóm chẹn beta .48 Hình 19 Ví dụ đường chuẩn (a) Metoprolol (b) Propranolol .53 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AAS Dispersive SPE ESI EtOAc EPO FBE FID FLD FPD GC GC/MS HPLC LC LC/MS LC/MS/MS LLE LOD LOQ MeOH MeCN MRM MSD MSPD PSA SPE SPME WADA PEPA TBME Anabolic Androgenic Steroids Dispersive Solid Phase Extraction ElectroSpray Ionization Ethylacetate Erythroprotein Fluidized-bed extraction Flame Ionization Detector Fluorescence Detector Flame Photometric Detector Gas Chromatography Gas Chromatography Mass Spectrometry High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography Liquid Chromatography/Mass Spectometry Liquid Chromatography Tandem Mass Spectometry Liquid-Liquid Extraction Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Acetonitrile Multi Reaction Monitoring Mass Spectrometry Detector Matrix Solid Phase Dispersion Primary Secondary Amine Solid Phase Extraction Solid Phase Micro Extraction World Anti-Doping Agency Pentafluoropropionic anhydride Methyl tertiary-butyl ether MỞ ĐẦU Doping tên gọi chung chất kích thích bị cấm thi đấu thể thao Các chất nhìn chung có tác dụng đẩy nhanh tốc độ tuần hoàn máu, tăng cường khối lượng máu chảy tim, làm tăng thể lực tập trung cho vận động viên Do đó, làm tính cơng thi đấu thể thao, mặt khác ảnh hưởng đến sức khỏe vận động viên tác dụng phụ Năm 1999, tổ chức chống doping giới thành lập (gọi tắt WADA- World Anti-Doping Agency) thực nhiệm vụ Việc kiểm tra doping trước sau thi đấu trở thành điều kiện bắt buộc giải thi đấu thể thao Theo danh mục chất cấm 2016 WADA, nhóm chẹn beta nằm nhóm chất bị cấm thi đấu số môn Trong khuôn khổ để chuẩn bị đăng cai ASIAD 2019 Việt Nam Bộ Khoa học Công nghệ giao cho Viện Công Nghệ Môi Trường – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực đề tài độc lập cấp Nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng số phương pháp phát doping nhóm beta blocker steroid nước tiểu” Công việc luận văn phần đề tài giao nói Đề tài: “Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán LC/MS/MS” bước đầu đặt móng cho cơng tác nghiên cứu, phân tích doping Việt Nam CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung doping 1.1.1 Định nghĩa doping Hội thảo châu Âu doping (Uriage, 1963) đưa định nghĩa: "Doping - việc sử dụng chất biện pháp nhằm tăng cách nhân tạo thành tích thể thao, làm tổn hại đến tinh thần thể thao chân đến lành mạnh thể chất, tâm lý đạo đức vận động viên." Ủy ban Olympic Mỹ (USOC) đưa định nghĩa doping: “Việc vận động viên thi đấu, uống, dùng chất lạ thể, chất sinh lý (physiological substance) với liều lượng khơng bình thường, dùng đường khơng bình thường để đưa vào thể với ý định làm tăng cách giả tạo khơng thẳng thành tích thi đấu vận động viên." (MOA/USOC NGB, 1985) Theo Tổ chức chống doping giới (WADA- World Anti-Doping Agency) định nghĩa doping thuật ngữ thể thao vận động viên sử dụng phương pháp để nâng cao thành tích cách khơng trung thực, đưa chất hóa học vào thể Điều gây thành tích vận động viên có khác biệt người có khơng sử dụng doping Sử dụng doping để nâng cao thành tích cá nhân, tập thể diễn từ lâu giới Tuy nhiên, nghiên cứu doping giới bắt đầu tiến hành nhỏ lẻ từ năm 1970 Chỉ tới tổ chức chống doping quốc tế (WADA) đời năm 1999 việc nghiên cứu chống sử dụng doping thể thao đẩy mạnh 1.1.2 Các hình thức sử dụng doping Có nhiều hình thức, cách thức sử dụng doping, nhiên, hình thức sử dụng doping biết đến sau Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 100 - 120 Thế phân tách mảnh cho Levobunolol Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70 70 Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Thế phân tách mảnh cho Metoprolol 71 Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70 Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 72 Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 115 - 145 Thế phân tách mảnh cho Propranolol PHỤ LỤC 2: NĂNG LƢỢNG BẮN PHÁ CHO CÁC CHẤT NHÓM CHẸN BETA Năng lượng bắn phá cho Alprenolol (0 – 30) 73 Năng lượng bắn phá cho Atenolol (5 – 25) Năng lượng bắn phá cho Betaxolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Celiprolol (0 – 30) 74 Năng lượng bắn phá cho Esmolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Labetolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Levobunolol (0 – 30) 75 Năng lượng bắn phá cho Metoprolol (5 – 25) Năng lượng bắn phá cho Propranolol (0 – 30) PHỤ LỤC 3: ẢNH HƢỞNG CỦA PHA ĐỘNG TỚI ĐỘ PHÂN GIẢI CỦA CÁC NHÓM CHẸN BETA 76 Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 77 Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 78 Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 10 79 PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU THẬT a) Sắc đồ dung dịch chuẩn 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 20ng/ml 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 50ng/ml 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 80 7.0 8.0 9.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 100ng/ml 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 200ng/ml Sắc đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn từ 20-500ng/ml b) Sắc đồ mẫu trắng (blank) 81 11.0 12.0 c) Một số sắc đồ mẫu thật 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 9.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 82 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 9.0 10.0 11.0 12.0 9.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đò mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 83 84