Doping là tên gọi chung của các chất kích thích bị cấm trong thi đấu thể thao. Các chất này nhìn chung đều có tác dụng đẩy nhanh tốc độ tuần hoàn máu, tăng cường khối lượng máu chảy về tim, làm tăng thể lực cùng sự tập trung cho các vận động viên. Do đó, làm mất tính công bằng trong thi đấu thể thao, mặt khác cũng ảnh hưởng đến sức khỏe của vận động viên do các tác dụng phụ. Năm 1999, tổ chức chống doping thế giới được thành lập (gọi tắt là WADA World AntiDoping Agency) và thực hiện nhiệm vụ này. Việc kiểm tra doping trước và sau khi thi đấu đã trở thành một điều kiện bắt buộc đối với các giải thi đấu thể thao. Theo danh mục chất cấm 2016 của WADA, nhóm chẹn beta cũng nằm trong nhóm chất bị cấm trong khi thi đấu của một số môn. Trong khuôn khổ để chuẩn bị đăng cai ASIAD 2019 tại Việt Nam. Bộ Khoa học Công nghệ đã giao cho Viện Công Nghệ Môi Trường – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện đề tài độc lập cấp Nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng một số phương pháp phát hiện doping nhóm beta blocker và steroid trong nước tiểu”. Công việc trong luận văn này là một phần trong đề tài được giao nói trên. Đề tài: “Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta trong nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán bằng LCMSMS” bước đầu đặt nền móng cho công tác nghiên cứu, phân tích doping tại Việt Nam.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THẢO Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THẢO Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán LC/MS/MS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn : PGS.TS Từ Bình Minh Hướng dẫn : TS Nguyễn Thành Đồng Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Từ Bình Minh tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thành Đồng - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu môi trường đại Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, giáo giảng dạy khoa Hóa, đặc biệt thầy mơn Hóa Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hóa k25, đặc biệt người bạn nhóm hóa phân tích k25 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn suốt q trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu chung doping 1.1.1.Định nghĩa doping .2 1.1.2.Các hình thức sử dụng doping 1.1.3.Các chất cấm doping theo quy định WADA .4 1.2.Giới thiệu chất phân tích .6 1.2.1.Giới thiệu nhóm chẹn beta 1.2.2.Một số tác dụng ảnh hưởng chất chẹn beta [11] 1.3.Tổng quan phương pháp phân tích nhóm chẹn beta nước tiểu .8 1.3.1.Phương pháp xử lý mẫu phân tích nhóm chẹn beta 1.3.2.Phương pháp phân tích chất nhóm chẹn beta LC/MS/MS 11 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu .12 2.1.3 Nội dung nghiên cứu .12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp chiết pha rắn phân tán .13 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao .14 2.2.3 Định lượng nhóm chẹn beta LC/MS/MS 16 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 18 2.3.1 Thiết bị dụng cụ .18 2.3.2 Hóa chất 18 2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn .19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện vận hành hệ thiết bị LC/MS/MS .20 3.1.1 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện phần khối phổ (MS/MS) 20 3.1.1.1 Lựa chọn phân tách mảnh cho chất nghiên cứu .20 3.1.1.2 Lựa chọn ion (Mother ion) cho chất nghiên cứu 22 3.1.1.3 Lựa chọn ion chuyển hóa hóa (MRM) .23 3.1.1.4 Lựa chọn lượng bắn phá (Collision energy) cho ion chuyển hóa 34 Qua q trình khảo sát điều kiện cho phần khối phổ, điều kiện tối ưu tóm tắt bảng 10 sau: .35 3.1.2 Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện cho phần LC 35 3.1.2.1 Lựa chọn pha động .35 3.1.2.2 Lựa chọn điều kiện nhiệt độ .38 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng trình chuẩn bị mẫu 42 3.2.1 Dự kiến bước tiến hành chuẩn bị mẫu 42 3.2.2 Ảnh hưởng trình thủy phân enzyme 42 3.2.3 Lựa chọn dung môi chiết .44 3.2.4 Ảnh hưởng pH tới trình chiết tách 45 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu 47 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng chất làm 48 3.3 Xây dựng quy trình phân tích 50 Từ kết khảo sát điều kiện tối ưu trên, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình phân tích sau: 50 3.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 50 3.3.2 Tổng kết quy trình phân tích thiết bị 51 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp .52 3.4.1 Khoảng tuyến tính/đường chuẩn 52 3.4.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 53 3.4.3 Độ thu hồi độ lệch chuẩn tương đối 54 3.5 Ứng dụng thử nghiệm phương pháp cho phân tích mẫu nước tiểu vận động viên đội tuyển Taekwondo số giải thi đấu 55 KẾT LUẬN 56 DANH MỤC BẢNG Bảng Danh mục chất nhóm chẹn beta .6 Bảng Điều kiện xử lý mẫu cho phân tích chất nhóm chẹn beta .9 Bảng Điều kiện phân tích nhóm chẹn beta LC/MS/MS 11 Bảng 4: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao 16 Bảng Điều kiện máy xác định phân tách mảnh chất nghiên cứu20 Bảng Thế phân tách mảnh thích hợp cho chất nhóm chẹn beta 22 Bảng Lựa chọn ion thích hợp cho chất nhóm chẹn beta 22 Bảng Lựa chọn ion chuyển hố thích hợp cho chất nhóm chẹn beta 33 Bảng Năng lượng bắn phá thích hợp cho nhóm chẹn beta 34 Bảng 10 Các điều kiện cho phần MS 35 Bảng 11 Các chương trình gradient thí nghiệm .36 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ phân giải nhóm chẹn beta .39 Bảng 13: Độ thu hồi sử dụng enzyme trình thuỷ phân .43 Bảng 14 Độ thu hồi, độ lệch chuẩn chất nhóm chẹn beta theo dung môi chiết khác .44 Bảng 15 Độ thu hồi với giá trị pH khác 46 Bảng 16 Độ thu hồi với thể tích mẫu khác 47 Bảng 17 Độ thu hồi sử dụng chất hấp thụ cho công tác chiết mẫu 49 Bảng 18 Các điều kiện cho phần MS chất nghiên cứu .52 Bảng 19 Giới hạn phát giới hạn định lượng nhóm chẹn beta 53 Bảng 20 Độ thu hồi độ lệch chuẩn tương đối chất nhóm chẹn beta54 Bảng 21 Danh sách tên vận động viên đội tuyển Taekwondo 55 Bảng 22 Kết nhóm chẹn beta mẫu nước tiểu vận động viên 55 DANH MỤC HÌNH Hình Sơ đồ thiết bị HPLC .16 Hình : Hệ thống MSMS (Q1, Q3 : mass spectrometer ; q2: collision cell) 17 Hình Thế phân tách mảnh cho Acebutalol 21 Hình Ion chuyển hố cho Acebutalol .24 Hình Ion chuyển hoá cho Alprenolol .25 Hình Ion chuyển hố cho Atenolol 26 Hình Ion chuyển hoá cho Betaxolol .27 Hình Ion chuyển hố cho Celiprolol .28 Hình Ion chuyển hố cho Esmolol 29 Hình 10 Ion chuyển hoá cho Labetolol .30 Hình 11 Ion chuyển hố cho Labetolol 31 Hình 12 Ion chuyển hoá cho Metoprolol 32 Hình 13 Ion chuyển hố cho Propranolol 33 Hình 14 Năng lượng bắn phá cho Acebutalol (0 – 30) .34 Hình 15 Sắc đồ phân tách 10 chất chẹn beta 38 Hình 16 Ảnh hưởng nhiệt độ tới cường độ tín hiệu nhóm chẹn beta .41 Hình 17 Ảnh hưởng độ pH tới độ thu hồi chất nhóm chẹn beta 46 Hình 18 Ảnh hưởng thể tích mẫu tới độ thu hồi nhóm chẹn beta .48 Hình 19 Ví dụ đường chuẩn (a) Metoprolol (b) Propranolol .53 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AAS Dispersive SPE ESI EtOAc EPO FBE FID FLD FPD GC GC/MS HPLC LC LC/MS LC/MS/MS LLE LOD LOQ MeOH MeCN MRM MSD MSPD PSA SPE SPME WADA PEPA TBME Anabolic Androgenic Steroids Dispersive Solid Phase Extraction ElectroSpray Ionization Ethylacetate Erythroprotein Fluidized-bed extraction Flame Ionization Detector Fluorescence Detector Flame Photometric Detector Gas Chromatography Gas Chromatography Mass Spectrometry High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography Liquid Chromatography/Mass Spectometry Liquid Chromatography Tandem Mass Spectometry Liquid-Liquid Extraction Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Acetonitrile Multi Reaction Monitoring Mass Spectrometry Detector Matrix Solid Phase Dispersion Primary Secondary Amine Solid Phase Extraction Solid Phase Micro Extraction World Anti-Doping Agency Pentafluoropropionic anhydride Methyl tertiary-butyl ether MỞ ĐẦU Doping tên gọi chung chất kích thích bị cấm thi đấu thể thao Các chất nhìn chung có tác dụng đẩy nhanh tốc độ tuần hoàn máu, tăng cường khối lượng máu chảy tim, làm tăng thể lực tập trung cho vận động viên Do đó, làm tính cơng thi đấu thể thao, mặt khác ảnh hưởng đến sức khỏe vận động viên tác dụng phụ Năm 1999, tổ chức chống doping giới thành lập (gọi tắt WADA- World Anti-Doping Agency) thực nhiệm vụ Việc kiểm tra doping trước sau thi đấu trở thành điều kiện bắt buộc giải thi đấu thể thao Theo danh mục chất cấm 2016 WADA, nhóm chẹn beta nằm nhóm chất bị cấm thi đấu số môn Trong khuôn khổ để chuẩn bị đăng cai ASIAD 2019 Việt Nam Bộ Khoa học Công nghệ giao cho Viện Công Nghệ Môi Trường – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực đề tài độc lập cấp Nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng số phương pháp phát doping nhóm beta blocker steroid nước tiểu” Công việc luận văn phần đề tài giao nói Đề tài: “Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán LC/MS/MS” bước đầu đặt móng cho cơng tác nghiên cứu, phân tích doping Việt Nam CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung doping 1.1.1 Định nghĩa doping Hội thảo châu Âu doping (Uriage, 1963) đưa định nghĩa: "Doping - việc sử dụng chất biện pháp nhằm tăng cách nhân tạo thành tích thể thao, làm tổn hại đến tinh thần thể thao chân đến lành mạnh thể chất, tâm lý đạo đức vận động viên." Ủy ban Olympic Mỹ (USOC) đưa định nghĩa doping: “Việc vận động viên thi đấu, uống, dùng chất lạ thể, chất sinh lý (physiological substance) với liều lượng khơng bình thường, dùng đường khơng bình thường để đưa vào thể với ý định làm tăng cách giả tạo khơng thẳng thành tích thi đấu vận động viên." (MOA/USOC NGB, 1985) Theo Tổ chức chống doping giới (WADA- World Anti-Doping Agency) định nghĩa doping thuật ngữ thể thao vận động viên sử dụng phương pháp để nâng cao thành tích cách khơng trung thực, đưa chất hóa học vào thể Điều gây thành tích vận động viên có khác biệt người có khơng sử dụng doping Sử dụng doping để nâng cao thành tích cá nhân, tập thể diễn từ lâu giới Tuy nhiên, nghiên cứu doping giới bắt đầu tiến hành nhỏ lẻ từ năm 1970 Chỉ tới tổ chức chống doping quốc tế (WADA) đời năm 1999 việc nghiên cứu chống sử dụng doping thể thao đẩy mạnh 1.1.2 Các hình thức sử dụng doping Có nhiều hình thức, cách thức sử dụng doping, nhiên, hình thức sử dụng doping biết đến sau Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 105 - 125 Thế phân tách mảnh cho Labetolol 67 Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70 Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 100 - 120 Thế phân tách mảnh cho Levobunolol 68 Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70 Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Thế phân tách mảnh cho Metoprolol 69 Fracmentor voltage = 50 Fracmentor voltage = 70 Fracmentor voltage = 90 Fracmentor voltage = 110 Fracmentor voltage = 130 Fracmentor voltage = 150 Fracmentor voltage = 170 Fracmentor voltage = 115 - 145 Thế phân tách mảnh cho Propranolol PHỤ LỤC 2: NĂNG LƯỢNG BẮN PHÁ CHO CÁC CHẤT NHÓM CHẸN BETA 70 Năng lượng bắn phá cho Alprenolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Atenolol (5 – 25) 71 Năng lượng bắn phá cho Betaxolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Celiprolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Esmolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Labetolol (0 – 30) 72 Năng lượng bắn phá cho Levobunolol (0 – 30) Năng lượng bắn phá cho Metoprolol (5 – 25) Năng lượng bắn phá cho Propranolol (0 – 30) 73 PHỤ LỤC 3: ẢNH HƯỞNG CỦA PHA ĐỘNG TỚI ĐỘ PHÂN GIẢI CỦA CÁC NHÓM CHẸN BETA Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 74 Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 75 Chương trình gradient Chương trình gradient Chương trình gradient 76 Chương trình gradient 10 PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU THẬT a) Sắc đồ dung dịch chuẩn 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 20ng/ml 77 10.0 11.0 12.0 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 10.0 11.0 12.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 50ng/ml 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 100ng/ml 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Sắc đồ dung dịch chuẩn 200ng/ml 78 Sắc đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn từ 20-500ng/ml b) Sắc đồ mẫu trắng (blank) c) Một số sắc đồ mẫu thật 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 79 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 9.0 10.0 11.0 12.0 9.0 10.0 11.0 12.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đò mẫu vận động viên 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 80 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Sắc đồ mẫu vận động viên 81 9.0 10.0 11.0 12.0 ... thông dụng như: kỹ thuật chiết lỏng lỏng, kỹ thuật chiết pha rắn, kỹ thuật vi chiết pha rắn sử dụng rộng rãi nhiều phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, kỹ thuật chiết pha rắn phân tán gần áp dụng thành cơng... tích doping kỹ thuật chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn, chiết MSPD, chiết siêu tới hạn, chiết pha rắn phân tán Điều kiện xử lý mẫu nước tiểu cho phân tích chất nhóm chẹn beta tham... TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THẢO Nghiên cứu xác định doping nhóm chẹn beta nước tiểu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán LC/MS/MS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC