Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Lê Hồng Điệp Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – người thầy kiên nhẫn hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi tới TS Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người ln hỗ trợ giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp quý báu dẫn tận tình TS Nguyễn Anh Vũ suốt q trình tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang tập thể cán Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nơng Nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài cách suôn sẻ thuận lợi Cuối cùng, xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân bạn bè lời cảm ơn thân thương - người ln sát cánh, quan tâm dành cho tơi tình cảm chân thành suốt thời gian học tập hồn thành luận văn ln bên cạnh ủng hộ sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên cao học Đỗ Thị Như Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đậu tương tầm quan trọng đậu tương 1.1.1 Giới thiệu chung đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.2 Vai trò đậu tương đời sống người 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Thế giới Việt Nam 1.2 Cơ chế chống chịu yếu tố phi sinh học thực vật 10 1.3 Đặc tính chịu hạn số gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương 12 1.3.1 Đặc tính chịu hạn đậu tương 12 1.3.2 Các gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương 13 1.4 Gen GmGLP1 14 1.5 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 15 1.5.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15 1.5.2 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen 18 1.5.3 Phương pháp chuyển gen xung điện 18 1.5.4 Phương pháp chuyển gen qua ống phấn 19 1.6 Nguồn gốc đặc tính sinh học giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 20 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Vật liệu 22 2.2.2 Hóa chất môi trường 23 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 23 2.2.4 Trình tự mồi enzyme cắt giới hạn sử dụng nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 24 2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu 26 2.3.3 Phương pháp nhân trình tự ADN kỹ thuật PCR 27 2.3.4 Phương pháp gel tinh sản phẩm PCR 28 2.3.5 Phương pháp lai Southern blot 29 2.4 Các tiêu chí đánh giá 31 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 32 3.1.1 Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu 32 3.1.2 Khả tái sinh tạo đa chồi 33 3.1.3 Khả tái sinh rễ tạo hoàn chỉnh 35 3.2.2 Kiểm tra có mặt gen cần chuyển GmGLP1 kỹ thuật PCR 38 3.3 Phân tích chuyển gen hệ T1 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 60 DANH MỤC BẢNG Bảng Tình hình sản xuất đậu tương Thế giới năm gần Bảng Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu Thế giới năm gần Bảng Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng thí nghiệm 24 Bảng5 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 28 Bảng Thành phần phản ứng cắt giới hạn enzyme Bam HI 30 Bảng8 Kết khảo sát tỷ lệ mầm giống đậu tương 33 ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 33 Bảng Khả phát sinh chồi giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày 34 Bảng 10 Khả sống sót sau chọn lọc khả kéo dài chồi giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 35 Bảng 11 Sự phát sinh rễ tái sinh hoàn chỉnh 36 Bảng 12 Cây tái sinh hồn chỉnh sống sót phát triển mơi trường ngồi 36 Bảng 13 Tỷ lệ sống sót sau phun basta 38 Bảng 14 Thống kê số T0 sinh trưởng phát triển tốt sau phun basta dương tính với PCR 41 Bảng 15 Phân tích T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 15:1 43 Bảng 16 Kết phân tích chuyển gen T1 47 DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế chống chịu thực vật với stress 12 Hình Hạt đậu tương giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 sử dụng thí nghiệm 22 Hình Cấu trúc vector biểu gen GmGLP1 vector pZY101Asc 23 Hình Quy trình chuyển gen đậu tương thơng qua vi khuẩn A tumefaciens 37 Hình Cây phản ứng với Basta sau ngày phun 37 Hình 6a Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số T0 giống ĐT22 38 Hình 6b Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số T0 giống đậu tương ĐT26 DT84 39 Hình Ảnh điện di DNA tổng số đậu tương chuyển gen giống ĐT22 hệ T0 39 Hình 7a Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tương ĐT22 chuyển gen hệ T0 40 Hình 7b Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tương ĐT26 DT84 chuyển gen hệ T0 40 Hình Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 đậu tương ĐT22, ĐT26 DT84 chuyển gen hệ T0 40 Hình Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 hệ T0 42 Hình Hạt đậu tương chuyển gen giống ĐT22 hệ T0 42 Hình 10 Phản ứng chuyển gen hệ T1 với Basta 43 Hình 11 DNA tổng số T1sống sót sau phun Basta 44 Hình 12 PCR kiểm tra có mặt gen GmGLP1 T1 45 Hình 13 Kết lai Southern Blot 46 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy Cs Cộng dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tương ĐT22 ĐT26 Giống đậu tương ĐT26 DT84 Giống đậu tương DT84 ĐVN9 Giống đậu tương ĐVN9 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic GA3 Gibberelic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt GmGLP1 Glycine max Germin – like protein IBA Indole-3-butyric acid Kb Kilo base OD Optical density PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trường rễ SDS Sodium dodecysulfat SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi T0 Cây chuyển gen T1 Cây chuyển gen thệ thứ TAE Tris – acetate – EDTA v/p vòng/phút YEP Yeast extract peptone MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay gọi đậu nành công nghiệp ngắn ngày có hiệu kinh tế giá trị dinh dưỡng cao Đậu tương trồng lấy hạt, cho dầu quan trọng bậc giới, đứng hàng thứ sau lúa mì, lúa nước ngơ Do có khả thích ứng rộng nên đậu tương trồng khắp châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ - chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến Châu Á – 18,54% [85] Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tương mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu tương khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn [8] Tuy nhiên, giới phải đối mặt với tượng biến đổi khí hậu, nhiệt năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán Mức độ hạn hán thường khó dự đốn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất phân bố lượng mưa, mức độ nước bay hơi, khả giữ nước đất [76, 29] Theo Boyer (1982) [13], hạn hán yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn đến suất trồng toàn giới, đồng thời hạn hán có khả tác động lên nhiều giai đoạn phát triển khác trồng nói chung đậu tương nói riêng [29] Bởi ấm lên khí hậu tồn cầu, nhu cầu thực phẩm tăng ngày cao áp lực gia tăng dân số, tần suất ảnh hưởng hạn hán trở nên rõ rệt [68, 63, 22] Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển giống trồng có khả thích ứng, chống chịu tốt điều kiện hạn hán mục tiêu hàng đầu nhà khoa học giới nhà khoa học Việt Nam Các nghiên cứu trước chế phân tử tính trạng chịu hạn thực vật kiểm soát nhiều gen chia làm hai nhóm nhóm gen điều hịa nhóm gen chức [38, 61, 11] Trong nhóm gen chức họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trị thiết yếu tiềm chịu hạn Ở đậu tương, họ gen GmGLP biết đến gồm 21 gen [45], GLPs biết đến với khả SOD, POD hoạt tính enzyme chống oxi hóa Nhờ đóng vai trị quan trọng việc thể khả chống chịu trồng với điều kiện bất lợi Ở đậu tương, gen mã hóa cho protein đặt tên Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase Việc nghiên cứu sử dụng hệ thống gen chống chịu với điều kiện bất lợi việc chọn tạo giống trồng biến đổi gen có khả kháng hạn tâm điểm hàng loạt phịng thí nghiệm toàn giới Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen GmGLP1 vào đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào giống đậu tương Việt Nam: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Yêu cầu nghiên cứu Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào bốn giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Phân tích chuyển gen hệ T0 T1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Giống đậu tương ĐT22 có khả tái sinh cụm chồi (51,07 %) cao có tiềm tiếp nhận gen GmGLP1 tốt giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 sử dụng nghiên cứu Trong giống đậu tương nghiên cứu: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 tạo chuyển gen mang gen GmGLP1 giống đậu tương: ĐT22, ĐT26 DT84 Dựa vào kết phân tích PCR chuyển gen hệ T0, thu tần suất biến nạp giống đậu tương sau ĐT22: 0,93%; ĐT26: 0,27% DT84: 0,13% Phân tích đánh giá ổn định di truyền giống đậu tương ĐT22 hệ T1 phương pháp phun Basta phương pháp phân tích Southern blot KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tìm dòng giống đậu tương ĐT22 mang gen GmGLP1 Đánh giá khả kháng hạn ổn định di truyền dòng đậu tương ĐT22 mang gen GmGLP1 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Văn Điền (2007), Giáo trình Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Hữu Kiên (2012)“Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam, (39), tr 119 – 124 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả kháng hạn kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22”,Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam, 11, tr – Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa nhân gen dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam", Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khoa học sống, Đại học Y Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 18, tr – 14 Nguyễn Huy Hoàng (1992) “Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để rao dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc việt nam” Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội Tổng cục thống kê (2013), Niên giám thống kê 2012, NXB Thống kê, Hà Nội 50 Tài liệu tiếng Anh Akwatulira F., Gwali S., Okullo J.B.L., Ssegawa P., Tumwebaze S B., Mbwambo J R., Muchugi A (2001), “Influence of rooting media and indole-3butyric acid (IBA) concentration on rooting and shoot formation of Warburgia ugandensis stem cuttings”, African Journal of Plant Science, 5(8), pp 421-429 10 Banerjee J, Maiti M K (2010), “Functional role of rice germin-like protein1 in regulation of plant height and disease resistance”,Biochemical and Biophysical Research Communications, 394(1), pp 178-183 11 Bartels D., Sunkar R (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”,Critical Reviews in Plant Sciences,24(1), pp 23-58 12 Birch R.G (1997), “ Plant Transformation: Problems and Strategies for Practical Application”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 48, pp 297-326 13 Boyer J.S (1982), “Plant productivity and environment”, Science, 218(4571), pp 443–448 14 Chaves M.M., Costa J.M., Saibo N.J.M (2011), “Recent Advances in Photosynthesis Under Drought and Salinity”, Advances in Botanical Research, 57, pp 50-83 15 Chee, P P., Fober K A., Slightom J L (1989), “Transformation of Soybean (Glycine max)by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiology,91(3), pp 1212-1218 16 Chen M., Wang Q Y., Cheng X G., Xu Z S., Li L C., Ye X G., Xia L Q., Ma Y Z (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and Biophysical Research Communiction,353(2), pp.299-305 17 Chen W S., Chiu C C., Liu H Y., Lee T L., Cheng J T., Lin C C., Wu Y J., Chang H Y (1998), “Gen transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon”,Biochemistry and Molecular Biology International,46(6), pp 12011209 51 18 Chowrira, G M., Akella V., Lurquin, P.F (1995), “Electroporation-mediated gen transfer into intact nodal meristems in planta Genrating transgenic plants without in vitro tissue culture”,Molecular Biotechnology,3(1), pp 17-23 19 Christou P., Murphy J E., Swain W F (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus”,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84(12), pp 3962-3966 20 Chumakov M.I., Rozhok N A., Velikov V.A., Tyrnov V.S., Volokhina I.V (2006), “Agrobacterium-mediated in Planta Transformation of Maize via Pistil Filaments”,Russian Journal of Gentics,42(8), pp 893-897 21 Cleene M D., Ley J D (1976), “The host range of crown gall”,Botanical Review, 42(4), pp 389-466 22 Cook E.R., Seager R., Cane M.A., Stahle D.W (2007), “North American drought: reconstructions, causes, and consequences”,Earth-Science Reviews, 81, pp 93-134 23 de Ronde J A., Laurie R N., Caetano T., Grayling M M., Kerepesi I.(2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica, 138, pp.123-132 24 Delauney A J.,Verma D P.(1990), “A soybean gen encoding delta 1pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated”,Molecular &Genral Gentics,221(3), pp 299-305 25 Delzer B W., Somer D.A., Orf J.H (1990), “Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regenration of 10 soybean genotypes in maturity group 00 to II”, Crop Science, 30(2), pp 320-322 26 Di R., Purcell V., Collins G.B., Ghabrial S.A (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gen” Plant Cell Reports, 15, pp 746-750 52 27 Doyle J.J., Doyle J.L (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp 11-15 28 Duan X L., Chen S B (1985), “Variation occurring by introduction of the exogenous DNA into rice” Scientia Sinica Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan, 18, pp 6-10 29 Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A (2009),“Plant drought stress: effects, mechanisms anh management”,Agronomy for Sustainable Development,29(1), pp 185-212 30 Fromm M., Taylor L.P., Walbot V (1985), “Expression of gen transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation”,Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,82(17), pp 5824-5828 31 Hadi M Z., McMullen M.D., Finer, J.J (1996), “Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment”,Plant Cell Reports,15, pp 500-505 32 Hansen G., Das A., Chilton M.D (1994), “Constitutive expression of the virulence gens improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,91(16), pp 7603-7607 33 Hood E E., Helmer G L., Fraley R T., Chilton M D (1986), “The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciensA281 is encoded in a region of pTiBo542 outsite of T-DNA”, Journal of Bacteriology, 168(3), pp.1291-1301 34 Hooykaas P.J J., Schilperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant gentic engineering”, Plant Molecular Biology,19, pp.15-38 35 Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A G M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens”,Annual Reviewof Phytopathology, 32, pp 157-179 36 Hu C Y., Wang L (1999), “In planta soybean transformation technologies developed in China: Procedure, comfirmation and field performance”, In Vitro Cell &Developmental Biology,35(5), pp 417-420 53 37 Hymowitz T., Newell C A (1981), “Taxonomy of the Genus Glycine Domestication and Uses of Soybeans”, Economic Botany, 35(3), pp.272-288 38 Ingram J., Bartels D., (1996),“The molecular basis of dehydration tolerance in plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,47, pp 377-403 39 Jorgensen R.A., Cluster P.D., English J., Que Q., Napoli C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs antisense constructs and single-copy vs complex T-DNA sequences”, Plant Molecular Biology, 31(5), pp 957-973 40 Ke Y., Han G., He H., Li J (2009), “Differential regulation of proteins and phosphoproteins in rice under drought stress.” Biochemical and biophysical research communications, 379 (1), pp 133 – 138 41 Knecht K., Seyffarth M., Desel C., Thurau T., Sherameti I., Lou B., Oelmullier R., Cal D (2010), “Expression of BvGLP-1 Encoding a Germin-Like Protein from Sugar Beet in Arabidopsis thaliana Leads to Resistance Against Phytopathogenic Fungi”,Molecular Plant-Microbe interaction, 23(4), pp 446-457 42 Lata C., Prasad M (2011), “Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants”,Journal of Experimental Botany, 62(14), pp 4731-4748 43 Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A (2002), “Soybean Transformation via the Pollen Tube Pathway”, Soybean Gentics Newsletter, 29, pp 1-11 44 Liu DP, Yuan Y, and Sun H (1992), “A study of exogenous DNA introduction into cultivated soybean In: Zhou GY, Chen SB, and Hu JQ (eds), Advances in Molecular Breeding Research of Agriculture”, China Agri Sci Tech Press, pp 134 – 140 45 Lu M, Han Y., Gao J., Wang X., Li W (2010), “Identification and analysis of the germin-like gen family in soybean”,BMC genomics, 11, pp 620 54 46 McCabe D E., Swain W.F., Martinell B J., Christou, P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration”, Bio/Technology, 6,pp 923-926 47 Mello-Farias, P C., Chaves, A L S (2008), “Advances in Agrobacterium– mediated plant transformation with Emphasis on soybean”, Sci Agric (piracicaba, Braz), 65(1), pp 95-106 48 Meurer C A., Dinkins R D., Collins G B (1998), “Factors affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18(3-4), pp 180186 49 Nguyen HT, Babu RCBlum, A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular gentics considerations:, Crop Sci, 37, 1426 – 1434 50 Ni W C., Zhang Z L., Guo S D (1998), “Development of transgenic insectresistant cotton plants”,Scientia Sinica Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan,31, pp 8-13 51 Olhoft P M., Flagel L E., Donovan C M., Somers D A.(2003),“Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”,Planta, 216(5), pp 723-735 52 Olhoft P M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N C., Somers D A (2001), “The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports,20, 731-737 53 Olhoft P M., Somers D A (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-nodes cells”, Plant Cell Reports, 20(8), 706-711 54 Parrott W A., Hoffman L M., Hildebrand D.F., Williams E G., Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformants of soybean”, Plant Cell Reports, 7(8), pp 201-204 55 Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K B and Wang K (2004) “Assessment of conditions affecting Agrobacterium – mediated soybean 55 transformation using the cotyledonary node explant” , Euphytica, 136, pp: 167 – 169 56 Paz, M M., Guo H., Zhang Z., Banerjee Z., Wang A K., Kan (2004),“Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”,Euphytica 136, pp 167-179 57 Paz, M M., Martinez, J C., Kalvig A B., Fonger T M., Wang K (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp 206-213 58 PazM M., Martinez J C., Kalviq A B., Fonger T M., Wang K (2006), “Improve cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp 206-213 59 Pederson, H.C., Christiansen, J., Wyndaele, R (1983), “Induction and in vitro culture of soybean crown gall tumors”,Plant Cell Reports, 2(24), pp 201-204 60 Perl A., Lotan O., Abu-Abied M., Holland D (1996), “Establishment of an Agrobacterium–mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of antioxidants during grape–Agrobacterium interactions” Nature Biotechnology,14(5), pp 624-628 61 Ramanjulu S., Bartels D., (2002),“Drought- and desiccation-induced modulation of gen expression in plants”, Plant cell& Environment, 25(2), pp.141151 62 Rietz S., Bernsdorff F E M., Cai D (2012),“Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidates for the initiation of an oxidative burst that impedes pathogensis of Sclerotinia sclerotiorum”, Journal of experimental botany, 63(15), pp 5507-5519 63 Salinger M.J., Sivakumar M.V.K., Motha R (2005),“Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary and recommendations”, Climatic Change 70, pp 341-362 56 64 Sambrook, J., Russell, D (2001) Molecular Cloning, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 65 Santarem E.A., Pelissier B., Fimer, J.J (1997), “Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos”, Invitro Cellular and Development Biology – Plant, 33(1), pp 13-19 66 Schmidt M A., Lafayette P R., Artelt B A., Parrott W A (2008), “A comparison of strategies for transformation with multiple gens via microprojectilemediated bombardment”,In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44, pp 162-168 67 Shou H., Palmer R G., Wang K (2002), “Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology Reporter,20, pp 325-334 68 Somerville C., Briscoe J., (2001),“Gentic Engineering and Water”, Science, 292 (5525), pp 2217 69 Southern E.M (1975),“Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of Molecular Biology, 98(3), pp 503-517 70 Stachel S.E., Messens E., Montagu M.V., Zambryski P (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which activate the T-DNA transfer process in Agrobacterium tumefaciens”, Nature, 318, pp 624-629 71 Tinland B., Hohn B., (1995), “Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome”, Gentic Engineering, 17, pp 209-229 72 Tran Thi Cuc Hoa (2008),“Efficiency of developing transgenic soybean from the varieties MTĐ 176, HL 202, Maverick and Williams 82 by cotyledonary-node method using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”, Science & Technology Journal of Agriculture and Rural Development, 1, pp.14-19 57 73 Trejgell A., Chernetskyy M., Podlasiak J., Tretyn A (2013), “An efficient system for regenrating Taraxacum pieninicum Pawl from seedling explants”,Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 55(1), pp 73-79 74 Trick H.N., Finer J.J (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation”, Transgenic Research, pp 329-337 75 Versulues P.E., Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Zhu J., Zhu J.K (2006) “Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status”,The Plant Journal for cell and molecular biology, ;45(4), pp 523-539 76 Wery J., Silim S.N., Knights E.J., Malhotra R.S., CousinR.(1994),:Screening techniques and sources of tolerance to extremes of moisture and air temperature in cool season food legumes”,Euphytica,73(1-2), pp 73-83 77 Xue R., Xie H., Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnology Letters,28, pp 1551-1557 78 Yong Z., Bao-Yu Y., Shi-Yun C (2006), “Inheritance Analysis of HerbicideResistant Transgenic Soybean Lines”, Acta Gentica Sinica, 33(12), pp 1105-1111 79 Yu H.X., Liu J.J., Feng Z.L., Dong J.D (1999), “Study on Introduction of Vermin-Resistance Gen (CpTI) into Wheat through Pollen-Tube Pathway Method”, Shandong Agricultural Sciences,1990-01 80 Zambryski, P (1998), “Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells”, Annual Review Gentics, 22, pp 1-30 81 Zhang et al (2004), An improved Agrobacterium-mediated soybeantransformation procedure Improved from, Plant Cell Reports 22:478-482 82 Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T.E (1999),“The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean”,Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56, pp 37-46 83 Zhen J.Z., Wu Y.X., Wang D.J., Zhang J., Ma Z.R., Zhou Z.Y (1998), “The exploration of the mechanism and gentic performance of the progenies gained from pollen-tube pathway transformation”, Sci Bull 43, pp 561-566 58 84 Zhou G., Weng J., Zhen Y., Huang J., Qian S., Liu G (1983), “Introduction of exogenous DNA into cotton embryos”, Methods in enzymology, 101, pp 433481 Trang web 85 FAOSTAT (2012), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/home/E 86 United States Department http://www.usda.gov/wps/portal/usda/usdahome 59 of Agriculture (2014), PHỤ LỤC Phụ lục 1:Thành phần môi trường GM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10x 100 ml B5 minor salt 100x 10 ml Ferrous-NaEDTA 100x 10 ml Glucozo 2% 20 gam Bổ sung PhytagelTM gam B5 vitamin 500x 2ml Chuẩn pH = 5.8 với KOH 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 2: Thành phần môi trường YEP STT Thành phần Hàm lượng cho lít Bacto – pepton 10 gam Yeast – extract gam NaCl gam Agar (đối với môi trường đặc) 12 gam Chuẩn pH = với NaCl 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 3: Thành phần môi trường đồng nuôi cấy CCM STT 10 11 12 13 14 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 10 ml B5 minor salt 100X ml Ferrous-NaEDTA 100X ml Glucozo 3% 30 gam MES 20mM 3,9 gam Acetosyringone 40 mg/ml ml B5 vitamin 500X ml GA3 mg/ml 0,25 ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml L-cysteine 25 mg/ml 16 ml DTT 154 mg/ml ml Na-thiosulfate 158 mg/ml ml Agar washed 0,5% gam Chuẩn pH = 5,4 với KOH 5M, khử trùng 20 phút 60 Phụ lục 4: Thành phần môi trường SIM STT 10 11 12 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 100 ml B5 minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500X ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml Cefotaxime 200 mg/ml ml Vancomycin mg/ml 10 ml Glufosinate 10 mg/l ml TM Phytagel gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 5: Thành phần môi trường SEM STT 10 11 12 13 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít MS major salt 10X 100 ml MS minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500 X ml Asp/Glu 25 mg/ml ml IAA mg/ml 0,1 ml GA3 mg/ml 0,5 ml Cefotaxime 20 mg/ml ml Glufosinate mg/l 0,3 ml TM Phytagel gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 6: Thành phần môi trường RM STT Thành phần MS major salt MS minor salt Ferrous-NaEDTA Glucozo MES B5 vitamin Nồng độ 10X 100X 100X 2% mM 500X 61 Hàm lượng lít 100 ml 10 ml 10 ml 20 gam 0,6 gam ml Asp/Glu 25 mg/ml ml Cefotaxime 200 mg/ml 0,5 ml Vancomycin mg/ml 10 ml PhytagelTM gam Chuẩn pH = 5,6 dùng KOH 1M, khử trùng 20 phút 10 11 Phụ lục 7: Thành phần CTAB STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng 100ml CTAB gam Tris-HCl 8,0 1M 10 ml NaCl 5M 14 ml EDTA 8,0 0,5 M ml BME (mecraptoethanol) 14 M 1,5 ml Chuẩn thể tích V=100ml nước cất, khử trùng 20 phút Phụ lục 8: Hóa chất làm Southern Blot Phụ lục 8.1 Thành phần SSC 20x STT Thành phần Natri clorua Natri citrate Nồng độ 3M 0,3 M Hàm lượng lít 175,32 gram 88,23 gram Phụ lục 8.2 Thành phần dung dịch Neutralisation STT Thành phần Tris – HCl NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,5 M 78,8 gram 3M 175,32 gram Chuẩn pH = 7,5 sử dụng NaOH Phụ lục 8.3 Thành phần dung dịch Denaturalize STT Thành phần NaCl NaOH Nồng độ 1,5 M 0,5 M Hàm lượng lít 87,66 gram 20 gram Phụ lục 8.4 Thành phần Acid Maleic STT Thành phần Maleic acid NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,1 M 11,6 gram 0,15 M 8,77 gram Chuẩn pH = 7,5 sử dụng NaOH 62 Phụ lục 8.5 Thành phần Detection STT Thành phần Tris – HCl NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,1 M 15,76 gram 0,1 M 5,84 gram Chuẩn pH = 9,5 sử dụng NaOH 63