Nghiên cứu sản xuất hydro sinh học từ rác thải nông nghiệp nhờ chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359 : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 07

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Huyền NGHIÊN CƢ́U QUÁ TRÌ NH SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TƢ̀ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP NHỜ CHỦ NG VI KHUẨN KI ̣ KHÍ ƢA NHIỆT Thermotoga neapolitana DSM 4359 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Huyền NGHIÊN CƢ́U QUÁ TRÌ NH SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TƢ̀ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP NHỜ CHỦ NG VI KHUẨN KI ̣ KHÍ ƢA NHIỆT Thermotoga Neapolitana DSM 4359 Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - Năm 2014 MỤC LỤC CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 01 03 1.1 Thực trạng nguồn lƣợng giới và nhu cầu tìm nguồn 03 lƣợng thay 1.1.1 Dầu mỏ 1.1.2 Khí tự nhiên 04 MỞ ĐẦU 05 1.1.3 Than 1.2 Hydro là nguồn lƣợng ƣu việt 1.3 Một số phƣơng pháp sản xuất hydro sinh hoc 1.3.1 Sản xuất Hydro điện 1.3.2 Sản xuất hydro khí metan (SMR) 06 08 08 08 1.3.3 Sản xuất Hydro nước oxy hóa hydrocacbon 1.3.4 Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng 1.3.5 Lên men tối sinh hydro 1.4 Sản xuất H2 sinh học theo đƣờng lên men tối 08 08 1.5 Một số loài vi khuẩn sản xuất hydro thông qua đƣờng lên 13 men tối 1.5.1 Vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt 1.5.2 Vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc 1.5.3 Vi khuẩn hiếu khí 1.6 Giới thiệu về Thermotoga neapolitana 1.6.1 Lịch sử 1.6.2 Phân loại 13 14 14 15 15 15 1.6.3 Đặc điểm hình thái sinh thái 1.6.4 Đặc điểm hệ gen 1.6.5 Đặc điểm tế bào chuyển hóa 1.6.6 Hydrogenase Thermotoga 1.6.7 Những đặc điểm phù hợp với việc sản xuất hydro 1.7 Các nguồn nguyên liệu tái sinh 1.7.1 Chất thải sản xuất đường 1.7.2 Chất thải sản phẩm sữa 15 16 16 16 18 18 18 19 1.7.3 Bã đậu 19 09 11 1.7.4 Glycerol 1.7.5 Rơm, rạ 20 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Chủng giống 22 20 2.2 Các thiết bị và dụng cụ thực thí nghiệm 2.2.1 Các thiết bị 22 22 22 2.3 Môi trƣờng nuôi cấy 23 23 2.3.1 Môi trường nuôi cấy với nguồn chất đơn giản 23 2.3.2 Môi trường nuôi cấy với nguồn chất bã đậu 2.3.3 Môi trường nuôi cấy với nguồn chất glycerol 2.3.4 Môi trường nuôi cấy với chất rơm, rạ 25 25 2.2.2 Các dụng cụ 2.4 Phƣơng pháp sục khí nitơ và kiểm sốt pH làm tăng hiệu suất tạo thành hydro 2.5 Sản xuất hydro quy mô lớn sử dụng nồi lên men 5L 2.6 Nghiên cứu qúa trình sản xuất hydro liên tục sử dụng nồi lên men L 2.7 Các phƣơng pháp phân tích CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tạo thành hydro chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 từ nguồn đƣờng đơn 3.1.1 Hoạt hóa, ni cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất đơn giản đến sản sinh hydro chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 3.1.3 Khảo sát số nguồn nitơ phổ biến cho sản xuất hydro sinh học từ chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt DSM 4359 đánh giá khả sinh hydro 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình sản xuất hydro DSM 4359 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng pH tới trình sản xuất hydro chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359 3.4 Nghiên cứu phƣơng pháp sục khí nitơ làm giảm áp suất khí bình ni cấy để tăng hàm lƣợng hydro 25 27 28 29 30 32 32 32 33 37 39 41 42 3.5 Hàm lƣợng acid hữu đƣợc tạo trình sản xuất hydro T neapolitana 44 3.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất vơ tới q trình sản xuất hydro T neapolitana 45 3.6.1 Ảnh hưởng KH2PO4 đến sinh trưởng tạo hydro Thermotoga neapolitana 45 3.6.2 Ảnh hưởng MgCl2.6H2O đến sinh trưởng tạo hydro 46 Thermotoga neapolitana 3.6.3 Ảnh hưởng Na2HPO4.12H2O đến sinh trưởng tạo 47 hydro Thermotoga neapolitana 3.6.4 Ảnh hưởng NaCl đến đến sinh trưởng tạo hydro Thermotoga neapolitana 48 3.7 Bƣớc đầu thăm dò, nghiên cứu tạo thành hydro từ nguồn rác thải nông nghiệp và nguồn phụ phẩm trình sản xuất biodiezel nhờ lên men kị khí chủng vi khuẩn DSM 4359 3.7.1 Khảo sát lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào - phụ phẩm trình sản xuất bio-diezel cho tạo thành hydro 49 3.7.2 Khảo sát lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào chế phẩm phân hủy lignocellulose từ rơm rạ cho tạo thành hydro 3.8 Nghiên cứu trình sản xuất hydro phƣơng pháp lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch culture) sử dụng nồi lên men L 3.9 Đánh giá khả sử dụng nguyên liệu đầu vào trình sản sinh hydro chủng vi khuẩn nghiên cứu KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 49 57 60 62 63 MỞ ĐẦU Thế giới vào năm đầu kỷ thứ 21 đứng trước nhiều vấn đề cần phải đối mặt Trong vấn đề thiếu lượng vấn đề cấp bách mang tính tồn cầu cần phải sớm có biện pháp giải Những nguồn lượng hóa thạch than đá, dầu mỏ, khí thiên nhiên khơng phải vơ tận Với phát triển ngành công nghiệp giới hiện nguồn lượng nhanh chóng cạn kiệt gây ảnh hưởng đến phát triển xã hội đời sống người Hơn nữa, đặc điểm tài nguyên hóa thạch thành phần hóa học có chứa nguyên tố cacbon, hydro, oxy, nitơ, lưu huỳnh, đặc biệt than cịn có kèm theo chất phóng xạ urani thori, sử dụng nguồn nhiên liệu gây ảnh hưởng lớn môi trường [1] Việc sử dụng tài nguyên hóa thạch dạng nhiên liệu để lại cho người hành tinh sống hậu vô cùng to lớn Do đó, tương lai, nhà khoa học tìm đến nguồn lượng có khả tái tạo thay nguồn nhiên liệu hóa thạch dần cạn kiệt như: lượng mặt trời, gió, thủy triều, địa nhiệt, lượng nguyên tử nhiên liệu sinh học…[4] Trong việc khai thác nhiên liệu sinh học phương thức tạo lượng quan tâm hiện hiệu suất cao, tốn thân thiện với mơi trường [4] Điển hình việc khai thác nguồn lượng hydro sinh học - nguồn lượng thay vô cùng ưu tương lai từ chủng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt cao Thermotoga neapolitana DSM 4359[20] Đây hướng mẻ đầy triển vọng không phần khó khăn nhiều thách thức Do tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu trình sản xuất hydro sinh học từ rác thải nông nghiệp nhờ chủng vi khuẩn ƣa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359” với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình sản xuất hydro sinh học từ số chất khác (glycerol, xylose, glucose…) Đưa kết thăm dị số nguồn phế thải nơng nghiệp làm nguyên liệu đầu vào cho trình sản xuất hydro sinh học nhờ lên men vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359 CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng nguồn lƣợng giới và nhu cầu tìm nguồn lƣợng thay Năng lượng vấn đề sống cịn tồn nhân loại Con người khai thác đến mức cao nguồn lượng hóa thạch (dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá…), lượng dự trữ nguồn nhiên liệu ngày cạn kiệt với tốc độ phi mã! Theo số liệu đánh giá gần nhất, tổng dự trữ nguồn lượng hóa thạch bao gồm dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá toàn giới hiện qui đổi than khoảng 1.279 GTCE (GTCE- Giga Tonnes Coal Equivalent, tương đương tỉ than), dầu mỏ khoảng 329 GTCE, khí thiên nhiên khoảng 198 GTCE, than đá khoảng 697 GTCE Như vậy, với mức khai thác sử dụng năm hiện nay: dầu mỏ 5,5 GTCE/năm, khí thiên nhiên 3,0 GTCE/năm, than đá 4,1 GTCE/năm lượng tài ngun hóa thạch cịn lại đủ dùng cho 42 năm dầu mỏ, 65 năm khí thiên nhiên 170 năm than đá; chưa kể nhu cầu lượng năm sau tăng năm trước nên thời gian lại ngắn dự báo [1] Việc sử dụng nhiều lượng hóa thạch khiến cho mơi trường trái đất bị ảnh hưởng nghiêm trọng ô nhiễm khơng khí, nước, tiếng ồn, mưa acid, mực nước biển dâng băng tan…, điển hình hiện tượng ấm lên toàn cầu tác động hiệu ứng nhà kính khủng hoảng lượng Theo dự báo Cơ quan thông tin lượng (EIA) vào năm 2004, vòng 24 năm kể từ năm 2001 đến năm 2025, mức tiêu thụ lượng tồn giới tăng thêm 54% (ước tính khoảng 404 nghìn triệu triệu Btu (British Thermal Unit) năm 2001 tới 623 Btu vào năm 2025) mà nhu cầu chủ yếu rơi vào quốc gia có kinh tế phát triển mạnh mẽ, ví dụ Trung Quốc hay Ấn Độ châu Á [1] Một cách cụ thể vấn đề nhu cầu lượng Thế giới có điểm cần lưu ý Một là, nhu cầu lượng giới tiếp tục tăng lên đặn hai thập kỷ qua Hai là, nguồn lượng hóa thạch chiếm 90% tổng nhu cầu lượng, năm 2010 Thứ ba là, nhu cầu đòi hỏi lượng khu vực Thế giới không giống [30, 31] Các nguồn lượng hóa thạch giới dần cạn kiệt, thêm vấn đề môi trường nảy sinh trình khai thác dẫn đến việc khuyến khích sử dụng lượng hồn ngun để giảm bớt ô nhiễm môi trường tránh gây cạn kiệt nguồn lượng hóa thạch Nhưng chưa có điều luật cụ thể vấn đề này, nên dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên coi nguồn nhiên liệu chủ yếu để nhằm thỏa mãn địi hỏi lượng điều dẫn đến cạn kiệt nguồn lượng hóa thạch thời gian khơng xa [1] 1.1.1 Dầu mỏ Nguồn tài nguyên thiên nhiên từ biển trở thành tiêu điểm cạnh tranh quốc tế Dầu mỏ coi nguồn lượng cho tồn giới tới năm 2025 Thống kê IEO2004 cho thấy, với nhu cầu đòi hỏi dầu mỏ tăng lên 1,9% năm vịng 24 năm tới, mức tiêu thụ 77 triệu thùng/ngày năm 2001 tăng lên tới 121 triệu thùng/ngày vào năm 2025, mà nhu cầu lớn từ Mỹ nước phát triển châu Á Ấn Độ, Trung Quốc… Các quốc gia chiếm tới 60% nhu cầu giới [1] Do thị trường lượng chiến lượng giới ngày nóng bỏng gay gắt giá dầu khó có khả hạ nhiệt, cho dù OPEC có tăng sản lượng dầu lên cao nữa, nguồn tài nguyên thiên nhiên quý mà gọi “vàng đen” đứng bờ vực cạn kiệt đẩy giới vào khủng hoảng trầm trọng lượng Vấn đề nóng bỏng làm “hạ nhiệt” tìm nguồn lượng thay tận dụng tìm cách khai thác triệt để nguồn lượng tuần hoàn sẵn có tự nhiên như: lượng gió, lượng mặt trời hay nguồn lượng tái tạo lại 1.1.2 Khí tự nhiên Cùng với dầu mỏ, gần đây, khí thiên nhiên coi nguồn nhiên liệu có nhu cầu tiêu thụ lớn giới với nhu cầu hàng năm tăng nhanh nhất, trung bình 2,2% kể từ năm 2001 đến 2025, so với nhu cầu tiêu thụ tăng 1,9% hàng năm dầu mỏ 1,6% hàng năm than Nhu cầu tiêu thụ khí thiên nhiên vào năm 2025 ước tính 151 nghìn tỷ feet khối, tăng lên gần 70% so với nhu cầu tiêu thụ năm 2001 (khi 90 nghìn tỷ feet khối) Như vậy, mức tiêu thụ khí thiên nhiên tổng loại lượng tiêu thụ tăng từ 23% năm 2001 lên 25% vào năm 2025 [1] Cho dù mức độ tiêu thụ khí thiên nhiên tăng cao, đặc biệt thập niên vừa qua, trữ lượng khí để sản xuất sản phẩm khí thiên nhiên hầu hết khu vực cịn lớn ước tính dùng khoảng 60,7 năm Trung Nam Mỹ có trữ lượng khí tự nhiên đủ cho khoảng 68,8 năm; Các nước Cộng hịa thuộc Liên bang Xơ Viết cũ khoảng 75,5 năm, châu Phi 88,9 năm riêng Trung Đơng trữ lượng khí quy đổi khí thành phẩm đủ cung cấp cho 100 năm 1.1.3 Than Là nguồn nhiên liệu hóa thạch sử dụng từ lâu giới Tổng trữ lượng than tồn giới ước tính khoảng 1.083 tỷ tấn, đủ cung cấp cho khoảng 170 năm với mức tiêu thụ hiện Mặc dù phân bố rộng rãi 60% trữ lượng than giới tập trung quốc gia: Mỹ (25%); Liên Xô cũ (23%) Trung Quốc (12%) Bốn quốc gia khác Úc, Ấn Độ, Đức Nam Phi chiếm khoảng 29% Trong năm 2001, quốc gia cung cấp tới 80% sản lượng than cho toàn giới Các đặc trưng chất lượng địa chất trầm tích than tham số quan trọng trữ lượng than Than loại lượng hóa thạch hỗn tạp nhiều so với dầu mỏ khí tự nhiên chất lượng biến đổi theo khu vực hay chí bên cùng vỉa than Ví dụ Úc, Mỹ hay Canada có chứa than với hàm lượng bitum cao dùng để sản xuất than cốc quốc gia bán 81% than cốc cho giới năm 2002 Một loại than có chứa hàm lượng Bitum thấp gọi “than nâu” hay than non, khơng có tính thương mại thị trường giới lượng nhiệt thấp Năm 2001, than non chiếm khoảng 18% tổng sản lượng khai thác toàn giới Ba nước đứng đầu sản xuất than non Đức (193 triệu tấn), Nga (110 triệu tấn), Mỹ (84 triệu tấn) với lượng than non sản xuất chiếm 41% tổng sản lượng toàn giới năm 2001 [1] Như vừa điểm qua khả cung cấp trữ lượng nguồn nhiên liệu chủ yếu sử dụng giới Đứng trước tình hình nguồn nhiên liệu hóa thạch dần cạn kiệt, nước giới cố gắng khai thác thêm nguồn lượng khác lượng hạt nhân, thủy triều, gió, mặt trời, địa nhiệt, hay lượng sinh học Trong đó, lượng sinh học góp phần đa dạng hóa nguồn lượng, thúc đẩy tăng trưởng kinh tế, giảm 10 Bảng 3.12 Kế t quả tiề n xử lý rơm rạ bằ ng NH 10% ở 121oC Thời gian xƣ̉ lý (phút) Tỷ lệ % Lignin Hàm lƣợng Glucose loại bỏ đƣơ ̣c xƣ̉ lý(%) 10 17,02 50,74 20 37,17 51,28 30 45,65 52,76 40 46,49 54,69 50 52,08 56,74 60 65,21 57,07 Tăng thời gian tiề n xử lý bằ ng dung dich ̣ ammoniac 10% từ 10 phút đến 60 phút 121oC thu kế t quả 60 phút loại bỏ đươ ̣c 65,21 % lignin Hàm lươ ̣ng glucose xử lý 57,07 % Kế t quả tiề n xử lý bằ ng dung dịch nước amoniac 10% có hiệu 121oC 60 phút  Tiền xử lý bằ ng dung dich ̣ axít sulfuric 1% Hemicellulose sinh khối lignocellulose có đươ ̣c hịa tan axit sulfuric lỗng Ở nhiệt độ cố định 121oC 30 phút tỷ lệ rắn chất lỏng, 1:10 (w / v) tiền xử lý với acid sulfuric 1,0% 1,5% gần giống phân giải 58- 60 % xylose Bảng 3.13 Kế t quả tiề n xử lý rơm rạ bằ ng axít sulfuric 1% ở 121oC Thời gian xƣ̉ lý (phút) Hàm lƣợng Xylose đƣơ ̣c xƣ̉ lý(%) 10 39,78 20 42,56 30 53,76 40 59,08 50 65,97 60 51,08 59 Qua Bảng 3.13 cho thấ y tiề n xử lý với axit sulfuric 1% nhiệt độ 121oC thời gian 50 phút cho hiê ̣u quả cao nhấ t xử lý đươ ̣c 65,97% xylose Kế t quả này tương tự báo cáo Kim cộng [12] cho 60 - 80% hemicellulose dễ dàng thủy phân tiền xử lý với H 2SO4 1.0% 121o C 50 phút 3.7.2.2 Thành phần rơm rạ sau tiền xử lý Theo phương pháp 2.3.4, có kết phân tích thành phần rơm rạ sau: 41% cellulose; 17.8% lignin; số chất khác Những nghiên cứu tương tự với nghiên cứu trước Nguyễn Tâm Anh cộng rơm ̣ Hà n Quố c 2009: Thành phần Rơm rạ chứa 41,4% cellulose; 9,6 % hemicellulose 22,8% lignin Phương pháp tiền xử lý kết hợp NH3 H2SO4 cho thấy vài ưu điểm Trước hết, tạo dung dịch thủy phân bao gồm loại đường có sẵn dễ lên men, đặc biệt pentose Thứ hai, cellulose dung dịch thủy phân sở hữu khả tiếp cận với enzyme thủy phân tác động tương tác NH3 H2SO4 Hệ thống cellulase hoạt động hiệu chất cung cấp nguồn glucose dồi cho phát triển vi khuẩn Thành phần dung dịch thủy phân trình bày Bảng 3.14 Bảng 3.14.Thành phần dung dịch thủy phân sau xử lý rơm rạ với NH3 H2SO4 Thành phần Phần rắn (%) Phần dung dịch (%) Glucose 60.16 ± 0.34 3.19± 0.01 Xylose 2.84 ±0.03 15.46 ± 0.09 Lignin 4.99 ± 0.03 Khơng có 3.7.2.3 Sản lượng hydro sử dụng chất rơm rạ qua xử lý Để xác định ảnh hưởng chất rơm rạ đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu nuôi cấy thời gian từ 24 đến 120 sử dụng chất rơm rạ thô rơm rạ qua tiền xử lý với nồng độ 5g/L Kết thể hiện hình 3.12 60 Sản lượng hydro (mmol/L) 14 12 10 rơm rạ thô rơm rạ qua tiền xử lý 24 48 72 96 120 144 Thời gian ni cấy (giờ) Hình 3.12 Ảnh hưởng chất rơm rạ thô chất rơm rạ qua xử lý tạo thành hydro chủng nghiên cứu Bảng 3.15 thể hiện kết tham số sử dụng rơm rạ chưa qua tiền xử lý rơm rạ qua tiền xử lý làm chất thời điểm nuôi cấy 120 Bảng 3.15 Sản lượng hydro sử dụng rơm thô rơm rạ qua xử lý làm chất Các tham số Rơm rạ thô Rơm rạ qua tiền xử lý hydro 3.26 ± 0.05 11.52 ± 0.13 Hiệu suất tạo hydro (mmol/g chất) 2.27 ± 0.01 2.70 ± 0.01 Chuyển đổi glucose (%) 37.49 ± 0.19 72.95 ± 0.35 Chuyển đổi xylose (%) 48.61 ± 0.25 95.74 ± 0.48 Mức tiêu thụ chất (%) 28.65 ± 0.16 85.42 ± 0.41 Sản lƣợng (mmol/L) Dựa vào kết cho thấy: tiền xử lý rơm rạ giúp làm tăng sản lượng hydro cách đáng kể so với không qua tiền xử lý Sản lượng hydro đạt mức cao nhất11.52 mmol/L, cao gần lần so với sử dụng rơm rạ thô làm chất (3.28 mmol/L), với 85.4% chất tiêu thụ, mức độ chuyển hóa đường 95.7% xylose 73% với glucose Phương pháp tiền xử lý rơm rạ với NH3 H2SO4 điều kiện nhiệt độ áp suất cao nồi hấp, nước nóng 61 NH3 hay H2SO4 xâm nhập vào cấu trúc tế bào rơm rạ, tác động NH3 giúp loại bỏ lignin pha loãng H2SO4 nâng cao hiệu trình phân giải cellulose/hemicellulose Trong khía cạnh kĩ thuật, tiền xử lý hiệu coi phương pháp bảo quản phân đoạn pentose hexose, hạn chế hình thành sản phẩm thối hóa gây ức chế sinh trưởng vi sinh vật tránh nhu cầu làm giảm kích thước hạt sinh khối Trong phương pháp này, nhiệt độ thời gian xử lý không cao không dài để tránh phân hủy đường 3.8 Nghiên cứu trình sản xuất hydro phƣơng pháp lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch culture) sử dụng nồi lên men L Để sản xuất hydro liên tục làm tăng sản lượng hydro Phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung sử dụng nồi lên men 5L thực hiện sử dụng 5g/L glucose làm chất, pH trì mức 7.0 2N NaOH, tốc độ lắc 400rpm, với đợt bổ sung chất thời điểm 39, 57, 78 99h ni cấy Kết thể hiện hình 3.13 Hình 3.13A cho thấy, hydro bắt đầu sinh sau 6h nuôi cấy đạt mức cao 14.8 ± 0.07 mmol/L 24h nuôi với tốc độ đạt 3.4 ± 0.19 mmol/L/h, sau giảm dần xuống 2.7 ± 0.15 mmol/L/h sau 36h nuôi cấy Sinh khối tế bào tăng nhanh chóng đạt mức 1.5 ± 0.07 g/L sau 24h nuôi cấy giảm dần sau đạt mức cực đại 1.85 ± 0.07 g/L sau 36h ni cấy, thời điểm này, cịn lại lượng nhỏ chất, lại 96% chất tiêu thụ hết Trong trình lên men, acid acetic acid lactic sản sinh, nhiên acid lactic sinh muộn hơn, sau khoảng 30h ni cấy Hình 3.13B cho thấy, lượng acid acetic tăng theo thời gian, kết thúc pha thứ quy trình ni cấy, lượng acid acetic acid lactic đạt 2.3 ± 0.1 0.2 ± 0.01 g/L Đợt bổ sung chất lần thực hiện sau 36h nuôi cấy, Môi trường dinh dưỡng thêm vào hệ thống lên men, nồng độ glucose sinh khối lúc 5.12 ± 0.2 g/L 2.5 ± 0.07 g/L Phân tích q trình lên men khoảng từ 37 đến 55h nuôi cấy ta thấy, sinh khối tế bào tăng nhanh chóng lên mức 2,24 ± 0.1 g/L sau 53h ni cấy, sau giảm nhẹ xuống 2.0 ± 0.1 g/L sau 55h nuôi cấy mà lượng glucose lại tiêu thụ gần hết (95.7%) Tốc độ sản lượng hydro đạt mức cao 4.7 ± 0.23 mmol/L/h 20.01 ± 0.22 mmol/L 40h nuôi cấy Đến cuối pha thứ này, sản lượng acid acetic acid lactic đạt 4.5 ± 0.2 0.6 ± 0.01 g/L 62 Đợt bổ sung chất lần thực hiện sau 55h nuôi cấy Lúc nồng độ glucose hệ thống lên men đạt 4.98 ± 0.24 g/L (Hình 3.13B) Sinh khối nhanh chóng đạt mức 2.5 ± 0.11g/L 75h nuôi cấy Tốc độ sản lượng hydro đạt mức cao 4.4 ± 0.20 mmol/L/h 18.07 ± 0.09 mmol/L 60h ni cấy, sau giảm xuống cịn 2.5 ± 0.20 mmol/L/h 75h ni cấy lượng glucose tiêu thụ gần hết Cuối pha nuôi cấy thứ 3, nồng độ acid acetic acid lactic đạt 6.1 ± 0.27 1.0 ± 0.05 g/L, với 97.4% chất tiêu thụ Đợt bổ sung chất lần thực hiện sau 76h nuôi cấy Nồng độ glucose lúc 5.14 ± 0.27 g/L Sinh khối tiếp tục tăng đạt đến mức 2.75 ± 0.12 g/L sau 95h nuôi cấy Tốc độ tạo hydro sản lượng hydro đạt mức cao 3.9 ± 0.2 mmol/L/h 16.74 ± 0.07 mmol/L 80h ni cấy sau tốc độ giảm xuống cịn 2.5 ± 0.17 mmol/L/h sau 95h ni cấy, mà lượng chất tiêu thụ gần hết Cuối pha thứ này, lượng acid acetic, acid lactic glucose dư 6.8 ± 0.30, 1.7 ± 0.07 0.14 ± 0.01 g/L 96h nuôi cấy Đợt bổ sung chất lần cuối cùng thực hiện sau 96h nuôi cấy, nồng độ glucose lúc 4.8 ± 0.20 g/L Sinh khối tiếp tục tăng lên mức 2.5 ± 0.13 g/L 108h nuôi cấy Tốc độ sản lượng hydro đạt mức tối đa 4.1 ± 0.21 mmol/L/h 18.73 ± 0.09 mmol/L 100h ni cấy Đến cuối q trình lên men theo mẻ có bổ sung, lượng acid acetic, acid lactic glucose dư đạt 7.60 ± 0.37, 2.5 ± 0.12 0.11 ± 0.01 g/L Tổng kết lại sau pha nuôi cấy liên tục với lần bổ sung chất, tốc độ sản xuất hydro trung bình đạt 3.15 mmol/L/h 63 25 A 20 Tốc độ tạo hydro (mmol/L/h) 4.5 3.5 15 10 1.5 0.5 0 sản lượng hydro (mmol/L) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Thời gian nuôi cấy (giờ) tốc độ tạo hydro (mmol/L/h) 2.5 1.5 0.5 Thời gian nuôi cấy (giờ) 64 108 96 84 72 60 48 36 24 12 0 Sức sinh trƣởng tế bào (g DCW/L) Glucose dƣ, acid acetic, acid lactic (g/L) Sản lƣợng hydro (mmol/L) 2.5 B DCW glucose dư (g/L) acid acetic (g/L) acid lactic (g/L) Hình 3.13 Sự sinh trưởng tạo hydro chủng nghiên cứu sử dụng phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung ở nồi lên men 5L (A) Sản lượng tốc độ tạo hydro (B) Sức sinh trưởng trao đổi chất (glucose, acid hữu cơ) chủng nghiên cứu 3.9 Đánh giá khả sử dụng nguyên liệu đầu vào trình sản sinh hydro chủng vi khuẩn nghiên cứu Trên quy mô nhỏ, tiến hành thí nghiệm sử dụng bình với thể tích 120mL Với pH tối ưu ban đầu đưa vào 7.5 nhiệt độ ln trì mức 70°C phát triển sản xuất hydro điểu kiện kị khí bảng số liệu tổng kết khả sử dụng chất chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana Bảng 3.16 Bảng số liệu đánh giá khả sử dụng chất Thermotoga neapolitana Nghiên cứu 40 mL mơi trường với bình serum 120 mL Cơ chất đƣa vào (5 g/L) Lƣợng hydro sinh (mL H2/L) Glucose 806.2 ± 41.4 Xylose 625.8 ± 30.9 Cellulose 39.8 ± 2.3 Glycerol tinh khiết 440.05 ± 22.35 Glycerol thô 477.85 ± 23.85 Qua bảng 3.16, thấy tác động khác chất khác lên sản lượng hydro chủng vi sinh vật Chúng ta thấy với nguồn glycerol thô (lẫn tạp chất ) cho tỷ lệ hydro cao glycerol tinh khiết lý 65 giải điều với hợp chất thơ cịn chứa số chất khác phục vụ cho việc sản xuất hydro mà glycerol số Ảnh hưởng chất tới phát triển sinh trưởng chủng vi sinh vật Thermotoga neapolitana yếu tố đóng vai trị quan trọng góp phần thúc đẩy sản xuất lượng hydro Các nghiên cứu tiến hành đưa kết số liệu thống kê so sánh nhận định khách quan quy mô nhỏ thực hiện phịng thí ngiệm nhằm phục vụ cho cơng nghệ sản xuất hydro quy mô lớn nồi lên men kị khí thiết kế Hy vọng với nỗ lực, cố gắng thực hiện nguồn lượng hydro tương lai khai thác tận dụng triệt để không nhằm thay nguồn nguyên liệu dầu hỏa dần cạn kiệt ngày mà góp phần làm giảm thiểu nhiễm mơi trường hiệu ứng nhà kính 66 KẾT LUẬN Đã hoạt hóa ni cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 chủng vi khuẩn kí khí ưa nhiệt dùng để nghiên cứu sản xuất hydro sinh học Đã xác định nồng độ chất ban đầu phù hợp 5g/L glucose 5g/L xylose cho sản lượng hydro 19.68 mmol/L 20.01 mmol/L, khẳng định chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 sử dụng đường xylose hexose để sản xuất hydro sinh học Đã nghiên cứu khảo sát nguồn nitơ phù hợp 2g/L cao nấm men, cho sản lượng hydro đạt 20.01 mmol/L Đã xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 nhiệt độ 75°C, pH7.5, tốc độ lắc 100rmp Đã nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng tới trình lên men tạo hydro chủng vi khuẩn kị khí đưa số kết luận sau: việc sục khí nitơ kiểm sốt pH sau hai chu kỳ làm giảm áp suất riêng phần hydro, tạo sản lượng hydro đạt mức cao 37.57 ± 1.88 mmol/L Ngoài ra, acid lactic acid acetic sinh trình lên men làm giảm pH môi trường xuống 6.5 sau 30h nuôi cấy ảnh hưởng xấu tới hiệu suất tạo hydro Bên cạnh đó, nồng độ chất vơ thích hợp cho trình lên men tạo hydro là: KH2PO4 150mg/L; MgCl2.6H2O 20mg/L; Na2HPO4.12H2O 400mg/L; NaCl 20g/L Đã bước đầu tìm hiểu số nguồn chất tái tạo, sẵn có bã đậu, phụ phẩm glycerol từ q trình sản xuất dầu diezel sinh học, từ rơm, rạ Hàm lượng hydro đạt là: 15mmol/L; 20mmol/L; 11.5mmol/L, từ nguồn tương ứng Đã nghiên cứu sản xuất hydro quy mơ 5L phịng thí nghiệm nghiên cứu trình sản xuất hydro phương pháp ni cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch), hiệu suất thu trung bình 3.15 mmol hydro/mol chất 67 KIẾN NGHỊ Tiếp tục sâu tìm hiểu điều kiện nuôi cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 để tối ưu hóa mơi trường ni cấy nhằm thu nguồn hydro lớn Phát triển quy mô nuôi cấy từ nuôi cấy mẻ sang nuôi cấy liên tục thời gian dài để tìm hiểu khả sản sinh hydro có ứng dụng thiết thực quy mơ cơng nghiệp Tìm hiểu, nghiên cứu thêm nguồn chất phụ phẩm (ví dụ: bã mía, lõi ngơ hay rơm rạ…) để có thêm nhiều lợi ích mặt kinh tế Hồn thiện quy trình sản xuất hydro sinh học từ nhiều nguồn nhiên liệu tái tạo, đặc biệt từ rơm, rạ, cellulose…cũng nâng cao hiệu suất tạo hydro để sản xuất nguồn nhiên liệu hydro sinh học quy mô lớn đến quy mô công nghiệp - Đánh giá hiệu suất hiệu mặt (kinh tế, xã hội, tác động môi trường…) sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo dồi Việt Nam để sản xuất nhiên liệu hydro - Nghiên cứu phương thức thu hồi hydro từ hỗn hợp khí tạo sau trình lên men… 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Thanh Huyền, “Bức tranh lượng giới”, Chuyên đề lượng- VnGG, Chương 11 Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà (2009), Sinh trưởng phát triển vi sinh vật Trần Vạn Thọ, “Phân loại sơ lược”, Chuyên đề lượng- VnGG, Chương Tài liệu tiếng Anh Tien Anh Ngo, Ha Thi Viet Bui, (2011), “Study on biohydrogen production from various substrates by Thermotoga neapolitana DSM 4359”, VNU, J Scen Nat Sci & Tech, 27 (2S), 292-296 Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, ChiuYue Lin, Jo-Shu Chang (2011), “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”, Bioresource Technology102, pp 8514–8523 Duu-Jong Lee, Kuan-Yeow Show, Ay Sud (2011), “Dark fermentation on biohydrogen production: Pure culture”, Bioresource Technology 102, pp 8393– 8402 Elsayed Elbeshbishy, Hisham Hafez, Bipro Ranjan Dhar, George Nakhl, (2011), “Single and combined effect of various pretreatment methods for biohydrogen production from food waste”, International journal of hydrogen energy 36, pp 1379 - 1387 Guwy A.J., R.M Dinsdale, J.R Kim, J Massanet-Nicolau, G Premier, (2011), “Fermentative biohydrogen production systems integration”, Bioresource Technology 102, pp 8534–8542 Jannesh, H.W., R Huber, S Belkin, K.O Stetter, (1988),“sp nov of the extremely thermophilic, eubacterial genus Thermotoga”, Arch Microbiol.,150 10 Lars G Ljungdahl, Michael W Adams Larry L Barton, James G Ferr, Michael K Johnson, Biochemistry and Physiology of Anaerobic Bacteria 11 Li´vian Ribeiro Vasconcelos de Sa´, Marcone Augusto Leal de Oliveir, Magali Christe Cammarota, Andrea Matos, Viridiana Santana Ferreira, (2011), “Simultaneous analysis of carbohydrates and volatile fatty acids by HPLC for 69 monitơring fermentative biohydrogen production”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 5177 – 5186 12 Mi-Sun Kim, Dong-Yeol Lee, Dong-Hoon Kim, (2011), “Continuous hydrogen production from tofu processing waste using anaerobic mixed microflora under hermophilic conditions”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 8712 – 8718 13 Nima Nasirian, Morteza Almassi, Saeid Minaei, Renatus Widmann, (2011), “Development of a method for biohydrogen production from wheat straw by dark fermentation”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 411 – 420 14 Reith J.H., R.H Wijffels and H Barten, Bio- methane & bio – hydrogen, pp 103 - 121 15 Pallavi Sinha, Anjana Pandey, (2011), “An evaluative report and challenges for fermentative biohydrogen production”, International journal of hydrogen energy36, pp 7460 – 7478 16 Patrik R Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2production by engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy, 33, pp 5122 – 5130 17 S.Van Ooteghem, P H Yue, S Beer, Thermotoga neapolitana: A microaerophile producing hydrogen in the presence of oxygen, National Energy Technology Laboratory 18 Shinsuke Sakai, Tatsuo Yagishita, (2007), “Microbial Production of Hydrogen and Ethanol From Glycerol-Containing Wastes Discharged From a Biodiesel Fuel Production Plant in a Bioelectrochemical Reactor With Thionine”, Biotechnology and Bioengineering, 98 (2) 19 Suellen A Van Ooteghem, Stephen K Beer, Paul C Yue, (2001), Hydrogen Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana, National Energy Technology Center, U.S Department of Energy 20 Susan E Childers, Madeline Vargas, Kenneth M Noll, (1992), “Improved Methods for Cultivation of the Extremely Thermophilic Bacterium Thermotoga neapolitana”, American Society for Microbiology, 58 (12), pp 3949-3953 21 Takesi Ito, Yutaka Nakashimada, Koichiro Senba, Tomoaki Masui, Naomichi Nishio (2005), “Hydrogen and ethanol production from Glycerol –containing wastes discharged after biodiesel manufacturing process”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 100 (3), pp 260-265 70 22 Tam Anh D Nguyen, Jun Pyo Kim, Mi Sun Kim, You Kwan Oh, Sang Jun Sim (2008), “Optimization of hydrogen production by hyperthermophilic eubacteria, Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana in batch fermentation”, International journal of hydrogen energy 33, pp.1483 – 1488 23 Tam-Anh D Nguyen, Se Jong Han, Jun Pyo Kim, Mi Sun Kim, You Kwan Oh, Sang Jun Sim (2008), “Hydrogen production by the hyperthermophilic eubacterium, Thermotoga neapolitana, using cellulose pretreated by ionic liquid”, International journal of hydrogen energy, 33, pp 5161 – 5168 24 Tatsuo Yagishita, ShinsukeSakai, Bioelectrochemical Hydrogen and Ethanol Production from Glycerol as a By-Product of BDF Production, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) 25 Thauer, R.K., K Jungerman, K Decker (1977), “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol Rev., 41 26 Thiruchitrambalam Valliyappan (2004), Hydrogen or Syn Gas Production from Glycerol Using Pyrolysis and Steam Gasification Processes, University of Saskatchewan Saskatoon, Saskatchewan, Master thessis 27 You-Kwan Oh, Subramanian Mohan Raj, Gyoo Yeol Jung, Sunghoon Park, (2011), “Current status of the metabolic engineering of microorganisms for biohydrogen production”, Bioresource Technology, 102, pp 8357–8367 28 Yung-Chung Lo, Yi-Chen Su, Chieh-Lun Cheng, Jo-Shu Chang, (2011), “Biohydrogen production from pure and natural lignocellulosicfeedstock with chemical pretreatment and bacterial hydrolysis”, International journal of hydrogen energy, 36, pp 3955 – 3963 29 Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, ChiuYue Lin, Jo-Shu Chang “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”, Bioresource Technol, (2011), 102, (18), 8514 – 8523 30 Reith J.H., R.H Wijffels and H Barten (2003), “Bio-methane &Biohydrogen”, Dutch Biological Hydrogen Foundation 31 David B Levin, Richard Chahine, (2010), “Challenges for renewable hydrogen production from biomass”, Inter J of Hydrogen Energy, 35, (10), 4962 – 4969 32 Suellen A Van Ooteghem, Stephen K Beer Paul C Yue, (2001), “Hydrogen Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana”Proceeding of 2001 of Hdrogen program review 71 33 Tam-Anh D Nguyen, Kyoung, , Mi Sun Kim, , Sang Jun Sim, (2008), “Thermophilic hydrogen fermentation from Korea rice straw by Thermotoga neapolitana”, International journal of hy drogen energy 35 (2009) 13392–13398 34 Patrik R Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2productionby engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy 33 (2008) 5122–510 35 Barry D Solomon, Abhijit Banerjee “A global survey of hydrogen energy research, development and policy”, Energy Policy 34 (2006) 781 – 792 36 Pallavi Sinha, Anjana Pandey, (2011) “An evaluative report and challenges for fermentative biohydrogen production, International Journal of hydrogen energy 36(13), 7460–7478 37 Duu-Jong Lee, Kuan-Yeow Show, AySu (2012) “Dark fermentation on biohydrogen production: Pure culture”, Bioresource Technology 102 (2011) 8393– 8402 38 Show K.Y , D.J Lee, J.H Tay, C.Y Lin, J.S Chang (2012), “Biohydrogen production: Current perspectives and the way forward”, International journal of hydrogen energy, 37(20), 14983-15840 39 Angela A Abreu, Dimitar Kara kashev, Irini Angelidak, Diana Z Sousa and M Madalena Alves (2012) “Biohydrogen production from arabinose andglucose using extreme thermophilic anaerobicmixed cultures”, Biotechnology for Biofuels, 5(6) 40 Martina Cappelletti, Giacomo Bucchi, Jocelia De Sousa Mendes, Andrea Alberini, Stefano Fedi, Lorenzo Bertin and Dario Frascari, (2012) “Biohydrogen production from glucose, molasses and cheese whey by suspended and attached cells of four hyperthermophilic Thermotoga strains, Chemical Technology & Biotechnology, 87 (9), 1291-1301 41 Kuan-Yeow Show, Duu-Jong Lee, Jo-Shu Chang (2012) “Bioreactor and process design for biohydrogen production”, Bioresource Technology 42 Hui Wang, Zelun Zhi, Jian Wang, Shenghua Ma (2012) “Comparison of various pretreatment methods for biohydrogenproduction from cornstalk”, Bioprocess Biosyst Eng (2012) 35:1239–1245 43 Chin-Chao Chen, Biswarup Sen, Yeong-Song Chuang, Chia-Jung Tsai, ChyiHow Lay (2012) “Effect of enfluent recycle ratio in a continuous anaerobic biohydrogen production system”, Journal of Cleaner Production, 32, 236-243 72 44 Cortright RD Hydrogen generation from biomass – derived Compounds Utilizing aqueous – phasere forming In:Vehicle Power and propulsion, 2005 IEEE conference; September 2005.doi:10.1109/VPPC.2005.1554603 45 Chornet E, Czernik S Renewable fuels: harnessing hydrogen Nature 2002; 418; 964-7 46 Kumar A, Jain SR, Sharma CB, Joshi AP, Kalia VC (1995); Increased H2 production by immobilized microorganisms, World J Microbiol Biotechnol 11, 156159 73