Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus Mutans : Luận án TS. Sinh học : 62 42 30 15

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUANG HUY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG STREPTOCOCCUS MUTANS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2009 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUANG HUY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG STREPTOCOCCUS MUTANS Mã số : 62.42.30.15 LUẬN VĂN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2009 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sâu yếu tố liên quan 1.1.1 Bệnh sâu 1.1.2 Tình hình bệnh sâu giới Việt Nam 1.1.3 Cơ chế gây bệnh sâu 1.1.4 Mảng bám hình thành mảng bám 1.2 Vi khuẩn Streptococcus mutans khả gây sâu 1.2.1 Một số đặc trưng hình thái phân loại Streptococcus mutans 10 1.2.2 Một số đặc trưng sinh lý sinh hoá S mutans 12 1.2.3 Cơ sở phân tử đáp ứng stress vi khuẩn S mutans 14 1.2.3.1 Đáp ứng stress axit vi khuẩn S mutans 15 1.2.3.2 Đáp ứng stress oxy hóa vi khuẩn S mutans 19 1.2.4 Các đặc trưng hệ gen S mutans việc phân lập 20 nhận dạng 1.3 Các biện pháp chống sâu 22 1.3.1 Sử dụng chất kháng khuẩn 22 1.3.2 Sử dụng chất tổng hợp 25 1.3.3 Sử dụng hợp chất tự nhiên 26 1.3.4 Sử dụng biện pháp khác 28 1.3.4.1 Liệu pháp thay 28 1.3.4.2 Vaccine phịng chống sâu 28 1.3.5 Tình trạng nhiễm fluo 28 1.4 Các chất thứ cấp từ thực vật 29 1.4.1 Phân loại, cấu tạo hoá học tính chất chất thứ cấp từ thực vật 29 1.4.1.1 Nhóm hợp chất terpene 30 1.4.1.2 Nhóm hợp chất phenolic 30 1.4.1.3 Nhóm hợp chất chứa nitơ 33 1.4.2 34 Hoạt tính sinh học hợp chất thứ cấp từ thực vật 1.4.2.1 Tác dụng chống oxy hoá hợp chất thứ cấp từ thực vật 34 1.4.2.2 Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn hợp chất thứ cấp từ thực vật 36 1.4.2.3 38 Một số tác dụng khác chất thứ cấp từ thực vật CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Nguyên liệu 40 2.1.1 Chủng vi sinh vật 40 2.1.2 Mẫu thực vật 40 2.1.3 Hố chất 40 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn bảo quản tế bào vi khuẩn 41 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn gây sâu S 41 mutans từ bệnh phẩm mắc bệnh sâu 2.2.2.1 Phân lập môi trường Mitis salivarius 42 2.2.2.2 Phân lập môi trường TSA pH 5,0 42 2.2.3 43 Phương pháp nhận dạng Streptococcus mutans phân lập từ người Việt Nam 2.2.3.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 43 2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram cải tiến 43 2.2.3.3 Kiểm tra hoạt tính catalase 43 2.2.3.4 Kiểm tra đặc tính hố sinh (kit Api 20 Strep) 43 2.2.3.5 44 Phương pháp PCR nhân đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn 2.2.3.6 Phương pháp PCR mồi đặc hiệu nhân đoạn gen mã hóa cho 45 dextranase Streptococcus mutans 2.2.3.7 Phương pháp đọc trình tự đoạn gen mã hóa ARNr 16S 45 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy biofilm 46 2.2.5 Phương pháp xác định mức độ sinh axit vi khuẩn 46 2.2.6 Phương pháp xác định mức độ gây chết tế bào 46 2.2.7 Phương pháp xác định khả chịu axit chủng vi khuẩn 47 2.2.8 Phương pháp đo mức độ tiêu thụ oxy tế bào 47 2.2.9 Xác định hoạt độ số enzyme quan trọng S mutans 47 2.2.9.1 Chuẩn bị tế bào thấm 48 2.2.9.2 Phân tích hoạt độ ATPase 48 2.2.9.3 Phân tích hoạt độ phosphotransferase (PTS) 49 2.2.9.4 Phân tích hoạt độ NADH oxidase 49 2.2.9.5 Phân tích hoạt độ lactate dehydrogenase 50 2.2.9.6 Phân tích hoạt độ pyruvate kinase 50 2.2.10 51 Phương pháp nghiên cứu định tính thành phần số hợp chất thực vật thứ sinh dịch chiết thực vật 2.2.11 Phương pháp phân tách hợp chất sắc ký 52 2.2.12 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 53 2.2.13 Phương pháp xử lý số liệu 53 Ch­¬ng Kết nghiên cứu 54 3.1 Nghiờn cu sng lọc số thực vật có khả kháng khuẩn sâu 54 3.1.1 Khả ức chế sinh axit số dịch chiết thực vật 54 3.1.2 Khả diệt S mutans GS-5 dịch chiết số thực vật 58 3.1.2.1 Khả diệt vi khuẩn S mutans GS-5 pH 58 3.1.2.2 Khả diệt vi khuẩn S mutans GS-5 pH 59 3.1.3 60 Khả ức chế hình thành bioflim S mutans GS-5 dịch chiết thực vật 3.1.4 Tác dụng dịch chiết số thực vật phối hợp với fluo 62 3.1.5 Tác dụng dịch chiết số thực vật phối hợp với H2O2 64 3.1.6 Tác dụng dịch chiết Sao đen Sắn thuyền lên số vi khuẩn đường miệng 65 3.2 Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất số chất thứ cấp 67 có hoạt tính kháng khuẩn sâu từ vỏ Sao đen 3.2.1 Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có vỏ Sao đen 67 3.2.2 Tách chiết tinh số chất thứ cấp từ vỏ Sao đen 68 3.2.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu hopea phenol 72 malibatiol A từ vỏ Sao đen 3.2.3.1 Tác dụng hopea phenol malibatiol A lên sinh axit S mutans 72 3.2.3.2 Tác dụng giết tế bào S mutans GS-5 hopea phenol malibatol A 73 3.2.3.3 Tác dụng hopea phenol malibatol A lên hoạt độ ATPase 74 3.2.3.4 Tác dụng hopea phenol malibatol A lên hoạt độ 74 phosphotransferase S mutans GS-5 3.2.3.5 Tác dụng hopea phenol, malibatol A lên hoạt độ lactate dehydrogenase 75 3.2.3.6 Tác dụng hopea phenol malibatol A lên hoạt độ pyruvate kinase 76 3.2.3.7 Tác dụng hopea phenol malibatol A lên hoạt độ NADH oxidase 77 3.3 Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất số chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn sâu từ Sắn thuyền 77 3.3.1 Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có Sắn thuyền 78 3.3.2 Tách chiết tinh số chất thứ cấp từ Sắn thuyền 79 3.3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu axit asatic 83 3.3.3.1 Tác dụng axit asiatic lên sinh axit S mutans GS-5 83 3.3.3.2 Tác dụng axit asiatic lên diệt S mutans GS-5 83 3.3.3.3 Tác dụng axit asiatic lên hoạt độ ATPase S mutans GS-5 84 3.3.3.4 ảnh hưởng axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase S mutans GS-5 84 3.3.3.5 Tác dụng axit asiatic lên hoạt độ lactate dehydrogenase S 85 mutans GS-5 3.3.3.6 Tác dụng axit asiatic lên hoạt độ pyruvate kinase S mutans GS-5 85 3.3.3.7 Tác dụng axit asiatic lên NADH oxidase S mutans GS-5 86 3.4 Phân lập số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt Nam 87 3.4.1 Phân lập S mutans môi trường Mitis Salivarius môi trường TSA pH 87 3.4.2 Xác định số đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh tế bào vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam 89 3.4.2.1 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn kiểm tra hoạt tính catalase 89 3.4.2.2 Nhận dạng sơ Streptococcus mutans kit API 20 Strep 91 3.4.3 93 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus kỹ thuật đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) PCR 3.4.3.1 Tách ADN tổng số 93 3.4.3.2 Nhận dạng vi khuẩn kỹ thuật RFLP đoạn gen mã hoá cho ARNr 16S 93 3.4.3.3 Nhận dạng vi khuẩn kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu gen dextranse Streptococcus mutans 95 3.4.4 Một số đặc điểm sinh lý chủng vi khuẩn Streptococcus mutans H1, H2 H3 96 3.4.4.1 Khả sinh axit S mutans H1, S mutans H2 S mutans H3 96 3.4.4.2 Khả chịu axit chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam 97 3.4.4.3 Giải trình tự gen mã hóa ARNr 16S S mutans H2 phân lập từ 98 người Việt Nam 3.4.5 Nghiên cứu tác dụng dịch chiết Sao đen Sắn thuyền lên S mutans H2 phân lập từ người Việt Nam 100 3.4.5.1 Tác dụng dịch chiết Sao đen Sắn thuyền lên khả sinh 100 axit S mutans H2 3.4.5.2 Tác dụng dịch chiết Sao đen Sắn thuyền với việc diệt tế bào S mutans H2 100 3.4.5.3 Nghiên cứu tác dụng axit asiatic, hopea phenol malibatol A 101 lên hoạt độ số enzyme S mutans H2 THẢO LUẬN 104 KẾT LUẬN 113 ĐỀ NGHỊ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 137 MỞ ĐẦU Sâu số bệnh miệng phổ biến có xu hướng tăng lên đặc biệt nước phát triển Sự gia tăng bệnh thay đổi lối sống, thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống hàng ngày tuổi thọ trung bình Theo số liệu điều tra gần Viện Răng Hàm Mặt Trung ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc bệnh răng, miệng, phổ biến sâu viêm quanh Bệnh sâu không gây ảnh hưởng tới tình trạng sức khoẻ người bệnh mà cịn gây nhiều chi phí tốn chữa trị.Tổ chức Sức khỏe giới (WHO) xếp sâu số bệnh nguy hiểm lồi người Nhiều chương trình nghiên cứu khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa phịng chống bệnh WHO thực năm qua Mặc dù tỷ lệ sâu cộng đồng dân cư giảm đáng kể trì mức cao địi hỏi phải có biện pháp dự phòng tốt để đạt mục tiêu mà WHO đưa Cách tốt để hạn chế bệnh sâu vệ sinh răng, miệng thường xuyên cách với việc hạn chế dùng thức ăn, đồ uống có nhiều đường Tuy vậy, phương pháp vệ sinh miệng, thói quen ăn uống khơng phải lúc thực được, việc sử dụng chất có khả kháng khuẩn fluo, axit yếu, muối kim loại biện pháp để phòng chống sâu Trong số chất kháng khuẩn sử dụng fluo chất có hiệu cả.Tuy nhiên, việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao dẫn đến chứng nhiễm fluo (fluorosis) làm men ố vàng trở nên sần sùi (Hamilton, 1990; Aeba, 2002) Chính lý mà xu hướng tìm kiếm hợp chất mới, thay phần fluo mà có hiệu chống sâu cao Hiện nay, việc tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ miệng xu hướng quan tâm nghiên cứu có nhiều ứng dụng thực tiễn Việt Nam có hệ thực vật vơ phong phú đa dạng, nhiều lồi có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học cao Từ ngàn xưa, cộng đồng dân tộc đất nước ta có truyền thống sử dụng cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe chống lại bệnh tật có bệnh sâu (Đỗ Huy Bích tập thể, 2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi tập thể, 2001) Tuy nhiên, đến việc tìm kiếm hợp chất chưa mang lại nhiều kết mong muốn Hơn nữa, nghiên cứu sâu chế tác dụng hợp chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu thiếu Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans” nằm xu nghiên cứu chung giới Việt Nam.Việc tiến hành đề tài cần thiết có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu phòng chống bệnh răng, miệng đặc biệt bệnh sâu Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu đề tài điều tra tác dụng chống sâu dịch chiết số loài thực vật Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng chúng lên q trình sinh lý, hố sinh, số enzyme hệ enzyme có liên quan vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans, từ nghiên cứu cách tách chiết, tinh vài hợp chất thứ cấp từ thực vật sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu chúng Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng số dịch chiết thực vật lên trình sinh axit gây sâu Streptococcus mutans tác dụng giết chết vi khuẩn dịch chiết  Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật từ lồi điều tra lên q trình sinh lý, hoá sinh vi khuẩn S mutans số enzyme phức hệ enzyme đích, liên quan đến tính chất gây sâu vi khuẩn  Phân lập số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm người Việt Nam bị sâu bước đầu nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật thu lên số q trình sinh lý, hố sinh số enzyme phức hệ enzyme liên quan chủng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập 3.3.2 Tách, tinh chất thứ cấp từ Sắn thuyền Để tách, tinh hợp chất thực vật thứ cấp từ Sắn thuyền thực theo quy trình tách chiết, tinh hopea phenol malibatol A từ vỏ Sao đen Chúng phát thấy phân đoạn chiết chloroform thể khả ức chế sinh axit S mutans GS-5 tốt phân đoạn lại Phân đoạn cho qua cột sắc ký sephadex LH 20 cho rửa chiết hệ dung môi chloroform: methanol với tỷ lệ methanol tăng dần, thu phân đoạn hợp chất khác ký hiệu ST1, ST2 ST3 Phân đoạn ST3 tiếp tục sắc ký qua cột sắc ký pha đảo RP-18 rửa chiết hệ dung môi methanol: acetone: nước theo tỷ lệ 2:1:2 thể tích Kết thu phân đoạn với băng kiểm tra sắc ký mỏng silicagel, ký hiệu ST3A 30 29 20 19 12 11 26 25 18 10 HO CH2OH 28 COOR 16 30 19 12 11 26 25 HO 15 Hình 3.24 Cấu trúc hoá học axit asiatic từ Sắn thuyền 2729 23 24 17 13 14 HO 21 22 20 18 17 13 14 16 21 22 28 COOR Phổ NMR của10 ST3A từ Sắn thuyền giống với phổ hợp chất triterpene có vịng cạnh với tín hiệu 137 27 30 cacbon trên4 phổ6 C-NMR So sánh kết phổ ST3A với phổ tương ứng asiaticoside cho thấy có phù hợp HO 23 vị trí cacbon hợp chất ST3A xác định axit asiatic với cơng thức phân tử C hồn tồn 29 30H48O5 (hình 3.24) CH OH 24 15 22 Djoukeng tập thể (2005) đề cập hợp chất nhóm terpene có tính kháng khuẩn từ loài Syzygium guineense Tuy nhiên nghiên cứu tinh hợp chất axit asiatic từ Syzygium resinosum Việt Nam 3.3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu axit asiatic 3.3.3.1 Tác dụng axit asiatic lên sinh axit ca S mutans GS-5 Giá trịpH Khi b sung axit asiatic nồng độ 15 mM vào huyền dịch Streptococcus mutans GS-5 (hình 3.26), chúng tơi thấy axit asiatic ức chế sản xuất axit S mutans GS-5, thể giá trị pH cuối (5,37) cao rõ rệt so với mẫu đối chứng (4,08) 7.5 6.5 5.5 4.5 Hình 3.26 Tác dụng ức chế sinh axit từ S mutans GS-5 axit asiatic Đối chứng (), axit asiatic () Ký hiệu (I) đồ thị giá trị SD với n = 20 40 60 80 10 Thêi gian (phót) 3.3.3.2 Tác dụng axit asiatic lên diệt vi khuẩn S mutans GS-5 Kết cho thấy axit asiatic từ Sắn thuyền có tác dụng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 rõ rệt Ở nồng độ 15 mM sau 15 phút pH có tới 90% số tế bào vi khuẩn S mutans GS-5 bị tiêu diệt (hình 3.27) 23 logN/No -1 Hình 3.27 Tác dụng diệt S mutans GS-5 axit asiatic Đối chứng (), Axit asiatic () Ký hiệu (I) đồ -2 -3 -4 thị giá trị SD với n = -5 20 40 60 thêi gian (phót) 3.3.3.3 Tác dụng axit asiatic lên hoạt ATPase ca S mutans GS-5 Hoạ t độ l¹ i (%) Kết (hình 3.28) cho thấy axit asiatic ức chế hoạt độ ATPase S mutans GS-5 Ở nồng độ 1,5 mM axit asiatic ức chế 50% hoạt độ ATPase 100 80 60 40 20 Hình 3.28 Tác dụng axit asiatic lên hoạt độ ATPase S mutans GS-5 Ký hiệu (I) đồ thị giá trị SD với n = 3 nång ®é ( mM) 3.3.3.4 Ảnh hưởng axit asiatic lên hoạt độ enzyme phosphotransferase (PTS) S mutans GS-5 Kết thu (hình 3.29) cho thấy axit asiatic với nồng độ 2,2 mM ức chế 50% hoạt độ photphotranspherase 24 Ho¹ t độ lạ i (%) 100 80 Hỡnh 3.29 Tỏc dụng axit asiatic lên hoạt độ photphotranspherase S mutans GS-5 Ký hiệu (I) đồ thị 60 40 20 giá trị SD với n = 0 nång ®é (mM) 3.3.3.5 Tác dụng axit asiatic lên hoạt độ số enzyme S mutans GS-5 Chúng tơi tìm hiểu tác dụng axit asiatic lên họat độ pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, NADH oxidase S mutans GS-5 phát thấy axit asiatic ức chế hoạt độ enzyme Nồng độ axit asiatic ức chế 50% hoạt độ pyruate kinase, lactate dehydrogenase NADH oxidase tương ứng 1,5 mM, 0,75 mM mM Tác dụng ức chế PTS, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase axit asiatic nguyên nhân làm cho sinh axit vi khuẩn S mutans GS-5 bị ức chế hợp chất dịch chiết Sắn thuyền Tác dụng ức chế NADH oxidase axit asiatic góp phần làm rõ nguyên nhân ức chế tiêu thụ oxy dịch chiết từ Sắn thuyền 3.4 Phân lập số chủng vi khuẩn S mutanns từ người Việt Nam Sử dụng môi trường Mitis Salivaius kết hợp với môi trường TSA pH axit, dựa hình thái khuẩn lạc hoạt tính catalase chúng tơi phân lập chủng vi khuẩn thuộc chi Streptococcus, kí hiệu S sp H1, S sp H2, S sp H3, S sp H4, S sp H5 S sp H6 Sử dụng kit API20 Strep dựa phản ứng hố sinh, chúng tơi sơ kết luận chủng S sp H1 thuộc loài S mutans Hai chủng S sp H4 S sp H5 thuộc loài S sanguis S sp H6 thuộc loài S constellatus Riêng đối 25 với chủng S sp H2 S sp H3, số ID thu tương đối thấp, cần nhận dạng thêm phương pháp khác xác 3.4.3 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus kỹ thuật RFLP PCR Để nhận dạng cách xác chủng Streptococcus sp H1, Streptococcus sp H2 Streptococcus sp H3, sử dụng đến kỹ thuật RFLP PCR Sử dụng cặp mồi 8UA 1492R thiết kế đặc hiệu cho đoạn gen ARNr 16S, nhân thành cơng đoạn gen mã hố cho ARNr 16S từ hệ gen chủng vi khuẩn phân lập Sản phẩm PCR đoạn gen ARNr 16S tinh cắt HpaII HaeIII, sau điện di kiểm tra gel agarose Kết (hình 3.38 3.39) cho thấy chủng vi khuẩn S sp H1, S sp H2 S sp H3 cho phổ băng tương tự chủng chuẩn S mutans GS-5¸ khác với phổ băng chủng chuẩn Streptococcus sanguis NCTC 10904 (cũng thuộc chi Streptococcus) Tiếp tục sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi SD1 SD2 thiết kết dựa trình tự hai đầu gen mã hoá dextranase đặc hiệu cho S mutans thấy chủng phân lập Việt Nam cho băng nhân với kích thước khoảng 1,3 kb, tương tự băng ADN nhân thu từ chủng chuẩn S mutans GS-5 Trong chủng Streptococcus sangius 10904 đối chứng khơng cho băng nhân 1,3 kb (hình 3.40) Các kết phân tích PCR RFLP cho phép khẳng định chủng S sp H1, S sp H2 S sp H3 thuộc loài S mutans (Sato tập thể, 2003) 500 bp Hình 3.38 Sản phẩm PCR 16S ARNr sau cắt HpaII Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S mutans GS-5 Giếng 3: S sangius NCTC-10904 26 Giếng 4: S sp H1 Giếng 5: S sp H2 Giếng 6: S sp H3 100 bp Hình 3.39 Sản phẩm PCR 16S ARNr sau cắt HaeIII Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 2: S mutans GS-5 Giếng 3: S sangius NCTC-10904 Giếng 4: S sp H12 Giếng 5: S sp H2 Giếng 6: S sp H3 500 bp Hình 3.40 Điện di gel agarose sản phẩm 100 bp PCR gen dextranase chủng S mutans phân lập Hình 3.38 Điện di gel agarose sản Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb phẩm PCR 16S ARNr sau cắt HpaII Giếng 2: S sangius NCTC-10904 1,5 kbGiếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb Giếng 3: S mutans GS-5 Giếng 2: S mutans GS-5 Giếng 4: S mutans H1 Giếng 3: S sangius NCTC-10904 Giếng 5: S mutans H2 Giếng 4: S sp H1 Giếng 6: S mutans H3 Giếng 5: S sp H2 Giếng 6: S sp H3 3.4.4 Một số đặc điểm sinh lý, hoá sinh chủng vi khuẩn S mutans H1, S mutans H2 S mutans H3 3.4.4.1 Khả sinh axit S mutans H1, S mutans H2 S mutans H3 27 Kết thí nghiệm sinh axit chủng S mutans thể hình 3.41 cho thấy chủng S mutans phân lập có khả sinh axit tốt, chí tốt chủng chuẩn S mutans GS-5, thể chỗ giá trị pH cuối mẫu thấp S mutans GS-5 Hình 3.41 Khả sinh axit chủng Streptococcus mutans S mutans GS- pH 5 (), S mutans H1 (), S mutans H2 (), S mutans H3 () 30 60 90 thời gian ( phút) 3.4.4.2 Khả chịu axit chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam Cùng với khả sinh axit mạnh khả chịu axit đặc trưng quan trọng vi khuẩn S mutans Kết kiểm tra khả chịu axit (ở pH 3) chủng S mutans phân lập từ người Việt Nam (hình 3.42) cho thấy chủng S mutans H1, S mutans H2 S mutans H3 có khả chịu axit tốt, chí tốt chủng chuẩn S mutans GS-5, thể giá trị D chủng lớn giá trị D S mutans GS-5 28 Hình 3.42 Khả chịu axit chủng Streptococcus mutans phân lập từ người Việt Nam S mutans GS-5 (), Log N/No -0.5 -1 -1.5 S.mutans H1 (), S mutans H2 (), S mutans H3 () -2 -2.5 10 20 30 Thời gian (phút) 3.4.5 Nghiên cứu tác dụng dịch chiết Sắn thuyền Sao đen lên Streptococcus mutans H2 phân lập từ người Việt Nam Trong phần nghiên cứu lựa chọn chủng Streptococcus mutans H2 phân lập từ người Việt Nam để nghiên cứu số chủng Streptococcus mutans phân lập chủng S mutans H2 có khả sinh axit mạnh chịu axit tốt so với chủng lại, mặt khác S mutans H2 khác S mutans GS-5 chuẩn số đặc điểm sinh hóa khả chuyển hóa số loại đường L- arabinose, D- mannitol, Inulin Các kết nghiên cứu thu cho thấy dịch chiết vỏ Sao đen Sắn thuyền với nồng độ 10% (v/v) có tác dụng ức chế sinh axit S mutans H2 tiêu diệt chủng vi khuẩn pH với giá trị D (tương đương 90% số vi khuẩn bị giết) tương ứng 22 phút 25 phút Axit asiatic, hopea phenol, malibatol A tách từ Sắn thuyền vỏ Sao đen với nồng độ từ đến 1,6 mM ức chế 50% hoạt độ enzyme ATPase PTS S mutans H2 Các kết thu tương tự tác dụng hợp chất tinh chủng chuẩn Streptococcus mutans GS-5 29 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu rút kết luận sau: Dịch chiết ethanol Chàm tía, Hương nhu trắng, Kim ngân, Quỷ trâm thảo, Sài đất, Sao đen Sắn thuyền có tác dụng ức chế sinh axit vi khuẩn gây sâu S mutans GS-5, tác dụng tăng lên dịch chiết phối hợp với NaF H2O2 Các dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế hình thành biofilm giết vi khuẩn S mutans GS-5 Đặc biệt dịch chiết Sao đen Sắn thuyền có tác dụng giết vi khuẩn S mutans GS-5 pH mạnh gấp lần pH Dịch chiết Sắn thuyền Sao đen có tác dụng giết số lồi vi khuẩn đường miệng khác S sanguis, S gordonii S rattus Đã tách chiết, tinh xác định cấu trúc hoá học hai hợp chất thực vật thứ cấp thuộc thuộc nhóm oligostilben hopea phenol (C56H42O12) malibatol A (C28H20O7) từ dịch chiết vỏ Sao đen hợp chất thứ cấp nhóm terpene axit asiatic (C30H48O5) từ dịch chiết Sắn thuyền Hopea phenol, malibatol A tách từ vỏ Sao đen axit asiatic tách từ Sắn thuyền ức chế hoạt độ enzyme phosphoryl hoá đường-PTS (IC50 tương ứng 0,75 mM, 0,75 mM mM), lactate dehydrogenase (IC50 tương ứng 2,5 mM, 2,3 mM 0,75 mM), pyruvate kinase (IC50 tương ứng 2,5 mM, 2,2 mM 1,5 mM) liên quan đến trình sinh axit, ATPase (IC50 tương ứng 1,2 mM, 0,75 mM 1,5 mM) liên quan đến trình chịu axit, NADH oxidase (IC50 tương ứng 1,5 mM, mM mM) liên quan đến trình tiêu thụ oxy S mutans GS-5 Đã phân lập chủng vi khuẩn S.mutans H1, S mutans H2 S mutans H3 từ người Việt Nam nhờ việc nuôi cấy vi khuẩn môi trường Mitis salivarius chọn lọc có pH thấp, kết hợp phân tích hình thái tế bào với phân tích đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn gen mã hóa cho ARNr 16S nhân PCR Chủng vi khuẩn S mutans H2 có trình tự đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S mức độ tương đồng 100% so với trình tự đoạn gen S mutans công bố Genbank 30 Tác dụng dịch chiết Sao đen Sắn thuyền axit asiatic, hopea phenol malibatol A lên chủng vi khuẩn S mutans H2 phân lập từ người Việt Nam tương tự lên chủng chuẩn S mutans GS-5 khả ức chế sinh axit, giết vi khuẩn ức chế hoạt độ ATPase, PTS ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chế tác dụng axit asiatic từ Sắn thuyền (Syzygium resinosum G) hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen (Hopea odorata R) lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans để ứng dụng chúng vào việc bảo vệ răng, miệng DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC Đà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN 1) Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa, 2005 Tìm hiểu tác dụng chống sâu dịch chiết vỏ Sao Đen (Hopea odorata Roxb) Tạp chí Dược học 45 (350): 13-19 2) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2005 Inhibition of acid production by Streptococcus mutans of some medicinal plant extracts Tạp chí Khoa học 21(2): 161-168 3) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2006, Antibacterial activity of some medicinal plants against dental caries pathogen Streptococcus mutans The first international conference on science and technology for sustainable development of the greater Mekong Sub-region, Khon Kaen, Thailand p 10 4) Nguyen Quang Huy, Phung Thi Thu Huong, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2006 Inhibitory effects of Syzygium resinogsum Gagnep extracts on caries-inducing properties of Streptococcus mutans Tạp chí Khoa học 22 (4): 131-136 31 5) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn Kiệm, 2007 Các oligostilben từ vỏ đen Hopea odorata Roxb Tạp chí Dược học 47 (372):37-39 6) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn Kiệm, 2007 Axít asiatic từ sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep tác dụng lên vi khuẩn Streptococcus mutans Tạp chí Dược học 47 (375):19-22 7) Nguyễn Quang Huy, Phùng Thị Thu Hường, Phan Tuấn Nghĩa, 2007 Phân lập nhận dạng số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 291-297 8) Đỗ Thị Huê, Bùi Thanh Duyên, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, 2008.Tác dụng acid asiatic từ Sắn thuyền lên vi khuẩn Streptococcus mutans H2 phân lập từ người Việt Nam Hội nghị tồn quốc Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học Công nghệ thực phẩm 15-17/10-2008 trang 56-59 32 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN QUANG HUY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG Streptococus mutans Chuyên ngành: HỐ SINH HỌC 33 Mã số: 62.42.30.15 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2009 34 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa TS Dương Văn Hợp Phản biện Luận án bảo vệ trước hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2009 35 Có thể tìm luận án Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm thông tin- Thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội 36 ... chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu thiếu Đề tài: ? ?Nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans? ?? nằm xu nghiên cứu chung giới Vi? ??t Nam .Vi? ??c...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUANG HUY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG STREPTOCOCCUS MUTANS Mã số : 62. 42. 30. 15 LUẬN... tính chất gây sâu vi khuẩn  Phân lập số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm người Vi? ??t Nam bị sâu bước đầu nghiên cứu tác dụng số chất thứ cấp từ thực vật thu lên số trình sinh