Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (cayratia trifolia) ở đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia) Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS Hà Thanh Tồn PGS.TS Ngơ Thị Phương Dung Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp sở Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu – Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ Vào lúc 14 00 ngày 03 tháng 04 năm 2020 Phản biện 1: PGS.TS.Nguyễn Đức Hồng Phản biện 2: PGS.TS.Nguyễn Minh Thủy Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Doan Thi Kieu Tien, Ha Thanh Toan and Ngo Thi Phuong Dung, 2016 Exploration of yeasts applied for wine fermentation from Cayratia trifolia in the Mekong Delta The 12th Young Scientist Seminar; Nov 22nd-23rd, Yamaguchi Prefectural Seminar park, Yamaguchi, Japan, 19 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Hoàng Anh, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Hà Thanh Toàn Ngô Thị Phương Dung, 2017 Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) tỉnh Kiên Giang” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 54-62 Đồn Thị Kiều Tiên, Viên Thị Hải Yến, Huỳnh Xuân Phong, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Tồn Ngơ Thị Phương Dung, 2018 Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) từ tỉnh Hậu Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54(4B): 64-71 Đoàn Thị Kiều Tiên, Lữ Hằng Nghi, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Hà Thanh Toàn Ngô Thị Phương Dung, 2018 Phân lập tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.), Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng lâm nghiệp 55-64 Đồn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Nguyễn Đức Độ, Hà Thanh Tồn Ngơ Thị Phương Dung, 2018 Khảo sát hàm lượng polyphenol khả kháng oxy hóa dịch trái giác (Cayratia trifolia) trước sau lên men sử dụng nấm men chịu nhiệt Saccharomyces cerevisiae HG1.3, 2018 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 60-64 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Huỳnh Thị Hoàng Anh, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Tồn Ngơ Thị Phương Dung, 2018 Hoạt tính sinh học trái giác thu tỉnh Kiên Giang lên men rượu vang trái giác sử dụng Saccharomyces cerevisiae AG2.1 Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Báo cáo Khoa học proceeding Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2018 Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ 978-983 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Hà Thanh Tồn Ngơ Thị Phương Dung Hoạt tính sinh học trái giác từ tỉnh Cà Mau lên men rượu vang trái giác sử dụng Saccharomyces cerevisiae CM3.2, 2018 Kỷ yếu Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng sông Cửu Long 2018 “Thành tựu phát triển” 104 Doan Thi Kieu Tien, Huynh Xuan Phong, Mamoru Yamada, Ha Thanh Toan and Ngo Thi Phuong Dung, 2019 Characterization of newly isolated thermotolerant yeast and evaluation of their potential for use in Cayratia trifolia wine production, Vietnam Journal of Science,Technology and Engineering 68-73 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Toàn Ngô Thị Phương Dung, 2019 Đánh giá khả trì hàm lượng polyphenol hoạt tính kháng oxy hóa lên men rượu vang từ trái giác tỉnh Cà Mau sử dụng Saccharomyces cerevisiae CM3.2, Tạp chí Khoa học Tường Đại học Cần Thơ 55 (2019)(2): 285-291 Chương GIỚI THIỆU Tính cấp thiết đề tài Dây giác (Cayratia trifolia) loại dây leo mọc hoang dại trảng cỏ rừng thưa thuộc nước Trung Quốc, Lào, Campuchia, Ở Việt Nam dây giác phát triển dọc hàng rào, bụi rậm từ tỉnh miền Trung đến tỉnh miền Nam Vùng ĐBSCL, dây giác có hầu hết tất tỉnh, thành phố, đặc biệt dây giác loài thực vật phong phú đất U Minh Trong thành phần dây giác có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học cao (Tsao, 2010), trái giác có màu sắc hương vị đặc trưng chưa nghiên cứu khai thác Rượu vang có lịch sử hàng ngàn năm, nghiên cứu để đa dạng hóa chủng loại, cải tiến chất lượng Trong trình lên men rượu vang, yếu tố quan trọng nguồn nấm men Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến q trình nấm men chuyển hóa đường thành ethanol Hiện nay, nhiệt độ trái đất ấm dần lên tượng biến đổi khí hậu Nhiệt độ tăng cao ảnh hưởng đến khả lên men nấm men trình sản xuất rượu vang Do đó, việc ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt mang lại hiệu cho trình lên men Từ đó, yêu cầu phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt đánh giá khả lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) Đồng sông Cửu Long cần thiết Mục tiêu đề tài Cung cấp liệu trái giác đề xuất giải pháp cho trình lên men rượu vang trái giác giúp giải vấn đề ấm dần lên trái đất gia tăng nhiệt độ Qua đó, người dân khu vực vận dụng để thích nghi nhanh với biến đổi khí hậu khu vực khai thác giá trị nguồn trái giác có thiên nhiên để tăng thêm thu nhập Nội dung nghiên cứu (1) Thu thập đánh giá số đặc điểm hóa lý đặc tính kháng oxy hóa ngun liệu trái giác vùng ĐBSCL; (2) Phân lập xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men từ trái giác tự nhiên; (3) Tuyển chọn xác định mối quan hệ di truyền chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn có khả lên men rượu vang trái giác tốt; (4) Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt tốt tuyển chọn Những đóng góp đề tài - Xác định trái giác có chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mg GAE/mL có khả kháng oxy hóa từ 16,60 đến 82,86% - Phân lập 151 chủng nấm men từ trái giác tự nhiên vùng ĐBSCL thuộc năm giống Saccharomyces, Candida, Clavispora, Pichia Hanseniaspora - Xác định có 30 chủng nấm men tự nhiên trái giác có khả chịu nhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả phát triển mơi trường có nồng độ ethanol từ - 12% lên men dịch trái giác đạt hàm lượng ethanol từ 6% (v/v) trở lên - Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae HG1.3 có khả chịu nhiệt đến 43ºC, lên men rượu trái giác nhiệt độ 35ºC với pH ban đầu 4,5, 20 ºBrix mật số giống chủng 105 tế bào/mL, sau ngày lên men hàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v) Sản phẩm vang rượu trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả kháng oxy hóa 57,3% có tính đặc trưng màu sắc, hương vị Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan dây giác Giác loài thân leo, dây leo nhờ tua cuống mọc đối diện lá, dài khoảng 2-3 cm, thường phân nhánh (Kumar et al., 2011), có 4-5 nhánh có màu nâu đỏ có lơng, gân dọc Lá mọc cách kép hình lơng chim, có ghép lại thường to hai bên, có hình trứng thon nhọn dài Thân giác có tiết diện đa giác, thân già màu xanh, thân non màu nâu đỏ, nhiều gân dọc Hoa phát triển nách đứng, cao; hoa rộng 6-8 mm, đài hình dĩa, cánh hoa, xanh (Phạm Hoàng Hộ, 2000) Trái giác chứa nhiều nước, trái trịn dẹt, màu tím đen chín, đường kính khoảng 1cm (Sesagirriravu, 1986) Trái giác có chứa hàm lượng cao phenolic, mẫu dịch trích ethanol có khả kháng oxy hóa cao (Rabeta Lin, 2015) 2.2 Sơ lược nấm men Nấm men định nghĩa loại nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản vơ tính cách nảy chồi Tế bào nấm men có cấu tạo gồm: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất nhân tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1999) Nấm men tìm thấy nhiều mơi trường khác nước, khơng khí, đất, Nấm men thường có khả phát triển pH thấp hoạt động môi trường nước để giảm ức chế phát triển vi khuẩn (Kurtzman et al., 2011) Từ nay, người biết cách sử dụng nấm men để phục vụ cho sống từ khoa học, thực phẩm, y tế đến công nghiệp Đồ uống lên men thực phẩm sản xuất thông qua hoạt động nấm men sớm đóng góp bật cho tiến toàn giới phát triển bền vững xã hội loài người (Legras et al., 2007, Ulber Soyez, 2004) 2.3 Quá trình lên men rượu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men Sự phân giải hydratcarbon điều kiện kỵ khí gọi trình lên men (Nguyễn Lân Dũng, 1999) Lên men rượu q trình sinh hố phức tạp, địi hỏi có tham gia nấm men số vi sinh vật khác Trong trình lên men rượu, đường biến đổi thành ethanol CO2 Quá trình lên men rượu kèm theo hình thành sản phẩm đồng thời giải phóng lượng (Nguyễn Thành Đạt, 1986) Nấm men thông thường nhạy cảm với nhiệt độ, o 36 C nấm men bắt đầu bị ức chế Trong môi trường lỏng, nhiệt độ 40-50oC, nấm men ngưng hoạt động chết sau 30 phút; nhiệt độ 60-65oC, nấm men chết sau phút Trong môi trường khô (W=13%), nấm men chịu nhiệt tốt hơn, chịu đến 85-105oC Nhiệt độ cao, lên men hạn chế, hàm lượng ethanol thấp, lượng đường lại rượu nhiều, nồng độ đường cao gây ngừng trình lên men (Bùi Ái, 2003) Nhiệt độ tối ưu cho nấm men rượu vang phát triển 25-28oC (Casellas, 2005) Khi trình lên men diễn nhiệt độ thấp kéo dài thời gian hơn, lên men nhiệt độ cao ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm, hoạt tính nấm men bị giảm mạnh, dễ bị nhiễm lactic nấm men hoang dại Ngoài ra, lên men nhiệt độ cao, tạo nhiều ester aldehyde tổn thất rượu theo CO2 tăng (Nguyễn Đình Thưởng Nguyễn Thanh Hằng, 2005) 2.4 Nấm men chịu nhiệt Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động nấm men Arthur Watson (1976) xác định nhiệt độ phát triển nấm men ưa lạnh (psychrophilic) khoảng 2-20ºC; nấm men ưa nhiệt độ trung bình (mesophilic) 5-35ºC; nấm men chịu nhiệt (thermotolerant) 8-42ºC nấm men ưa nhiệt (thermophilic) 28- 45ºC Theo Roehr (2001), nấm men chịu nhiệt có số thuận lợi việc sản xuất ethanol điều kiện nhiệt độ cao bao gồm hoạt động trao đổi chất tốt tốc độ lên men cao tạo nhiều sản phẩm; độ hịa tan oxy khí khác nước giảm nhiệt độ tăng đảm bảo điều kiện kỵ khí cho q trình lên men; độ nhớt môi trường lên men giảm nhiệt độ tăng nên lượng cần thiết cho việc đảo trộn mơi trường giảm hội bị nhiễm giảm thiểu Vì vậy, để đạt trình lên men nhiệt độ cao, cần có chủng nấm men lên men hiệu khả chịu nhiệt cao (Limtong et al., 2007) Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thu thập, đánh giá đặc điểm trái giác Trái giác thu từ 53 địa điểm khác thuộc 13 tỉnh, thành phố vùng ĐBSCL Sau thu, chọn trái chín, rửa sạch, để Xác định đặc điểm hình dạng, kích thước, màu sắc trái Dịch ép trái giác đo pH, độ Brix; xác định hàm lượng đường, hàm lượng polyphenol khả kháng oxy hóa khả bắt gốc tự DPPH (%) trái giác 3.2 Phân lập chủng nấm men từ trái giác tự nhiên xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Trái giác thu thực phân lập nấm men môi trường nuôi tăng sinh YPD Dịch tăng sinh pha loãng cấy trải, cấy chuyền môi trường YPD agar nhiều lần đến khuẩn lạc ròng, bảo quản tủ lạnh 4oC Các chủng nấm men chủng xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa hình thái, khả lên men loại đường saccharose, maltose glucose, hoạt tính phân giải urea, thủy phân gelatin, cách nảy chồi, đặc điểm hình thành bào tử để phân loại sơ đánh giá khả lên men ethanol 3.3 Tuyển chọn, định danh xác định mối quan hệ chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn có khả lên men rượu vang trái giác tốt 3.3.1 Đánh giá khả chịu nhiệt chủng nấm men Các chủng nấm men phân lập cấy ria petri có chứa mơi trường YPD agar Ủ đĩa petri nhiệt độ khác nhau: 30ºC, 35ºC, 37ºC, 39ºC, 41ºC, 43ºC, 45ºC 47ºC 48 Quan sát hình thành khuẩn lạc chủng nấm men điều kiện nhiệt độ cao thời gian 48 để tuyển chọn chủng nấm men có khả sinh trưởng phát triển nhiệt độ cao 3.3.2 Đánh giá khả chịu ethanol chủng nấm men Nhằm tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt có khả phát triển mơi trường có ethanol Các chủng nấm men chịu nhiệt chọn từ 3.2.3.1 cấy ria mơi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết 3%, 6%, 9%, 12%, 15% v/v mẫu đối chứng 0% Các đĩa petri ủ nhiệt độ 30ºC thời gian 48 Quan sát hình thành khuẩn lạc chủng nấm men điều kiện mơi trường có nồng độ ethanol khác 3.3.3 Đánh giá khả lên men ethanol nấm men chịu nhiệt Các chủng nấm men tăng sinh chủng mL vào ống nghiệm có chng Durham úp ngược chứa mL dung dịch đường glucose 2% (w/v) khử trùng 121ºC 20 phút Tương tự, chủng mL dịch tăng sinh nấm men vào ống nghiệm có chng Durham úp ngược chứa mL dịch trái giác điều chỉnh pH=4 22ºBrix Lắc để dung dịch đường dịch trái giác tràn đầy vào chuông Durham bên ống nghiệm Đo chiều cao cột khí chng Durham sau 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 48 ủ nhiệt độ phòng (2830ºC) để xác định khả lên men ethanol Kết xử lý chương trình Microsoft Office Excel 2010 phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XV Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đặc điểm trái giác ĐBSCL Kết quan sát hình dạng bên ngồi 53 mẫu trái giác thu 13 tỉnh, thành phố thuộc ĐBSCL cho thấy có hai dạng chủ yếu trái tròn trái dẹp, số vùng có trái trịn dẹp Bề mặt trái bóng nhám, kích thước trung bình khoảng 1,5 – cm, màu đen sậm (Hình 4.1) Bảng 4.1: Đặc điểm dạng trái giác vùng ĐBSCL STT Hình Đặc điểm Trái dạng trịn, bề mặt trái nhám, có màu đen sậm, kích thước khoảng 1,5 – 2,0 cm Bề mặt khơng có lơng, bìa có cưa Trái có dạng hình dẹp, có màu đen sậm, kích thước khoảng 1,5 - 1,7 cm Bề mặt có lơng, bìa có nhiều cưa Trái giác có giá trị pH ºBrix khác tùy thuộc vào vị trí thu mẫu trái; điều kiện tự nhiên, khí hậu địa điểm thu trái giác khác giá trị pH ºBrix khác Giá trị pH khoảng từ 3,01- 4,75, ºBrix tương đối từ 3,510,0 Trong trái giác, hàm lượng đường tổng từ 0,41-2,17 g/100 mL, hàm lượng đường khử mẫu trái giác nằm khoảng từ 0,22 - 0,96 g/100 mL Dịch trái giác chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 - 1,54 mg GAE/mL có khả bắt gốc tự từ 16,6 - 82,86% Kết phù hợp với nghiên cứu Rabeta Lin (2011), khả bắt gốc tự DPPH dịch trái giác tươi 61,47% 4.2 Phân lập chủng nấm men từ trái giác tự nhiên xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Từ 53 nguồn trái giác khác 13 tỉnh, thành phố vùng ĐBSCL phân lập chủng nấm men tự nhiên gồm 151 chủng Kết cho thấy, phong phú đa dạng nấm men tự nhiên trái giác, đồng thời có tương đồng với cơng trình công bố phân lập 50 chủng nấm men từ viên men rượu ĐBSCL (Ngô Thị Phương Dung, 2009), 40 chủng nấm men từ phụ phẩm nông nghiệp vỏ ca cao, vỏ khóm, bã mía, rơm mùn cưa, 28 chủng nấm men từ trái, có múi (Dung Phong et al., 2016; Nuanpeng et al., 2016; Phong et al., 2016; Techaparin et al., 2017) Đặc điểm hình thái 151 chủng nấm men có nhóm hình dạng: hình cầu nhỏ, hình cầu lớn, hình ovan nhỏ, hình ovan lớn, hình elip ngắn, hình elip dài hình elip nhọn Đặc điểm hình thành bào tử cho thấy từ nhóm đến cho bào tử hình trịn, trừ nhóm Kết khả lên men loại đường glucose, saccharose maltose; hoạt tính phân giải urea, thủy phân gelatin chủng nấm men cho thấy có 140 chủng có khả lên men đường glucose, 104 chủng có khả lên men đường saccharose, 108 chủng có khả lên men đường maltose, 24 chủng có hoạt tính phân giải urea 30 chủng có khả phân giải gelatine Theo mô tả phân loại sơ 10 đến giống Kurtzman Fell (1998), cho thấy 151 chủng nấm men phân loại thuộc giống Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia Cadida 4.3 Tuyển chọn, định danh xác định mối quan hệ chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn có khả lên men rượu vang trái giác tốt 4.3.1 Khả chịu nhiệt chủng nấm men Sự phát triển 151 chủng nấm men cho thấy mức nhiệt độ 30ºC 35oC, tất chủng nấm men phát triển tốt Trong 151 chủng nấm men có 141 chủng nấm men có khả phát triển 37oC Ở nhiệt độ 39oC, có 121 chủng nấm men có khả phát triển Khi nhiệt độ môi trường tăng lên 41oC, có 89 chủng nấm men có khả phát triển, đến mức nhiệt độ mơi trường 43oC có 48 chủng phát triển Ở mức nhiệt độ 45oC cịn 10 chủng phát triển Tất chủng nấm men phân lập phát triển 47oC Kết chọn 141 chủng có khả phát triển 37oC 4.3.2 Khả chịu ethanol chủng nấm men chịu nhiệt Hầu hết chủng nấm men phát triển mơi trường có nồng độ ethanol 3%, trừ chủng VL4.4 phân lập từ trái giác huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long Khi tăng nồng độ ethanol mơi trường khả phát triển nấm men giảm, có 128 chủng nấm men có khả phát triển mơi trường có nồng độ ethanol 6%, 64 chủng nấm men có khả phát triển mơi trường có nồng độ ethanol 9% Ở giá trị nồng độ ethanol 12% cịn 27 chủng phát triển Khi nồng độ ethanol 15% tất chủng khơng phát triển Theo Casey Ingledew (1986), khả chịu đựng hàm lượng ethanol đa số chủng nấm men sản 11 xuất rượu bia vào khoảng 5-10 % (v/v) ethanol Kết quả, tuyển chọn 64 chủng có khả chịu cồn từ 9% đến 12% v/v ethanol để đánh giá khả lên men ethanol 4.3.3 Tuyển chọn chủng nấm có khả lên men ethanol Theo Lương Đức Phẩm (2005), trình sống nấm men sinh lượng khí CO2 lớn Sản phẩm tạo thành điều kiện kỵ khí nấm men để sinh rượu ethylic, CO2 sản phẩm phụ khác Lượng CO2 sinh đẩy ống Durham nên giá trị chiều cao cột khí CO2 giúp đánh giá sơ khả lên men chủng nấm men Sáu mươi bốn chủng nấm men hầu hết có khả chuyển hóa glucose thành ethanol với chiều cao cột khí sinh ống Durham tăng theo thời gian Chủng KG2.2, KG3.1, DT1.2, CM3.2 BT1.2 đạt chiều cao cột khí 30 mm Hai chủng nấm men KG4.1 AG3.2 khơng có khả lên men Kết đánh giá khả lên men ethanol dịch trái giác sơ tuyển 57/64 chủng có khả lên men ethanol, sinh khí chiếm đầy thể tích chng Durham 30 mm 48 4.3.4 Lên men rượu vang trái giác Thử nghiệm lên men rượu vang trái giác 57 chủng nấm men đánh giá khả lên men rượu vang trái giác 100 mL dịch trái giác Sau lên men, pH độ Brix dịch trái giác giảm so với pH độ Brix ban đầu (pH=4,5; Brix=22o) trình lên men, nấm men sử dụng đường làm nguồn carbon Vì vậy, đường bị chuyển hóa qua chuỗi phản ứng enzyme để tạo thành sản phẩm cuối lên men ethanol CO2 (Lê Ngọc Tú et al., 2005) Hàm lượng ethanol 12 tiêu quan trọng để đánh giá khả lên men rượu chủng nấm men Kết cho thấy chủng nấm men HG1.3 có khả lên men sinh hàm lượng ethanol 9,9% (v/v) 4.3.5 Tên khoa học mối quan hệ di truyền chủng nấm men có khả chịu nhiệt, chịu ethanol khả lên men rượu vang trái giác Từ kết khảo sát khả lên men mục 4.3.4 tuyển chọn 30/57 chủng nấm men có khả lên men đạt nồng độ ethanol từ 6,0% (v/v) trở lên Kết định danh 30 chủng nấm men thể Bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết định danh 30 chủng nấm men STT Giống Candida Loài Candida tropicalis Candida nivariensis Candida glabrata Pichia Pichia kudriavzevii Clavispora lusitaniae Saccharomyces Chủng KG1.1, nấm KG3.2, men CM3.3, DT1.2, HG3.3, ST2.1, TG1.1 BT1.2 BL2.1, CT1.1, CT1.3, CT2.3 KG5.1, AG2.3, Số lượng chủng5 AG4.2, CM4.4, Clavispora TG4.2 BT2.1, BT3.3, Saccharomyces HG1.3, CM3.2, CT4.2, VL1.1 AG2.1, TV4.2, Tổngcerevisiae số 30 DT3.2, LA1.3, Mối quan hệ di truyền 30 chủng KG2.1,nấm TG3.1,men Xây dựng phát sinh loài dựa HG2.1 phần mềm MEGA (Neighbor-Joining) Cây phát sinh loài 30 chủng nấm men tuyển chọn thể Hình 4.1 Kết định danh thể đa dạng giống, loài chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn từ trái giác Kết có phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Lân Dũng ctv (2019 hay theo Basso et al (2008), Saccharomyces cerevisiae chủng nấm men truyền thống ứng dụng phổ biến lên men rượu 13 Hình 4.1: Mối quan hệ phát sinh lồi 30 chủng nấm men Ghi chú: Chỉ số nhánh: số boostrap 1.000 : khoảng cách di truyền 4.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho trình lên men rượu vang trái giác 4.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men pH Kết thay đổi độ Brix, pH hàm lượng ethanol lên men sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt S cerevisiae HG1.3 cho thấy nhiệt độ pH khác khả lên men rượu chủng HG1.3 khác (Bảng 4.3) Nghiệm thức pH 4,5 nhiệt độ phòng 35oC cho kết hàm lượng ethanol cao (12,82-12,53% v/v), khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Arthur Watson (1976) xác định nấm men chịu nhiệt có nhiệt độ phát triển khoảng 8-42oC Nấm men chịu nhiệt có khoảng nhiệt độ tối thiểu (Tmin), tối ưu (Topt), tối đa (Tmax) tương ứng 20-26oC, 26-35oC 37-45oC phát triển nhiệt độ 45oC Như vậy, cho thấy kết lên men với giá trị pH 4,5 mức nhiệt độ 35°C lựa chọn đáp ứng mục đích tuyển chọn nấm men chịu nhiệt có phù hợp với nghiên cứu công bố Nhiệt độ pH chọn cho thí nghiệm 14 Bảng 4.3: Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến trình lên men STT Nhiệt độ-pH pH sau lên men Brix Sau lên men Hàm lượng ethanol (% v/v) quy 20ºC nhiệt độ phòng –TN 3,57 8,17 11,68c 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nhiệt độ phòng -4,0 nhiệt độ phòng -4,5 nhiệt độ phòng -5,0 35-TN 35-4,0 35-4,5 35-5.0 37-TN 37-4,0 37-4,5 37-5,0 39-TN 39-4,0 39-4,5 39-5,0 41-TN 41-4,0 41-4,5 41-5,0 3,95 4,42 4,64 3,55 3,95 4,24 4,62 3,55 3,93 4,31 4,90 3,46 3,84 4,22 4,07 3,23 3,41 4,04 4,22 6,33 7,33 7,50 9,00 9,00 9,00 9,00 11,17 11,00 10,67 12,00 13,00 12,00 12,00 11,00 14,67 15,00 16,00 16,00 11,85bc 12,82a 10,53ef 11,55cd 11,68c 12,53ab 9,79fg 9,57g 9,87fg 10,78de 9,14gh 7,98ij 7,99ij 8,45gh 7,21ij 5,98k 5,98k 5,98k 5,19k Ghi chú: Các số liệu bảng kết trung bình lần lặp lại; Các chữ số mũ số liệu giống nhau, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 5% 4.4.2 Ảnh hưởng mật số giống chủng, độ Brix thời gian lên men đến trình lên men rượu vang trái giác Trong lên men, hàm lượng ethanol có liên quan hàm lượng chất khơ mơi trường Hàm lượng chất khô thấp, nấm men bị thiếu nguồn dinh dưỡng dẫn đến giảm số lượng sản phẩm tăng hàm lượng đường cao nồng độ ethanol bị giảm hàm lượng đường cao làm tăng áp suất thẩm thấu, cân trạng thái sinh lý nấm men (Tahir et al., 2010) Mật số nấm men thời gian lên men yếu tố ảnh hưởng đến lên men Ảnh hưởng mật số giống chủng, oBrix thời gian lên men sử dụng chủng S cerevisiae HG1.3 thể Bảng 4.4 15 Bảng 4.4: Ảnh hưởng mật số giống chủng, oBrix thời gian lên men o Ngày- oBrix-Mật số Brix Hàm lượng STT o nấm men sau lên men ethanol 20 C (% v/v) - 20 - 103 8,67 11,40bc 20oC (% v/v) 7,33 13,47a - 20 - 10⁵ - 20 - 10⁷ 7,00 12,00bc - 22 - 103 8,67 11,40bc 5 - 22 - 10⁵ 8,33 12,30ab - 22 - 10⁷ 8,67 11,67bc - 24 - 103 11,67 11,40bc - 24 - 10⁵ 10,76 11,07bc – 24 - 107 11,33 10,83cd 10 - 20 - 103 7,67 11,40bc 11 - 20 - 10⁵ 8,33 12,30ab 12 - 20 - 10⁷ 9,33 11,07bc 13 - 22 - 103 9,00 11,40bc 14 - 22 - 10⁵ 9,00 12,30ab 15 - 22- 10⁷ 11,67 10,83cd 16 - 24 - 103 10,33 10,77cd 17 - 24 - 10⁵ 10,33 11,07bc 18 - 24 - 10⁷ 11,67 10,83cd 19 - 20 - 103 8,33 10,83cd 20 - 20 - 10⁵ 8,67 21 - 20 - 10⁷ 9,67 10,77cd 22 - 22 - 103 9,33 10,83cd 23 - 22 - 10⁵ 10,00 10,87c 24 - 22 - 10⁷ 10,67 9,53de 25 - 24 - 103 9,00 8,86ef 26 - 24 - 10⁵ 10,33 8,05f 27 - 24 - 10⁷ 12,67 8,05f 10,77cd Ghi chú: Các số liệu bảng kết trung bình lần lặp lại; Các chữ số mũ số liệu giống nhau, khác biệt ý nghĩa thống kê 5% 16 Phân tích chương trình Statgraphics Centurion XV với độ tin cậy 95% Phương trình hồi quy (1) thiết lập sau: H= -27,4471 + 1,58638Z+ 3,66409Y+ 5,10075X 0,019213Z2 - 0,124219ZX - 0,0769965ZY- 0,124352Y2 - 0,181007YX - 0,174352X2 + 0,00619792ZYX (1) Trong đó: H= hàm lượng ethanol, X= ngày, Y=mật số, Z= ºBrix Cố định ºBrix 20 ( Z= 20), lấy đạo hàm theo biến số Giải hệ phương trình H(X’) = H(Y’) = 0, giá trị X= 5,8; Y= 5,04 Thay giá trị vào phương trình (1) H = 12,37% (v/v) Vậy điều kiện tối ưu để lên men dịch trái giác chủng S.cerevisiae HG1.3 ngày lên men, mật số nấm men 105 tb/mL, 20 oBrix, pH ban đầu 4,5 35ºC với hàm lượng ethanol đạt theo lý thuyết H= 12,37% Phương trình hồi quy kiểm chứng tương tích lên men rượu vang trái giác quy mô L Kết nhận hàm lượng ethanol 12,0% (v/v) (Bảng 4.5) Như vậy, kết kiểm chứng cho thấy phù hợp phương trình hồi quy tương đương với nghiên cứu lên men rượu vang dưa hấu (Ngô Thị Phương Dung ctv, 2011), rượu vang khóm (Huỳnh Xuân Phong ctv, 2017) Chất lương rượu vang trái giác kiểm nghiệm 15 tiêu thể Bảng 4.5 So sánh kết tiêu kiểm nghiệm với QCVN 6-3:2010/BYT đánh giá chất lượng rượu vang cho thấy tiêu đạt theo quy định Đặc biệt, sản phẩm rượu vang trái giác có chứa 0,60 mg GAE/mL, có khả bắt gốc tự DPPH 57,3% nên rượu có khả kháng oxy hóa giúp bảo vệ thể 17 Bảng 4.5: Kiểm nghiệm rượu vang trái giác QCVN 6-3:2010/BYT Nhận xét STT Chỉ tiêu Kết Ethanol 12,0% v/v 20°C ≥ 8% v/v 20°C Đạt Methanol 2,534 g/L rượu 100° 10g/L rượu 100° Đạt SO2 1,4 mg/L 350 mg/L Đạt pH 4,17 - Tự công bố º Brix 12 - Tự công bố Hàm lượng đường khử 0,26 g/100 mL - Tự công bố Acid hydrocyanic g/L 0,1 mg/L Rượu bậc cao, tính theo methyl 2-propanol 2,425 g/L rượu 100° - Aldehyde 0,638 g/L rượu 100° - 10 E coli CFU/ mL sản phẩm CFU/ mL Đạt 11 Coliforms 10 CFU/ mL sản phẩm Đạt 12 7,2 x 102 CFU/g 13 Tổng số vi sinh vật hiếu khí Tổng số nấm men – mốc ≤ 10 CFU/ mL hẩm 103 CFU/g 3,6 x 10 CFU/g 10 CFU/g 14 Hàm lượng polyphenol 0,60 mg GAE/mL - 15 Khả bắt gốc tự DPPH 57,3a±3,73% - Đạt Tự công bố Tự công bố Đạt Đạt Tự công bố Tự công bố Đánh giá cảm quan rượu vang trái giác thực theo thang điểm từ 0-5 với tiêu chí (độ màu sắc, mùi, vị, ý thích mẫu thử) dựa theo tiêu phương pháp đánh giá cảm quan phương pháp cảm quan cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN-3217:79 Rượu vang trái giác sử dụng chủng HG1.3 có độ màu sắc rượu đạt 4,9 điểm, mùi đạt 4,6 điểm, vị đạt 4,0 điểm, ý thích rượu đạt 4,2 điểm 18 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trái giác vùng ĐBSCL có hai dạng trái trịn trái dẹt, trái chín màu tím đen, đường kín trung bình trái 1,5 cm Dịch trái giác có màu tím đặc trưng, giá trị pH 3,01-4,75, giá trị độ Brix 3,5-10,0, hàm lượng đường tổng số 0,47-2,17 g/100mL, hàm lượng đường khử 0,22-0,96 g/100mL Đặc biệt, dịch trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,47-1,54 mg GAE/mL khả kháng oxy hóa 16,6-82,86% Đây nguồn nguyên liệu tiềm cho ngành sản xuất rượu vang giúp tăng thu nhập cho người dân vùng nguyên liệu Phân lập chủng nấm men tự nhiên gồm 151 chủng từ 53 nguồn trái giác khác vùng ĐBSCL Kết phân loại sơ chủng nấm men từ đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cho thấy 151 chủng nấm men thuộc giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia Cadida Trong giống Saccharomyces phân bố rộng rãi diện với số lượng lớn nhiều mẫu trái giác Xác định 64/151 chủng có khả phát triển nhiệt độ 370C mơi trường có nồng độ ethanol từ đến 12% v/v Tuyển chọn 30/64 chủng nấm men chịu nhiệt từ 37 đến 45◦C, có khả phát triển nồng độ ethanol môi trường từ - 12% lên men sinh ethanol đạt từ 6% (v/v) điều kiện chưa tối ưu hóa Kết giải tình tự với kết phân tích hình thái, sinh hóa 30 chủng nấm men cho thấy chủng thuộc bốn giống Saccharomyces, Candida, Pichia Clavispora Trong đó, Saccharomyces cerevisiae HG1.3, CM3.2, AG2.1, TV4.2, DT3.2, LA1.3, KG2.1, TG3.1 HG2.1 chủng có quan hệ gần với có mức độ tin cậy cao với số bootstrap 100% 19 Điều kiện thích hợp lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt S cerevisiae HG1.3 20 o Brix, pH 4,5, mật số 105 tb/mL, thời gian ngày 35ºC Rượu vang trái giác có tính đặc trưng màu sắc, đạt yêu cầu chất lượng theo quy định Đặc biệt, rượu chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả kháng oxy hóa 57,3% giúp ích cho sức khỏe Quy trình lên men rượu vang trái giác đề nghị Hình 4.2 Trái giác chín Rửa sạch, để Ép Điều chỉnh 20º Brix pH = 4,5 Thanh trùng NaHSO3 (140 mg/L) Bổ sung 1% giống nấm men S cerevisiae HG1.3 Ủ kỵ khí 35ºC ngày Lọc Sản phẩm Hình 4.2: Quy trình lên men rượu vang trái giác 20 5.2 Đề xuất Nghiên cứu tác dụng dược học số thành phần khác polyphenol Nghiên cứu đặc điểm, chế biểu đặc tính chịu nhiệt gen chủng nấm men chịu nhiệt Đánh giá đặc tính chủng nấm men phân lập, tuyển chọn theo thời gian điều kiện tồn trữ TÀI LIỆU THAM KHẢO Arthur, H and K Watson, 1976 Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome compositionof psychrophilic, mesophilic and thermophilic yeast Journal of Bacteriology, 128(1): 58-68 Bùi Ái, 2005 Công nghệ lên men ứng dụng Công nghệ thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Casellas, I G., 2005 Effect of low temperature fermentation and nitrogen content on wine yeast metabolism Tarragona Casey, G.P and W M Ingledew, 1986 Ethanol tolerance in yeast Crit Rev Microbiol, 13(3):219–280 Dung, N T P., Thanonkeo, P., and Phong, H X., 2012 Screening useful isolated yeasts for ethanol fermentation at high temperature International Journal of Applied Science and Technology 2(4): 65-71 Kumar D S K., 2011 A review on chemical and biological properties of Cayratia trifolia Linn (Vitaceae) Pharmacognosy Reviews, 10:184-188 Kurtzman, C P and J W Fell, 1998 The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed, Elsevier, Amsterdam Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn Lê Dỗn Diên, 2002 Hóa sinh cơng nghiệp NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 389 trang Limtong S., Sringiew C., and Yongmanitchai W., 2007 Production of fuel ethanol at high temperature from sugar 21 cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus Bioresource Technology 98: 3367-3374 Lương Đức Phẩm, 2006 Nấm men công nghiệp NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 331 trang Ngô Thị Phương Dung, 2009 Khảo sát khả lên men tính chịu cồn nấm men Tạp chí Khoa học Trường ĐHCT 2009: 11 374-382 Nguyễn Đình Thưởng Nguyễn Thanh Hằng, 2005 Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 281 trang Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành Lê Thị Hịa, 2019 Vi sinh vật học NXB Khoa học Kỹ thuật Nuanpeng S., Thanonkeo S., Yamada M., and Thanonkeo P., 2016 Ethanol production from sweet sorghum juice at high temperatures using a newly isolated thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae DBKKU Y-53 Energies 9(4): 253 Phạm Hoàng Hộ, 2000 Cây cỏ Việt Nam II Nhà xuất trẻ 952 trang Phong, H X., N.T.C Giang, S Nitiyon, M Yamada, P Thanonkeo and N.T.P Dung, 2016 Ethanol production from molasses at high temperature by thermotolerant yeasts isolated from cocoa Can Tho University Journal of Science 3: 32-37 Quy chuẩn Việt Nam 6-3:2-2010/BYT, 2010 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm đồ uống có cồn Hà Nội Rabeta, M.S and S.P Lin, 2015 Effects of different drying methods on the antioxydant activities of leaves and berries of Cayratia trifolia Sains Malaysiana, 44(2): 275–280 Roehr, M., 2001 The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications Federal Republic of Germany Page: 203 – 210 22 Sesagirriravu R., 1986 Flora of Srikakulam district, Andhra Pardesh The Journal of Indian Botanical Society, 147 Tahir, A., M Aftab and T Farasat, 2010 Effect of cultural conditions on ethanol production by locally isolated Saccharomyces cerevisiae bio-07 Journal of Applied Pharmaceutical, 3(2): 72-78pp Techaparin, A., P Thanonkeo and P Klanrit, 2017 Hightemperature ethanol using thermotolerant yeast newly isolated from Greater Mekong Subregion Brazilia Journal of Microbiology 48:461-475 Tiêu chuẩn Việt Nam 3217:1997 (TCVN 3217:1997), (1997) Rượu - Phân tích cảm quan – Phương pháp cho điểm Hà Nội 23 ... 4.3.4 Lên men rượu vang trái giác Thử nghiệm lên men rượu vang trái giác 57 chủng nấm men đánh giá khả lên men rượu vang trái giác 100 mL dịch trái giác Sau lên men, pH độ Brix dịch trái giác giảm... chủng nấm men chịu nhiệt mang lại hiệu cho q trình lên men Từ đó, u cầu phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt đánh giá khả lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) Đồng sông Cửu Long. .. để phân loại sơ đánh giá khả lên men ethanol 3.3 Tuyển chọn, định danh xác định mối quan hệ chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn có khả lên men rượu vang trái giác tốt 3.3.1 Đánh giá khả chịu nhiệt