Chẩn đoán có hai vai trò quan trọng trong quản lý và khống chế bệnh thủy sản. Trước hết, các kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản được ứng dụng rất hiệu quả để sàng lọc những cá thể mang nhữ
Trang 2THONG TIN VE TAC GIA
PHAM VI VA DOI TUQNG SU DUNG
CUA GIAO TRINH 1 THONG TIN VE TAC GIA
Họ và tên: Đặng Thị Hoàng Oanh Sinh năm:1969
Cơ quan công tác:
Bộ môn: Sinh học và Bệnh Thuỷ sản Khoa: Thuỷ sản
Trường: Đại học cần Thơ
Địa chỉ Email để lién hé: dthoanh@ctu.edu.vn 2 PHAM VI VA DOI TUONG SU DUNG
Giáo trình có thé dùng tham khảo cho những ngành: Nuôi trồng thuỷ sản và bệnh học thuỷ sản
Có thể dùng cho các trường nào: các trường Cao đẳng và đại học
Các từ khóa: vi khuẩn, vi-rút, vi nắm, nguyên sinh động vật, PCR., kỹ thuật miễn dịch, bệnh cá, bệnh tôm, chân đoán, thủy sản
Yêu cầu kiến thức trước khi học môn này: sinh học cơ bản, sinh hoá, sinh học phân tử đại cương
Trang 3MỤC LỤC THONG TIN VE TAC GIA 2 MUC LUC 3 LOI CAM TA 8 GIỚI THIỆU 9
CHUONG I: NHUNG KIEN THUC TONG QUAT 10
L1 SỨC KHOE VA DONG VAT THUY SAN 10
1.2 NHUNG VAN DE CHUNG TRONG CHUAN DOAN BENH THUY SAN 10
1.2.1 Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu . . - - 10
1.2.2 So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm - + + exse vs se: 10 1.2.2.1 Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng ¿<< sex erskeersrkee 10 1.2.2.2 Phuong thitc so Sanh, hố 11
1.2.3 Nhitng van dé can 1 ý .-: ¿s62 E+ E113 101371101 t1 tru giờ 11 1.2.3.1, Gia tri gidi han cho những phép phân tích .-.o: -s cv sssxss 11 1.2.3.2 Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán - - +55 ccssxcrsrsee 11 1.2.3.3 Tinh én dinh ctta phutong phap v ccccccscssssssssssssssssesssssessesssssesssssesesessenseseees 11 1.2.3.4 Đối chứng tong TT T1 TH ch TH ch TH Tà TH Tà ngưng kế cư pvc 11 1.2.4 Phát hiện và chân đoán bệnh 2-22 + 2Se tt SrtExeExeEverkerreerxrrrrrrrererie 12 1.2.4.1 Chân đoán lâm sàngg 6 cọ E1 Tàn ngưng kế re 12 1.2.4.2 Những biện pháp sàng lọc (screcnInnp) .- co 1n vs 12 L.2.4.3 Phát hiện bệnh (deteCtiOT)) .- on TH HT ng n ng ngàng ng ngay 12 1.2.4.4 Chân đoán bệnh (điagnnostiC) sư grxkrerxrkrererkee 12 1.2.4.5 Các con đường lây truyền bệnh (đisease transrmission) : 12
1.2.5 Vai trò của chân đoán trong quản lý địch bệnh thủy sán - 5-5: 13 1.2.6 Các mức độ trong chân đoán bệnh thủy sản s52 13 1.2.6.1 MỨC Ï: ó- 1t HE TH HH TH HT TH Cà TT TH Tà HT kế cư ni 13 1.2.6.2 MUGC 23 vcssssscssssscssscscssesesssesssssesessscsvssecsessessesssssssscsvssessvssessessessessessesenseseersesaseass 14 In 14 1.2.7 Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chân đoán bệnh ở thủy sản . - 14 1.2.8 Cac ván nh a 17 I5 Noi lái nh 17
1.2.8.2 Những kỹ thuật mô học đặc biỆt n9 HH ng, 17 I.2.8.3 Kỹ thuật hiển vi điện tử: : co cst ch HnnhnHHnhư nh như tưng gu 17 1.2.8.4 Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật sẻ scktS ckgEvkkgExrkerxrkeererkee 17 1.2.9 Các kỹ thuật huyết thanh - ¿52 xe + EExeE+EEEEE110E13 1x1 trke tre trưo 17 II N6 19 sá¡n 02 aa< 17
Trang 41.1.1.2 Quan án ca ố ố 20 II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở Cá G0 con HH ng ng, 22
II.1.2 Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi -. - ¿2 se =+cszsereersrseee 25
IJN Nano 26
I1BSẴn na an 27
II.1.3.2 Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học: 27 II.1.3.3 Phương pháp mô học bao gồm các Đước: - ¿se 5s cà xxx srsexesrsrsee 27
IL2 KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH 28
II.2.1 Nguyên tẮC tư H1 H111 11T TT HH TH gi giun 28 II.2.2 Ứng dỤng tt 1E 1 1L TL TH cà H3 ch gi chuc 28 II.2.3 Mẫu phân tích ¿- 2£ 62x23 EESEEEEEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrrrkrrrk 29 TI.2.4 Thao 29 II.2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp - 232v kế ctrkerrerkeri 29 0P? 29
II.2.5.2 Nhược điỂm: tu 199919 1951991 87919 99g97 019 931 919915519 xe se vgxe 30
IL.3 KY THUAT NUÔI VI SINH VẬT 30
IĐN hi an 30
II.2.1.1 Ứng dỤng -c tt tt T1 TH ch TH ch Tà ngờ ngờ cv cư pvc 30
11.2.1.2 Phirong 0n 30
II2.1.3 Mẫu phân tích - cư HE E1 TH nh Hưng ch ru creu 31 II.2.1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp ¿5-6 5 s3 s2 versexzersrsee 31 II.2.2 Nuôi nguyên sinh động vẬTK G- SG n1 191 91g ng ng ng nhàng ng ng 31 II.2.2.1 Ứng Ụngg c2 3k1 E191 E1 TH TH TH KH ngưng kế cư ckrn 31
3o 31
II.2.2.3 Mẫu phân tíchh - ¿ - 5% + Set ch EEHEx T11 3151113 EETxErrkrrrree 31 I2.2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp ¿5-5 s69 e2 esrscxez 31
I8 ôn, 01 ae 31
II.2.3.1 Ứng dụng - 6 tàn tk kh HT TH cà Tà ngà HH Ty rườnkưc 31
Z3 32
II.2.3.3 Mẫu phân tíchh - ¿ - 5% + te EEH.x T11 3151113111 EErkrrrree 32 II.2.3.4 Đọc kết Quả c6 s1 E1 1E HH TH KH kế gà kế giờ cư 32
I3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 33
CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH 34
II.1 PHƯƠNG PHÁP KÉT TỦA MIỄN DỊCH 34
i0 0-4315 34
III.1.2 Ứng (Ụg S6 1t E11 >1 TT TH TH cưng 35
III.1.3 Mẫu phân tíchh s55 tt S311 BE 3T E11 g1 cưng ng tre krry 35 III.1.4 Các đạng khuếch tán miễn địch: . - 2 5x3 xvEvEEkrkerrsrkrrrsrkree 35 II.1.4.1 Kết tủa trong môi trường lỎng sẻ se EEEs *EEx xe xếsryckếc 35
II.1.4.2 Tủa trong mơi trường Ø€Ì - 5 co 2s 1 v9 1 nh ng ng re 37
Trang 5IIL2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH 39 jiUãN [on 0 39
HI.2.2 Xếp loại các phản ứng ngưng kết - -csconnnrertrtrrriiiirrirerrerrr 40
III.2.2.1 Ngưng kết trực tiếp: t1 1.1110 900 TH T109 9 T009 1109.080 09.1800099 0119 09109.1800079.0809 0911 40 III.2.2.2 Ngưng kết gián tiẾp: - 6 Go E1 E11 9211975137512 re rkee 40
II.2.2.3 Ngưng kết nhân tạO: + c5 t3} EESESEEESESEEESEkEExEEEEESLkrrkrkerrerkee 40
III.2.3 Ứng đỤngg S6 161 1111 E1 T1 T11 TH Tnhh 41
III.2.4 Mẫu phân tíchh - ¿sư BE 1 E1 T7 1 cưng ngưng sư 41 III2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp . + t5 xxx Ekeersrkrrrrsree 41 III.2.5.1 L u đi Êm):, ¿+ s tEEEEềEEEELEEEEEELEEEEESEEEEEEEEEkESEEESrEkerkerkrerrrrkcrrria 41 085.80: 1111777 ` 41
IIL3 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG 41
ii 0N 1 41
II xu.) 11a 42
IH.3.2.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp KT ng TT 1n 099 01019 914 42
III.3.2.2 Kỹ thuật miễn địch huỳng quang gián tiẾp - 5c 57s se crs sec 42 III.3.3 Ứng đụng - 56c 5E Ex9 SE E1 St T1 HH cà HT HH ky grckt re 43 III.3.4 Mẫu phân tích : Set S1 E11 1T TH T11 311101 11 1 111g gà re 43 II.3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp cc-cc©cccccrrrrrrrrrrirririe 43 III.3.5.1 Ưu điỂm: 6 tt 2k E*Ek E3 Ek 3H HH TT g7 Tà ng kế chờ re 43 III.3.5.2 Nhược điểm: : sctchn TL EE101111 0115 711x711 rrrrrerrkerrrri 43
II.4 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIEN KET ENZYM 44
ii 5N Can 44 III.4.2 Ứng đụng, - 26% 1t E11 1g HC TT ch r 45 III.4.3 Mẫu phân tích -: - 2t s2 St cv xe eEgkxckEExerkgrkerkbrkrkkbrerkerrerkerrerkrre 45
TIT.4.4 3a ¡ 0011071587 45
III.4.4.1 Kỹ thuật ELISA gián tiẾp - - sư sEkctEkEEkkkErxkrerxkrererkee 45 II.4.4.2 Kỹ thuật ELISA trực tiẾp ¿5 2s 2k ErEkEEEkkEExrrkerxrkeererkee 46 II.4.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp -.¿- ¿text EkEecke sex se rreg 47 III.4.5.1 Ưu điỂH): 56 2S SE BE EEEE111215E71EEEEEXECkEEESCEkErrerkrrrerrkrrrrri 47
08.8.⁄8/ /.1011777 ` 47
1.5 TAI LIEU THAM KHAO CHUONG III 47
CHUONG 4: CAC KY THUAT PHAN TU 48
IV.1 KY THUAT PHAN UNG CHUOI TRUNG HOP 48
IV.1.1 NguyÊn tẮC ch th HH TH 1T TH Cà TT Thi cha 48
IV.1.1.1 Giai đoạn biến tính (đenafuratiOT\): .- -s- 6 se Ss EEks k*SEx kg xegryckếc 48
IV.1.1.2 Giai đoạn lai (hybridization): -scsecenheheeieiiiiiiiriiriiiiii 48 IV.1.1.3 Giai đoạn tổng hợp (hay kéo đài) (extension): -ccccsccccee 48
IV.1.2 Ứng ụng tư H1 111111 TH TT TH TH ngưng 49
Ngoc lá nh 50
IV.1.3.1 Ly trích DNA hay RNA từ vật chú để sử đụng làm mạch khuôn 50
là) on 0n nh 14< 50
IV.1.3.3 Đối cÏhỨng nh TH T1 TH g1 TH ch càng Tà ngư chư pvc 51
IV.1.4 Cac han ché cia phirong phap PCR.vvcscccssscsssssssssscsssssssssssesssssessesessessssesssenes 52
Trang 6TV.1.5.1 PCR ào na 52 IS v0.0 0o 0n 33
IV.1.5.3 PCR thoi gian thậT - 2G 5 5c 159101930 19581931 830 10118 58011 ng 8110 xe 54
IV.2 KY THUAT PHAN TICH TINH DA DANG VE CHIEU DAI DOAN GIOI
HAN 54
IV.2.1 Nguyên Ïý , - ch HH TH ng TT n1 011160 109.1819 10095 34
TV.2.2, Phirong pha 54
IV.2.3 Hệ thống phi phóng xạ IDIG 2 ¿6 x52 £EEE£EktEEEEkEEEEExEExrkrrrrkrrrerkrre 55
IV.2.4 Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern . - - + + >Ekk ke cv seei 56
IV.2.5 Mẫu phân tícHh 6 tt 16B E17 1gp se 57 TV.2.6 Uti va nhuroc didin csesccssssscsesscscscsssesscssscscscssssscsvssesssssssvaveusnsacsvasaesvsasasasessees 57 TV.2.6.1 Ut GiGi: woscecssessccsseesssssscsssessssssssscsssssssssessscsussssessscssecsssessessscsssssssesesssessseaes 57 '@X.VСn sẽ HN NT 34 57 IV.3 KY THUAT LAI IN SITU 57 I6 n0 57 89.7 1177 7.7 57
IV.3.3 Mẫu phân tíCHh - hs hư 1 Tư HE Tư pH cư tưng cưng rke 57 IV.3.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp se c2 xxx ckpsxeersrri 58 IS S0 0a 58
IV.3.4.2 Nhược điỂm:, cu v9 919 190999171 99g71 g7 g9 g1 re px 58
IV.4 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV 58
CHUONG V: MOT SO QUI TRINH PHAT HIEN BỆNH Ở THỦY SÁẮN 59 V.1 PHAT HIEN VI-RUT BOM TRANG O TOM BANG KY THUAT PCR 59 V.1.1 D6i tuong va pham Vi 4p dung c.ceccsccssesssssssssssessssssssssssssssssssesssssessssesssveesesseesens 59 V.1.2 Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành . 6c +56 56s ccvz 59 V.1.3 Giải thích thuật gh cssessscsssessssesessescsssesesssesessscessscesssseessseeesssesessseeeesseesess 59
V.1.4 Thiết bị, dụng cụ, mỗi và hóa Chất 2 so te x3 E993 SE 3E EEsxersrvsee 60
V.LA.L Thiét bi, Aung nh - 4 60
V.1.4.2 Mỗi, hóa chất 52 tt 11 2 7 13111 11071111 H1 11 g1 ty ghe niệu 61 Nă “xe a,š.ễ'ồ.ễồê'ê.'êễ.ễêễ ”- 62 V.1.5.1 Số lượng mẫu . - ©9111 H11 g7 kg kế cưng cư 62 V.1.5.2 Yêu cầu đối với mẫu để phân tích - s6 tk kocxesrksrrria 63
V.1.6 Phương pháp tiến hànhh «SE EE k3 EEKEEEEKE SE E1 gEcgk serrkg 63
V.1.6.1 Xử lý mẫu : se hư TEHSHEH TT gà TH càng gen 63 V.1.6.2 Phản ứng khuếch đại PCR s2 sgk Erxkkersrkeererkee 63
V.1.6.3 Tiến hành điện di ¿5£ se St S2 E+EEEE 13211 110713 11 tk tri tưưo 64
X1 64
V.1.8 Quy định về đảm bảo an fOàn - cà re rrrrkererreg 65
V.2 PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAYV 65
'JZĂNc 0 4.đHA:: 65
V.2.2 Thành phhân + s5 E+ESEE3EEEEEEEEEESEEEVSEEEEESEEEEESEEEESEEEEEEEEEEEEErrkerrrrke 65
V.2.3 Thiết bị và hóa chất . .: sc S ts HE E1 T7 HH Hàng tr ng Hàn tr ngưng 66
V.2.4 Gidi han phat hién va tinh an 67
Trang 7NWZ SN? co áo s cố ằ 67
V.2.5.2 Hoà tan RNA HH HH Hà Hà Hang 68 V.2.6 Qui trình khuêch đại - nhe 68
V.2.6.1 Chuân bị hoá chât phản Ứng cành Hè 68 V.2.6.2 Điều kiện phản Ứng , nhà HH 68 V,2.6.3 Phương thức chuân bị phản Ứng - s3 1111919 1118581511 811511 1x, 69 V.2.7, Điện đi HH HH HH HH HH HH 000000001000000100000000001000100000 70 WPXäN®u (on ái vi n6 70 V.2.7.2 Điện di K0 1441010001114100801.100Á0100810000.100000100.0000060110.0100 70 V.2.7.3 Thuộc nhuộm gel và đọc kẾt quả .- -c« nhe 71 V.2.8 Doc kết quả Y0 0H11 1T 71 #14303 Tsáii na 73
V.3 PHÁT HIỆN VI KHUAN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RELP 74 V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn 2-5 74
W&W gan o0 0701 74
V.3.2.1 Ly trích DNA chớ Hhì Hà He 74 V.3.2.2 Cắt DNA băng enzym giới hạn TH H11112101nnnreiiee 74
V.3.2.3 Quá trình khử puria, biên tính và thâm chuyÊn - co 75
V.3.2.4 Quá trình tiên lai và lai DNA trên màng .- co co cv ssssirrsee 75 V.3.2.5 Phát hiện các vạch DNA HH 75 V.3.3 Xử lý thông kỆ ve Hh nh HH HH1 te 75
V,3.4 Đọc kẾt QUẢ Gv TH S900 Tà HH TT HH H09 909 908 0 76
PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHÂN ĐOÁN BỆNH 77
1 Phụ lục 1a Các bước thu mẫu chan đoán bệnh ở cá 77 2 Phụ lục 1b Các bước thu mẫu chan đốn bệnh ở tơm 79 3 Phụ lục 1c Các bước thu mẫu chan đoán bệnh ở nhuyễn thể - 80
PHU LUC 2: CAC DAU HIEU BENH THUONG GAP Ở TƠNM «<< 83
PHU LUC 3: CAC DAU HIEU BENH THUONG GAP O CA 87
PHU LUC 4: PHUONG PHAP NHUOM HEMATOXYLIN VA PHLOXINE/EOSIN 90
1 Công thức pha thuốc nhudm Hematoxylin va Phloxine/Eosin (H&E;) 90
2 Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) 90
PHỤ LỤC 5: CÔNG THUC DUNG DICH DAVIDSON,S AFA CUA HUMASON,1972) 92 PHU LUC 6: PHUONG PHAP NHUOM NHANH PHAT HIEN MBV, YHV VA WSSV
93
Trang 8LOI CAM TA
Tác giả chân thành cảm tạ Tiến sỹ Ngô Thị Thu Thảo và Thạc sỹ Trần Thị Tuyết
Hoa đã góp ý về mặt hình thức và nội dung cho giáo trình
Xin cảm ơn sự giúp đở của Cô Phạm Trần Nguyên Tháo và hai em sinh viên Phạm
Thị Ngọc Yên và Hoàng Tuân lớp bệnh học thủy sản khoá 29 trong quá trình chính
Trang 9GIỚI THIỆU
Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khả năng người phân tích thu
được kết quá chân đoán là các tác nhân gây bệnh cơ hội hơn là tác nhân gây bệnh chủ yếu
Kết quả chân đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào tính sẵn có của phương pháp chân đoán đang
được áp dụng ở phòng thí nghiệm, lãnh vực nghiên cứu của người thực hiện việc chan đoán
hoặc những phép chân đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và cách đọc kết quá một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất
quan trọng
Môn học nguyên lý và kỹ thuật chân đoán bệnh thủy sản là môn học kỹ thuật chuyên ngành bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên những hiểu biết về nguyên lý và phương pháp thực hiện các kỹ thuật chân đoán bệnh ở thủy sản Đồng thời môn học cũng giới thiệu các lãnh vực ứng dụng của các phương pháp trong chân đoán bệnh thủy sản Một phương pháp
có thê được ứng dụng dé phat hién/chan đoán nhiều mầm bệnh
Phần thực hành của môn học cung cấp những kiến thức và kỹ năng hỗ trợ cho phần lý thuyết và cũng là cơ sở đề sinh viên tiếp cận các phương pháp cơ bản trong chân đoán bệnh thủy sản Phần tài liệu tham khảo được: sử dụng để xây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi chương Sinh viên có thê tìm thây các tài liệu này từ trung tâm học liệu Đại học Cân thơ, thư
Trang 10CHƯƠNG I: NHUNG KIEN THUC TONG QUAT
1.1 SUC KHOE VA DONG VAT THUY SAN
Khác với các vật nuôi ở trên cạn, động vật thủy sản thường đòi hỏi sự theo dõi nhiều hơn về môi trường và sức khỏe của chúng Do sống ở dưới nước nên hoạt động của động vật thủy
sản thường rất khó quan sát trừ khi chúng được bắt ra khỏi mặt nước hoặc khi bị bệnh Động vật thủy sản lại sống trong môi trường sinh thái phức tạp và thường xuyên biến động
Thêm vào đó, thức ăn thừa, thủy sản chết và nhiều thứ khác luôn ẩn ở đưới đáy ao Các đối
tượng nuôi thủy sản rất đa dạng về loài, về môi trường sống, mức độ thâm canh của kỹ thuật nuôi và hệ thống nuôi được áp đụng Các dạng bệnh ở động vật thủy sản cũng đa dạng và có
nhiều biến đổi, trong đó có một số bệnh chưa xác định được vật chủ và có nhiều bệnh không
có dấu hiệu lâm sàng riêng biệt
Bệnh trong nuôi thủy sản thường không do một nguyên nhân riêng lẻ mà là kết quả của một loại các sự kiện/nguyên nhân có liên quan với nhau trong đó có cả sự tương tác giữa vật chủ
(bao gồm các điều kiện về sinh lý, sinh sản và giai đoạn phát triển), môi trường và sự hiện
diện của mầm bệnh Sự hiện điện của một mầm bệnh trong mô tôm/cá không có nghĩa mầm
bệnh đó là nguyên nhân chính gây ra bệnh Phần lớn nguyên nhân đầu tiên gây bệnh là đo những biến đổi xấu về môi trường Bây ton thuong đến cơ thê hoặc làm giảm đi khả năng
kháng bệnh của tôm/cá Trong lúc đó mầm bệnh sẵn có trong môi trường sẽ nhân cơ hội này
xâm nhập vào cơ thể chúng Do vậy cần phái xem xét cả vật chủ, mầm bệnh và môi trường
để xác định nguyên nhân gây bệnh nhằm có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích hợp
1.2 NHUNG VAN DE CHUNG TRONG CHUẢN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN
L2.1 Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu
Thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quá của các phép chẩn đoán bệnh Thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu
mẫu, phương pháp có định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv, đều là những vẫn đề
cần được cân nhắc trong qua trình phân tích mẫu Số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông
cũng ảnh hướng đến kết quả phân tích Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh
L2.2 So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm
Đề so sánh kết quả phân tích hay kết quả chân đoán từ các phòng thí nghiệm chân đoán
Trang 112.2.2 Phương thức so sánh, ví dụ:
- _ Mật số vi-rút so với hàm lượng kháng thể - _ Giới hạn xác định kết quả đương và âm tính
- Độ nhạy của phương pháp (ví dụ như % kết quá dương tính thật trên số kết quả
dương tính)
- _ Tính chuyên biệt (ví dụ như % kết quả âm tính thật trên số kết quá âm tính) - _ Các tính toán và đọc kết quá
- Các đối chứng
1.2.3 Nhimg van dé can lưu ý
1.2.3.1 Giá trị giới hạn cho những pháp phân tích
Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có
tính định lượng đê xác định kêt quả âm tính và dương tính
Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quá âm tính và đương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật,
1.2.3.2, Tính hiệu lực của phương pháp chấn đoán
Một phương pháp phân tích mẫu hay thử nghiệm có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho
ra kết quả phân biệt rõ ràng giữa kết quả đương tính và âm tính hoặc giữa cá thê bị nhiễm
bệnh và không bị nhiễm bệnh
Tính hiệu lực của phương pháp biểu hiệu qua hai đặc điểm là tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay không) và tính chuyên biệt (khá năng phát hiện mẫu không có
nhiễm bệnh)
Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách $0 sánh các cá thể cùng loài trơng
cùng một mâu Trong trường hợp khác kêt quả phải được kiêm định băng các kỹ thuật mô học
1.2.3.3 Tính ẩn định của phương pháp
Một phương pháp được gọi là ô én định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều lần lập lại Hai yếu tố quyết định cho tính én định của phương pháp là: biến
động giữa các cá thê phân tích và biến động giữa các lần đọc kết quả
1.2.3.4, Doi chứng
Đối chứng phải được bố trí trong tất cả các phân tích, gồm có đối chứng đương và đối chứng
Trang 12có đối chứng DNA dé theo déi khả năng tạp nhiễm giữa các mau trong qua trinh ly trich, đối chứng là DNA của vật chủ để kiểm soát khả năng khuếch đại DNA của mẫu và đối chứng PCR để kiểm soát sự tạp nhiễm trơng quá trình thực hiện phản ứng
L2.4 Phát hiện và chân đoán bệnh
1.2.4.1 Chân đoán lâm sàng
Qua chân đoán lâm sàng những ảnh hưởng của bệnh được ghi nhận và mô tả, từ việc quan
sát tông quát, những thay đôi về tập tính hay hoạt động, những vết lở loét hay những vùng bi ton thương khác ở bên ngoài cho đên những quan sát, ghi nhận và mô tả ở mức hiên vi bệnh lý của các nội quan
1.2.4.2 Những biện pháp sàng lọc (screening)
Những biện pháp sàng lọc bao gồm tẤt cả những phương pháp xét nghiệm được áp dụng trên cơ thê sinh vật khoẻ nhằm dé kiểm tra xem chúng có bị nhiễm những mầm bệnh truyền
mhiễm có khá năng gây bệnh về sau hay không
1.2.4.3 Phát hiện bệnh (detection)
- _ Xác định sự hiện diện của nhóm hay loại mầm bệnh nào đó
- _ Xác định mức độ cảm nhiễm (tự nhiên hoặc nhân tạo) của mầm bệnh trong mẫu phân tích 1.2.4.4, Chan đoán bệnh (diagnostic)
- Xác dinh sy hiện diện của mầm bệnh chuyên biệt ở mức loài, chủng hay các dạng biên hoá của mâm bệnh đó
- Mức độ cảm nhiễm dù it hay nhiều của mầm bệnh qua chẵn đoán có ý nghĩa là vật
chủ đang bị nguy hiêm
* Chẩn đoán sơ bộ (Presumptive Diagnosis) — các chân đoán bước đầu dựa trên những quan sát tông quan và những chứng cứ gián tiệp Qua chân đoán sơ bộ thường thây có nhiêu tác nhân gây bệnh
* Chan đoán xác định (Confirmatory Diagnosis) — kết quả xét nghiệm đương tính
thật của mâm bệnh với độ tin cậy của phương thức xét nghiệm cao I2.4.5 Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission)
Trong chân đoán và xác định nguyên nhân gây bệnh thì các con đường lây truyền bệnh
thường được biết đến như là địch tế (epidemiology hoặc epizootiology) của bệnh đó Những hình thức lây truyền của bệnh và các yêu tố tác động đến quá trình lây truyền bệnh (môi
trường, thao tác, giai đoạn phát triển, ô bệnh, w.) thường phải được tìm hiểu, ghi nhận trong
Trang 13L2.5 Vai trò của chấn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản
Chân đoán có hai vai trò quan trọng trong quản lý và khống chế bệnh thủy sản Trước hết,
các kỹ thuật chân đoán bệnh thủy sản được ứng dụng tất hiệu quả để sàng lọc những cá thể mang những mam bénh nguy hiém nhất là trong chọn giống thúy sản hoặc chụn những cá thể khỏe mạnh để vận chuyển từ nơi này đến nơi khác Việc sàng lọc bệnh có hai lợi
ích: (a) làm giảm rủi ro bộc phát bệnh do những cá thể mang mầm bệnh gây nên do sốc, thao tác hay do môi trường thay đổi trong quá trình vận chuyên và (b) làm giảm rủi ro lây bệnh của những cá thể mang mầm bệnh nhưng kháng được bệnh Vai trò thứ hai của chân
đoán bệnh là giúp xác định nguyên nhân gây nên tình trạng sức khỏe kém hoặc những
biểu hiện bất thường về sinh sản, tăng trưởng hay hoạt động để có thể đề xuất những bước
tiếp theo trong quá trình tìm ra nguyên nhân gây bệnh và đề xuất giải pháp khống chế hoặc
xử lý bệnh tủy theo từng điều kiện cụ thể Đây là vai trò trực tiếp và rõ ràng nhất của việc chân đoán bệnh thủy sản
Chẩn đoán chính xác một bệnh thường được xem xét một cách không đúng là do quá phức
tạp và tốn kém Điều này có thé chi đúng trong trường hợp phải đối phó với những bệnh khó
chan đoán hoặc với những bệnh mới xuất hiện Chẩn đốn bệnh khơng chỉ đơn thuần là
thực hiện các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Kết quá xét nghiệm giúp xác định sự hiện điện của một mầm bệnh nào đó, hoặc có thê loại trừ sự có mặt của mầm bệnh tùy vào mức độ phát hiện của phương pháp được sử dụng Chân đoán sai dẫn đến phòng và trị bệnh
không hiệu quả và thậm chí là rất tốn kém Ví dụ như có một tác nhân gây bệnh mới xuất
hiện ở một vùng nuôi thủy sản trọng điểm nào đó hay đối tượng thủy sản được thả nuôi chết hàng loại trong quá trình vận chuyên hay thao tác trong trại như chuyển ao, đóng túi dé van chuyển, vv Việc chân đoán phải được thực hiện bằng những quan sát, theo đõi liên tục bắt
đầu từ trại sản xuất, thật ra đây là việc cần làm trước khi bệnh xay Ta
L2.6 Các mức độ trong chẵn đoán bệnh thủy sản
Theo tài liệu hướng dẫn chân đoán bệnh ở thủy sản nuôi ở Châu Á (Asia Diagnostic guide
for aquatic animal disease FAO fisheries technical paper 402/2) thi chan doan bénh thuy
sản được chia thành ba mức độ (xem chỉ tiết ở bảng 1) với những bước thực hiện va yêu câu tùy theo mỗi mức độ chân đoán Các mức độ chân đốn khơng có ý nghĩa từng mức độ
riêng lẻ mà mang tính liên hoàn bổ sung đữ liệu và thông tin cho nhau để đạt được một chân
đốn hồn hảo Mức độ 1 cung cấp những thông tin căn bản làm cơ sớ cho chân đoán mức 2
và 3 do việc chẩn đoán ở các mức độ cao hơn chỉ có thể được xác định chính xác khi có sự
liên kết với những quan sát và kết quả thu được ở những mức độ chân đoán thấp hơn
I2.61 Mức I:
Gồm những quan sát về trại nuôi, thông tin về sản xuất, những ghi nhận trong quá trình nuôi
và việc quản lý sức khỏe Những thông tin này cho biỆt về các nhân tố kích thích sự bộc
phát bệnh đề làm cơ sở cho mức độ chân đoán 2 và 3
Trang 14L2.6.2 Mức 2:
Gôm những xét nghiệm chuyên biệt về ký sinh trùng, mô bệnh học, vi khuẩn hay nấm
Những xét nghiệm này có những yêu cầu nhất định về kinh phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá
chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên môn Nhìn chung chân đoán mức hai không thể thực
hiện ở trại nuôi L2.63 Mức 3:
Gồm những dạng chẩn đoán có tính chuyên biệt cao yêu cầu có sự đầu tư thích đáng về kinh phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên mơn Chẩn đốn mức 3 bao gôm những kỹ thuật phân tử và kỹ thuật miễn dịch Mặc đù hiện tại có một vài bộ kít được phát triển cho việc chân đoán nhanh tại các trại nuôi (mức 1) hay sử dụng trong các
phòng thí nghiệm vi sinh vật và mô học (mức 2)
Một trong số các vấn đề quan trọng để đạt hiệu quả chân đoán cao nhất ở cả ba mức độ chân
đoán bệnh là phải đảm bảo rằng những người làm cơng việc chẩn đốn ở mức 1 phái có liên lạc và biết cách liên lạc với các phòng thí nghiệm thực hiện chân đoán mức 2 và 3 và ngược
lại các phòng thí nghiệm mức 2 và 3 cũng phải có mối liên lạc với những người thực hiện
chân đoán mức 1 Chẩn đoán mức 3 thường cung cấp những thông tin thuần túy về mặt xét nghiệm trong phòng thí nghiệm nên cân phải có những thông tin về các điều kiện thực tế ở
trại nuôi thì việc chân đoán mới thật sự mang lại hiệu quả thực tế
Như vậy, chân đoán mức 1 là nhằm mục đích chẳn đoán bước đầu về bệnh và được xem
như là cái mốc của quá trình chân đoán Các chẩn đoán xác định (mức 2 và 3) chỉ có thể
được thực hiện khi mà khả năng chân đoán bước 1 đã được thiết lập Việc thành lập các phòng thí nghiệm cho chân đoán mức 2 và 3 thường là tùy thuộc vào tình hình và mức độ
nghiêm trọng của dịch bệnh mà những người thực hiện việc chân đoán mức 1 phải đối phó
và giải quyết
L2.7 Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẵn đoán bệnh ở thủy sản
Các kỹ thuật phát hiện/chân đoán bệnh ở thủy sản có thể được phân nhóm theo nhiều cách
dựa vào dạng mầm bệnh (ví dụ: kỹ thuật vi khuẩn, kỹ thuật vi-rút ) hoặc dựa vào phương
Trang 15Bảng 1 Các mức độ chân đoán bệnh và các điều kiện liên quan
va ộ Những VIC cân làm Kiến thức cần phải có Người thực hiện Yêu cầu về mặt kỹ thuật
I | Quan sat vat | Hiểu biết về phương thức cho ăn, quan Người nuôi thủy | Những hiểu biết về chính về quan sát thực địa
nuôi vàmôi | sát hoạt động và sự tăng trướng của thủy | sản/quản đốc trại nuôi `
trường sản nuôi ; Mau theo dõi các thông tin về trại nuôi
Cán bộ khuyên ngư ` „
Xétnghiém | Thường xuyên theo đõi ao nuôi Các dụng cụ cân thiệt
lâm sàng tổng
quát Thường xuyên ghi nhận thông tin về môi trường và những diễn biến của ao nuôi để hỗ trợ cho các chân đoán ở mức 2 và 3
Hiểu biết các bước cần thực hiện để liên
lạc và gởi mẫu xét nghiệm mức 2 và 3 ở các PTN bệnh thủy sản
Cán bộ hỗ trợ về ngư y
Cán bộ phụ trách kỹ
thuật nuôi thủy sản
Mẫu quan sát lâm sàng Mẫu theo đõi ao nuôi
Lưu trữ mẫu/vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm phân tích mức 2
Các bước quan sát, theo dõi phát hiện bệnh
Tài liệu ướng dẫn chấn đoán bệnh thủy sản H Ký sinh trùng Vi khuẩn Nam
M6 bénh hoc PTN được trang bị cơ bản về thiết bị và dụng cụ phục vụ cho việc phát hiện/chân đoán mầm bệnh cũng như cán bô có trình độ chuyên môn về bệnh thủy sản Luu giữ, ghi nhân đầy đủ và duy trì bài bản và chính xác kêt quả chân đoán
Có khá năng lưu giữ và đuy trì nguồn mẫu Cán bộ chuyên môn về sinh học thủy sản Cán bộ chuyên môn về bệnh Cán bộ chuyên môn vê ký sinh trùng
Cán bộ chuyên môn Hệ thống lưu trữ mẫu
Trang 16đạt tiêu chuẩn cho chân đoán mức 3 Hiêu biết sự cân thiệt khi phải chân đoán mức 3 và cách liên lạc, chuân bị mâu và chuyên mâu đê chân đoán mức 3 về nâm Cán bộ chuyên môn vê vi khuân Cán bộ chuyên môn về mô bệnh học Các tài liệu hướng dẫn chan đoán bệnh thủy sản Il Vi-rut Hién vi dién tir Sinh hoc phan tir Mién dich
Đòi hỏi PTN có trang bị thiết bi và dụng
cụ hiện đại cũng như cán bộ kỹ thuật phải có trình độ chuyên môn cao
Lưu giữ, ghỉ nhân đầy đủ và duy trì bài ban va chính xác két qua chân đoán Có khả năng lưu giữ và duy trì nguon
mâu đạt tiêu chuân cho các mục đích
nghiên cứu
Duy trì sự liên hệ với những người có
trách nhiệm và các cơ quan chức năng
gởi mâu xét nghiệm Cán bộ chuyên môn VỆ vi-rút Cán bộ chuyên môn vê mô bệnh học Chuyên gia và kỹ thuật viên vê sinh học phân tử Thiết bị và hoá chất cho xét nghiệm mức 3 Qui trình xét nghiệm và cán bộ có trình độ xét nghiệm ở mức 3
Qui trình lưu giữ mẫu và các thao tác chuẩn hố/đơng nhât phương pháp với các phòng thí nghiệm khác
Các tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản
Tài liệu chân đoán bệnh bằng phương pháp
phân tử
Trang 17
1.2.8 Các kỹ thuật quan sát I.2.8.1 Những kỹ thuật quan sát
Gồm những kỹ thuật quan sát mẫu bệnh phẩm bằng mắt thường, quan sát tiêu bản tươi bằng kính hiển vi giải phẫu Qua những thủ thuật quan sát này người chân đoán có thê ghi nhận những thông tin ban đầu về bệnh như các dấu hiệu lâm sàng, ký sinh trùng và
tình trang các mô của cơ thé trước và sau khi tử vong
Mẫu cũng có thể được có định bằng những dung dịch có định thích hợp để quan sát bằng
kỹ thuật mô bệnh học
I.28.2 Những kỹ thuật mô học đặc biệt
Một số kỹ thuật mô học đặc biệt như kỹ thuật hóa mô miễn dịch hay hóa huỳnh quang miễn dịch, sử dụng các kỹ thuật miền dịch trực tiêp trên tiêu bản mô bệnh, được sử dụng
trong chân đoán mức 2 và 3 L2.8.3 Kỹ thuật hiển vỉ điện tử
Kính hiển vi điện tử được sử dụng ở những phòng thí nghiệm mức 3 dé quan sat vi sinh vật Qua kính hiển vi điện tử người ta có thể quan sát cầu tạo bề mặt của các vi sinh vật,
hình thái bên ngoài của chúng, hoặc cầu tạo bên trong ở mức độ mô và vi mô 1.2.8.4 Các kỹ thuật nuôi vì sinh vật
Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật (như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng và nam) bằng các môi
trường chọn lọc chuyên cho một sô mâm bệnh cũng được mộ sô phòng thí nghiệm dùng
trong chân đoán
L2.9 Các kỹ thuật huyết thanh
Gồm có những xét nghiệm sử dụng kháng thể hoặc sử dụng kháng nguyên Những xét nghiệm sử dụng kháng thể giúp xác định đáp ứng của kháng thể vật chủ với kháng nguyên Tuy nhiên những xét nghiệm này không có tính xác định tình trạng nhiễm bệnh
Trong khi đó những xét nghiệm sử dụng kháng nguyên giúp phát hiện những phân tử
kháng nguyên bề mặt của vi sinh vật nên có vai trò trong chân đoán xác định 1.2.10 Cac ky thuat phân tử
Những kỹ thuật phân tử giúp xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh bằng cách phát
Trang 18L3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1
1 Austin, B., and Austin, D A (999) Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed
and wild fish 3rd Edition
Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa (2005) Giáo
trình bệnh học thủy sản
Ellis, A E (1985) Fish and Shellfish Pathology
FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease fisheries technical paper
402/2
Lightner, D V (1996) A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic
Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp
Noga, E J (1999) Fish Disease: Diagnosis and Treatment
OIE (2006) Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals,
Post, G (1983) Textbook of Fish health
Trang 19CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT
IL.1 QUAN SAT DAU HIEU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC IL1.1.Phương pháp quan sát dẫu hiệu bệnh
II.1.1.1.Những vẫn đề cần lưu ý khi quan sút bệnh lý thúy sản
Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bảo học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải
phẫu là phần rất quan trọng cho các chân đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho một chân đoán đầy đủ Trong đa SỐ các trường hop, két qua chan đoán đòi hỏi phải có những bằng chứng cho thấy sự liên quan giữa mâm bệnh và những tồn thương của cơ thé do mầm bệnh đó gây nên Ngoài vai trò xác định tương quan giữa mầm bệnh và vật chủ, những thông tin từ kết quá quan sát còn giúp xác định/phân biệt những yếu tố tham gia
gây bệnh khác
Những biến đổi về hình thái của mô và tế bào phải được xác định và phân ra thành các
nhóm ví dụ như những biểu hiện của vật chủ với sự tấn công của mâm bệnh nhằm có
những biện pháp chân đoán khác nhau để có kết quả xác định do cơ thể có rất nhiều loại
mô và chúng có những biêu hiện khác nhau về mặt bệnh lý
Để có thê lựa chọn phương pháp chẩn đoán hợp lý, người làm cơng tác chân đốn phải
thu thập, phi nhận hoặc phải đuợc cung cap những thông tin sau:
1 Vị trí xuất hiện của những dấu hiệu bệnh lý trên cơ thể, các nội quan và mô cũng
như những những thay đổi trong thoi gian gan nhat dugc phan doan thong qua: (i)
qua trinh diễn biên bệnh (Đã chết hay đang bị bệnh nặng; Tình trạng bệnh: sô còn
sông, số khỏe, số bệnh và sô đã chết) ; (i1) báo cáo chỉ tiệt về quan sát lâm sang; (iii) mâu mô bệnh và (1v) kêt quả xét nghiệm mô bệnh học trên nhiêu tiêu bản mô 2 Kết quả chẩn đoán lâm sàng trước và sau khi tử vong
3 Những thông tin liên quan đến khả năng bị nhiễm độc tố
4 Chấn thương hoặc những thông tin liên quan đến tình trạng kiệt sức
5, Các điều kiện về dinh dưỡng, sinh sản, mật độ và môi trường nuôi
6 Thông tin về biện pháp phòng bệnh được áp dụng như loại thuốc hay vắc xin được sử dụng, thời gian và phương thức sử dụng
7 Thông tin về kết quả các chân đoán trước đây (nếu có)
Những xáo trộn về mặt sinh lý hay trao đổi chất của cơ thể thường không thấy được
qua phân tích mô bệnh học mà chỉ có thê băng các quan sát những tôn thương hay những thay đôi vê mặt hình thê do những xáo trộn có liên quan gây ra
Mẫu được thu để phục vụ cho việc chân đoán để định dạng mầm bệnh, xác định tác
Trang 20thuộc vào việc chọn lựa phương pháp chẩn đoán như đã nêu ở trên Chi tiết các bước
thu mâu được trình bày ở phụ lục 1
II1.1.2 Quan sát bệnh lý ở tôm
Việc phát hiện ra bệnh ở tôm rất khó khăn, trừ khi có hiện tượng tôm chết hàng loạt Dấu hiệu bệnh thường xuất hiện ở một số ít cá thé trong ao nuôi do vậy cần phải quan sát tôm
nuôi thường xuyên nhằm xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất Trong hầu hết các trường hợp, biểu hiện bên ngoài thường giống nhau mặc đủ tác nhân gây bệnh khác nhau
Nếu phiêu sinh vật phát triển, chất lượng nước và tôm đều ở trong điều kiện tốt thì kể từ
tuần lễ nuôi thứ ba sẽ không thể nhìn thấy tôm nữa Khi tôm bị những tác động do môi trường xấu hoặc bị bệnh chúng thường nổi lên mặt nước hoặc tập trung ven bờ Khi thấy tôm xuất hiện ở ven bờ hay trên mặt ao thì đó là dấu hiệu nghiêm trọng Vì thế cần phát hiện sớm những dấu hiệu khác thường qua sàn ăn hoặc chài Tôm thường thích lên mặt
ao hay ven bờ vì nước ở đó có hàm lượng oxy cao Trong nhiều trường hợp cũng có thể
là để tránh hàm lượng chất độc cao ở đáy ao Kiểm tra các ao nuôi vào ban đêm và lúc
sáng sớm là rất quan trọng vì tôm bệnh sẽ nổi lên mặt nước hoặc ven bờ rất nhiều vào
những lúc này Khi thấy tôm tập trung ven bờ thì nên kiểm tra đáy ao để biết số tôm chết,
nhất là ở khu vực đặt máy sục khí, ở giữa ao nơi tích cặn bã và quanh cống thoát Trơng hầu hết các trường hợp, không thể xác định bệnh trong ao nuôi qua một lần thu mẫu
cho dù có phân tích nhiều chỉ tiêu đi nữa thì ý nghĩa của nó rất nhỏ Điều cần thiết ở đây là
cần theo dõi đàn tôm trong suốt quá trình nuôi Phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm
thường dựa vào những dấu hiệu xuất hiện trên tôm, chất lượng nước và những ghi nhận trong sản xuất bao gồm thức ăn tôm sử dụng và quá trình sinh trưởng Điều này chỉ có thé
thực hiện được ở những trại có các số liệu theo dõi đầy đủ vê xu hướng phát triển, tỉ lệ
sống, tình trạng sức khỏe, sinh khối và tỉ lệ chuyên hóa thức ăn ở mỗi thời điểm thu mẫu
Mật độ thả nuôi ảnh hưởng tất lớn đến quá trình phát triển của tôm trong ao Mật độ thả
quá dày chắc chắn sẽ gặp trở ngại, vì tôm sẽ cạnh tranh nhau về thức ăn và môi trường sống Mật độ thả phù hợp cho từng ao tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện về thổ
nhưỡng, chất lượng nước, khí hậu ở vùng nuôi; kiểu thiết kế và cấu trúc ao nuôi; trang
thiết bị; cỡ tôm thu hoạch dự kiến và kinh nghiệm của người quản lý
Thiết kế ao tốt có thể bù dap cho một số trở ngại về môi trường và cỡ tôm thu hoạch có
thê bị giới hạn bởi môi trường xấu Khi chất lượng nước tại chỗ xâu hoặc quá thay đổi thì thả tôm với mật độ cao thường không có hiệu quả Những thay đổi về thời tiết và chất lượng nước theo mùa có ảnh hưởng đến tôm nuôi Thời gian chuẩn bị ao và thả giống phù hợp cho việc nuôi tôm cũng phái được xem xét
Các thông tin về môi trường và quán lý ao nuôi cần lưu ý bao gồm: chất lượng nước đặc biệt là hàm lượng oxy hòa tan, pH và nhiệt độ; những biên động về thời tiệt như mưa lớn;
tình trạng đáy ao; sự phát triên của tảo và hình thức quản lý nước
Trang 21co nhiều đấu hiệu khác xuất hiện trên tôm cũng cho biết chất lượng nước xấu như màu
sắc bất thường ở mang, vỏ ban, phéng đuôi, ăn lẫn nhau và phụ bộ bị thương Nếu có
nghỉ ngờ về sự xấu đi của nền đáy ao thì nên lội khắp ao để xem lượng chất thái tích tụ và
sự phân bổ của chúng ra sao
Mặc dù táo phát triển tốt thường có lợi cho ao nuôi, nhưng trong ao nuôi thay nước it có
thé gặp rắc rối do tảo phát triển quá mức vì các chất dinh đưỡng tích lũy trong ao Phương thức quản lý và xử lý nước cần phải được lưu tâm đặc biệt Mục đích của giai đoạn lây nước, xử lý nước và bón phân là để thúc đây phiêu sinh vật phát triển tốt và ngăn ngừa các sinh vật khác vào ao nuôi, trong đó có các sinh vật gây bệnh và sinh vật
mang mam bénh Cac sinh vat nay bao gom các loài cá, giáp xác và các động vật không
Xương sống khác Các sinh vật này có thể cạnh tranh hoặc giết hại tôm và chúng có thê
mang mầm bệnh vào ao nuôi như các mầm bệnh vi-rut rất nguy hiểm
Những dấu hiệu bệnh lý bên ngồi cơ thể tơm nuôi thường không cung cấp những thông
tin nhất định nào về tác nhân gây bệnh Phức tạp hơn là dau hiệu bệnh lý do nhiều tác
nhân cùng gây ra cộng với những biến đổi bất lợi về các yếu tố mơi trường Việc chan
đốn bệnh nêu chỉ đơn thuan dya vào dâu hiệu bên ngồi sẽ khơng chính xác mà cân phải được thực hiện cùng với phương pháp phân tích mô bệnh học hay các phương pháp chân
đoán khác Dâu hiệu bệnh được tiên hành qua các bước như sau: 1 Quan sát hoạt động của tôm
2 Quan sát màu sắc cơ thể như: - _ Hiện tượng đỏ thân hay đó phụ bộ
- _ Sự xuất hiện những đốm trăng trên vỏ
- _ Hiện tượng vỏ tôm có màu xanh
- _ Hiện tượng đâu vàng
- Thit t6m co mau trang duc
3 Quan sát màu sắc mang như:
Trang 229 Dị dạng
10 Mềm vỏ
11 Màu sắc và độ đầy của ruột
12 Màu sắc của phân
Thông tin chỉ tiết về phương pháp quan sát đấu hiệu bệnh trên cơ thể tôm được trình bày
trong phân bệnh tôm, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005) Các dâu hiệu
bệnh thường gặp ở tôm được trình bày ở phụ lục 2
H.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá TỊTI 13.1 Quan sát hoạt động của cả
Hoạt động của cá phải được quan sát thường xuyên mới có thê phát hiện sớm những biểu hiện bất thường Bắt kỳ một dấu hiệu hoạt động bất thường của cá cũng cần phải được ghi nhận và tìm hiểu nguyên nhân Trước khi có đấu hiệu bệnh lý rõ ràng, cá thường ăn
nhiều hơn bình thường và sau đó ngừng ăn, hoặc có một số cá tách đàn khi bắt mỗi Sự
ghi nhận thường xuyên những thông tin về hệ số chuyên hóa thức ăn, tỉ số chiều dài/trọng
lượng cơ thể hoặc những dấu hiệu về hình dạng cơ thể sẽ giúp dự đoán/phát hiện bệnh
Sắp xảy ra
Những biểu hiện bất thường của cá như bơi gần mặt nước, chìm xuống đáy ao, mất thăng bằng hoặc thiếu oxy hay có bất kỳ những đấu hiệu hoạt động bất thường nào Sự xuất
hiện đột ngột của những hoạt động bất thường của cá thường liên quan đến tình trạng hôn
mê của cơ thê cá Những thay đổi về hoạt động của cá thường xảy ra khi cá bị sốc Thiếu oxy làm cá bị ngạt thở, lờ đờ, phình bụng hay bơi lắc lư mất hăng bằng và thậm chí làm ảnh hướng xấu đến mang và máu Những hoạt động lạ thường còn có thể đo những rối
loạn vé than kinh liên quan đến bệnh (bệnh do vi-rút gây viêm não và võng mạc)
Phải theo đõi xem cá chết đưới hình thức nào và mức độ ra sao Nếu cá cứ tiếp tục chết
dai đẳng thì phải thu mẫu gởi đến phòng thí nghiệm đẻ thực hiện các chân đoán ở mức 2
và 3 Nếu cá chết đồng loạt hoặc chết theo vùng ngẫu nhiên thì phải xem xét ngay lập tức và các chỉ tiêu về môi trường trước và sau khi cá chết cần phải được ghi nhận và xem xét
Cá chết lan từ vùng này sang vùng khác có thể là do tác nhân gây bệnh truyền nhiễm và
phải thu mẫu định dạng mầm bệnh ngay lập tức Việc làm tức thời (nếu có thể) là cách ly
cá bị bệnh và cá khỏe trong thời gian xác địng nguyên nhân gây tử vong
Tăng trưởng hàng ngày của cá cần phải được ghi nhận càng đầy đủ càng tốt Tốt nhất là thu mẫu định kỳ hoặc ước lượng khi cho cá ăn mỗi ngày Bên cạnh thông tin về tăng trưởng của cá thông tin về hoạt động bắt mỗi và cá chết (nếu có) cũng cần được ghi nhận đầy đủ Thời gian thay bể hay thay nước, vệ sinh dụng cụ/ống dẫn nước hay khử trùng trại cũng càn được ghi chép lại Trong nhiều trường hợp, những thông tin trên rất hữu ích
dé tim ra nguyén hay xuất hiện bệnh trong trại nuôi cá
Trang 23mặt sinh lý) hay gián tiếp (làm tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh) Nhiệt độ, độ
mặn, độ đục, vi khuẩn gay ban va su phat trién cua tao déu 1a nhimg yéu t6 môi trường
quan trọng Mật độ nuôi cao trong các hệ thống nuôi thâm canh làm cho các bị sốc và gây nên những thay đổi về môi trường tạo điều kiện cho bệnh bộc phát Sự tích tụ chất thải
từ thức ăn thừa đo cho ăn quá mức hay do cá giảm ăn đều sinh ra độc tố khi phân hủy làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá và tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Các mầm bệnh này thường là các tác nhân gây bệnh thứ cấp Ngồi ra các chất gây ơ nhiễm khác cũng có thê ảnh hướng đáng kê đến sức khỏe của cá
Thông tin về môi trường nuôi đặc biệt là ở những hệ thống nuôi hở, ao, bè hay lồng rất quan trọng khi xác định nguyên nhân gây bệnh Các thông tin cần phải ghi nhận càng
thường xuyên càng tốt là: những thay đôi về thời tiết, nhiệt độ nước, hàm lượng oxy, pH,
độ mặn, độ trong và sự phát triển của tao và hoạt động của con người II _L 3.3 Quan sát bê mặt cơ thể cá
Những quan sát bề mặt co thể cá nói chung không cung cấp nhiều thông tin liên quan đến
một sự có về bệnh riêng lẻ nhưng những quan sát về dấu hiệu lâm sàng ở bề mặt cơ thể
cùng với những biện pháp hợp lý như loại bỏ hoặc cách ly cá bệnh với cá khỏe, thu mẫu xét nghiệm có thê giảm đáng kê thất thoát do bệnh
lỊ II 3.4 Quan sát trên da và vây ca
Những tồn thương trên da va vây thường là do bệnh truyền nhiễm, ví dụ như bệnh đỏ da
ở cá chép Tuy nhiên, những vết thương trước đó do những nguyên nhân cơ học (cá cọ
vào thành bể hay do những sinh vật khác như cá dữ, chim) hay tồn thương hóa học tấn công sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh sơ cấp hay thứ cấp (ví đụ như trường hợp nhiễm vi khuan 4eromowas) tắn công làm xấu thêm tình trạng sức khóe của cá
Những thay đổi ở đa liên quan đến bệnh, ví dụ như bệnh đốm đó đù là nhỏ hay to thường đòi hỏi phải có những động tác tích cực dé xử lý Những dấu hiệu bệnh thường xuất hiện xung quanh các tia vi, nắp mang, hậu môn và vùng đuôi, cũng có khi đấu hiệu bệnh lan khắp toàn thân Những dấu hiệu như xuất huyết hoặc mất cân bang thâm thấu sẽ làm cho
da cá sậm màu đi Những vết thương bị xuất huyết trên da dễ dẫn đến tình trạng lở loét
làm ảnh hưởng đến việc điều hòa áp suất thâm thấu và khả năng đề kháng của cơ thê với các mầm bệnh thứ cấp Hiện tượng lở loét thường gặp ở phần da vùng lưng và đầu và có thê do bệnh gây nên Ở một số loài cá, những chỗ da bị sưng lên là đấu hiệu của sự mất vây hoặc sự tích tụ chất nhày
Ngoại ký sinh trùng hay giun dẹp cũng cần phải được lưu ý Khi những loài ký sinh trùng
này xuất hiện trên da cá nhiều hơn mức bình thường sẽ làm cho cá bị nhiễm những mầm
bệnh thứ cấp, là đấu hiệu của SỰ phát bệnh hay bị sốc Ký sinh trùng có thể bám trên bề
mặt da cá hoặc ở giai đoạn âu trùng sống trong bào nang/bào xác đưới da hay vi cá Những dạng bảo xác âu trùng như âu trùng sán lá song chủ mefacercariae có thé phat hiện nhờ những đốm trắng hay đen đưới da (hoặc sâu trong mô)
Mắt của cá cũng là nơi cần được quan sát cẩn than dé phát hiện bệnh Hình dạng, màu
sắc, tình trạng đục van, bot khí và những đốm đỏ nhỏ lắm tắm do xuất huyết đều là
những dâu hiệu cho thây cá sắp bị bệnh hoặc đang ở trong tình trạng nhiêm bệnh Ví dụ
Trang 24như trường hợp mắt cá bị to và trương phông lên còn được gọi là cá bị lồi mắt thường liên quan đến nhiều trường hợp bệnh ở cá
lỊ ] ] 3.3 Quan sát mang
Mang cá là một trong số các mô dễ quan sát những thay đổi khi cá bị bệnh như mang nhợt nhạt hay bị lở loét Những thay đổi ở mang cá thường là có liên quan đến bệnh và
cần phải lưu tâm đặc biệt khi thấy những biểu hiện bất thường xuất hiện ở mang Những
đốm đỏ trên mang là đấu hiệu của sự xuất huyết đã làm giảm di khả năng thực hiện các
chức năng của mang Mang bị sinh vật gây bân bám, tích tụ nhiều chất nhày hay ký sinh
trùng (tiêm mao trùng, sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo, nắm, v.v.) đều có thê làm hạn chế bề mặt tiếp xúc của mang và là đầu hiệu ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá Những
ảnh hưởng xấu ở mang có thể làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá hoặc làm cho cá dễ mẫn
cảm với các mầm bệnh thứ cấp khác 1.1.1.3.6 Quan sat trên cơ thể
Bắt kỳ một thay đổi khác thường nào về mặt hình dạng của cá đều là dấu hiệu không tốt về mặt sức khỏe Những thay đổi về hình dạng thường gặp là “đầu nhọn” hay xảy ra ở cá con là dấu hiệu của sự phát triển không bình thường: hiện tượng ưỡn hay vẹo cột sống là dấu hiệu không tốt về đỉnh đưỡng hay môi trường Phù cơ thể là một hiện tượng xuất hiện khá phổ biến và đễ nhận thấy nhất về mặt thay đổi hình dạng cơ thể của cá Phù cơ thể là sự căng phồng phần bụng làm cho bụng cá trương to Đây là dấu hiệu bệnh cho
thấy có sự sưng lên của các nội quan cá như gan, tụy hay thận, sự tích tụ dịch cơ thé do
ký sinh trùng hoặc do những nguyên nhân khác chưa rõ Phù cơ thể là một trong những
nhân tố của khá nhiều bệnh nguy hiểm ở cá liên quan đến sự ngưng trệ hệ thống điều hòa
thâm thấu do có nhiều tế bào máu của thận bị phá hủy
ILI1.1.3.7 Quan sát bên trong cơ thể cá
Quan sát bên trong cơ thể cá là bước tiếp sau việc quan sát những thay đổi về hoạt động/tập tính sông của cá Mẫu cá bệnh phải được giải phẫu dọc theo phần bụng từ họng đến hậu môn để quan sát các nội quan và xoang cơ thê Nên giải phẫu mẫu cá khỏe đề so
sánh những sal khác của nội quan cá khoẻ và cá bệnh
Nếu như cá khỏe mạnh và các mô cơ thể bình thường thì sẽ không thay dich co thé trong
khoang bụng cá, cơ rắn chắc, có thể thấy những lớp mỡ có màu trắng kem xung quanh
ruột và da day Than co mau do sam nam sat phan tận cùng phía trên của khoang cơ thê giữa tuỷ sống và bóng hơi, gan có màu đỏ, tụy và lách cũng có màu đó
TLI 138 Quan sát khoang bụng và các mô
Những dấu hiệu bệnh thường thấy nhất trong khoang cơ thể là sự xuất huyết và sự tích tụ
dịch cơ thể Những đốm máu có thé xuất hiện trong cơ vách của khoang cơ thể Vách của khoang cơ thể mềm nhữn, rã ra khi giải phẫu là đấu hiệu cho biết cá đã chết lâu và sẽ
không còn thích hợp cho việc chân đoán chính xác do sự xâm nhập rất nhanh của các vi
sinh vật hoại sinh là mầm bệnh cơ hội khi sau khi cá chết
Trang 25nhỏ mẫu mô bị nhiễm lên lam kính và quan sắt bằng kính hiển vi giải phẫu để quan sát
những thể vùi dạng bào tử Một sơ lồi ký sinh trùng nhóm vi bao tử trùng
(microsporidian) và thích bảo tử trùng có thể hình thành bảo xác trong cơ của cá, mô liên
kết các nội quan và khoảng cơ thể, và những cơ quan khác Những dạng bào xác này tập
trung thành từng cụm có hình cầu trắng và đòi hỏi thao tác định danh để xác định ký sinh trùng thuộc nhóm nào
Giun san cũng có thê xuất hiện trong khoang bụng, nhóm này thường nằm cuộn lại xung quanh các nội quan và các mô màng bụng Sự hiện của chúng thường không gây nguy hiểm cho cá tuy nhiên nếu chúng có quá nhiều trong khoang bụng sẽ gây chèn ép hay chiếm chỗ các nội quan của cá
lỊ II 39 Quan sát các nội quan
Bắt cứ những đốm trắng xám nào xuất hiện trên một trong những cơ nội quan của cá như
gan, thận, tụy hay lách đều do bệnh vì những đốm trắng xám này là dấu hiệu của sự hoại
tử hoặc tổn thương ở mô Ở thận hoặc lách thì đây là dấu hiệu của sự ngưng sản xuất tế
bào máu Những vết loét trên thận còn có thê là do ảnh hưởng trực tiếp của sự điều hoà
áp suất thẩm thấu Những vết loét trên gan thì có thể do ảnh hưởng của cơ chế kháng
khuẩn và kháng độc tố Bất kỳ một nội quan nào của cá bị sưng lên đều là đấu hiệu của bệnh cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt Khi ruột cá bị sưng thì phải kiểm tra xem là do thức ăn hay đo sự tích tụ dịch nhày Sự tích tụ dịch nhày là dấu hiệu của ngưng tiêu hóa thức ăn, loại bỏ chất thải cũng như sự kích động ruột thường có liên quan đến những bệnh nguy hiểm Đây cũng có thê do sự xâm nhập cơ hội của những đoạn ruột đã bị kích
động do sự thay đổi quá nhanh về thức ăn ví dụ như do trùng roi Hexamita salmonis
Ruột có đầy dịch nhày có thể nhận ra qua phân kết cụm, phân kéo dài hay có địch nhày Thông tin về phương pháp quan sát đấu hiệu bệnh trên cơ thẻ cá cũng được trình bày trong phân bệnh cá, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005) Các dầu hiệu
bệnh thường gặp ở cá được trình bày ở phụ lục 3
IL1.2 Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi
Quan sát mẫu giải phẫu tươi có thê được thực hiện ngay tại trại nuôi hay chỉ cần có kính hiển vi và các dụng cụ tiểu phẫu đơn gián là có thê thực hiện được nhằm giúp đánh giá tình trạng sức khỏe tôm/cá nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng phát bệnh Những phương pháp trình bày đưới đây thường được sử dụng trong chân đoán bệnh tôm Ở cá, các kỹ thuật này cũng được áp dụng khá tương tự Thông tin chỉ tiết về các phương pháp cơ bản trong chân đoán bệnh cá có thê tham khão thêm trong tài liệu hướng dẫn chân đoán bệnh thủy sản (Asia Diagnostic guide for aquatic animal đisease, FAO fisheries technical paper 402/2) hoặc trong giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005)
Kính phết huyết tương
Để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng và ký sinh trùng trong
mau Những biên đôi như nhân bị co lại thường có liên quan đên bệnh V¡br¡o hoặc bệnh đầu vàng Nhân bị vỡ và có nhiêu thê vùi trong tê bào chât là biêu hiện đặc trưng của sự
Trang 26nhiễm vi-rút gây bệnh đầu vàng (YHV) Vi khuẩn Ƒ/brio thường phổ biến trong các
trường hợp nhiễm khuẩn Vị bào tử trùng (Microsporiium) cũng thường được tìm thay
trong máu Có thế nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram hay nhuộm
Heamatocyline & Eosin (H&E) (xem phụ lục 4)
Kinh phét mau gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt dung dịch có
định Davidson, phét déu, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E Phương pháp này có
thê phát hiện các thê ân của vi-rút trong trường hợp tơm bị nhiễm nặng Ngồi ra cũng có thé phat hién nhom Vibrio và vi bào tử trùng
Có định mang tôm bằng dung dich HCl Davidsơn và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thé
phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng (W SSV), YHV va vi-rit gây hoại tử co quan tao mau va
co quan lập biểu mô (HHNV) Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nắm mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này (xem phụ lục 5)
Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ, cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan sinh dục và ruột giữa cho vào một giọt dung dich 2.8 % NaCl hoặc nước biển vô trùng,
đậy bằng lam và quan sát đưới kính hiển vi dé phát hiện vi khuẩn đạng sợi, nguyên sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng đi động (thường là nhóm ¡ðrio), nắm mycosis, tảo khuê, tảo lục và cả mùn bã hữu cơ Ở những chỗ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thê dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt đung dịch 2.8 % NaCI và quan sát đưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bắn, nguyên sinh động vật
va nam Furasium
Một số phương pháp nhuộm nhanh hiện đang được sử dụng đề phát hiện vi-rút baculo ở
tôm sú (Monodon baculovirus-MBV), YHV và WSSV (xem phụ lục 6) IL.1.3 Phương pháp mô học
Mô bệnh học là phương pháp xác định các tồn thương ở các mô tế bào đựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng | kính hiên vi Phương pháp này cho phép người phân
tích kết luận tính chất của các vùng tôn thương
So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngồi là cơng việc rất cần thiết đê có được
một chân đoán đứng Nếu chỉ đựa vào những hình thái tơn thương bên ngồi mà không có các
đữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình
thái tổn thương của vài bệnh có thê giống nhau và gây nhằm lẫn trong chân đốn
Phương pháp mơ học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh Mô bệnh học là một kỹ thuật rat quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chân đoán được bằng phương pháp này Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được
xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học Phương pháp mô học chỉ nên
sử dụng kết hợp với tất cả các đữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác
Trang 27Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ
thức ăn và đúc khôi sáp Cát mâu thành từng lát mỏng khoảng 5 microret, rôi đặt lên lam,
nhuộm màu và đậy băng lam kính Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chet, vi
thê cân phải cô định chúng Tôm chệt dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đêu vô ích đôi với phương pháp mô học do những biên đôi xảy ra trong cơ Dung dịch cô định
tôm tot nhat la dung dich Davidson’s va formaline đệm trung tính (phụ lục 5) H.1.3.1 Mục tiêu
- _ Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể)
- So sanh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ dé
tìm hiệu môi quan hệ mật thiệt giữa biên đôi hình thái va các rôi loạn chức năng
làm cơ sở cho việc chân đoán
1.1.3.2 Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học:
1 Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chân đoán bệnh hiển thị
quan hệ trực tiêp giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ
2 Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi
vê hình thái và câu tạo ở mức tê bào Mỗi loại mô, tê bào có những biêu hiện khác nhau với tác nhân gây bệnh
II.1.3.3 Phương pháp mô học bao gỗm các bước:
1 Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học)
- _ Thu mẫu (theo phương pháp của Lightner, 1996)
- _ Cố định mẫu (dung dich Davidson’s) Sau dé trit trong dung dich 50-70 % alcohol - Cat mau
- Tach nude - Duc parafin
- C&t mau bang microtom
- _ Dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt 2 Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H&E
3 Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận định kết quả
Trang 28IL2 KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH IL2.1 Nguyên tắc
Kỹ thuật hố mơ miễn dich (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thê có tính đặc hiệu với kháng nguyên qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể Kháng thê đùng cho phản ứng có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (ky thuật IFC), enzym, chất phóng xạ để có
thể nhận biết khi quan sát đưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những
loại kính hiển vi khác (hình 2.1) 11.2.2 Ung dụng
- Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính
chuyên biệt của phản ứng kêt hợp kháng nguyên-kháng thê
- _ Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương pháp này cho phép tìm hiệu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh
- Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương pháp đặc biệt được sử dụng đê quan sát dưới kính hiên vi điện tử
4W huœoclronme
Kháng-KT KT A A hay enzym
Phién ban té bao hdn hep được phat hién bang ba chat phat mau
khác nhau: tế bải thân kánh (46),
oligodendrocytes (xanh luc) va
Trang 2911.2.3 Mau phan tich
Mẫu sử dụng là mô hay dịch cơ thê còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24
giờ Sau đó mâu được xử lý băng một trong các phương pháp sau:
Vết bôi/kính phết: vết bôi đùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm
trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải
được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng dé kháng nguyên không bị hư Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu Formalin: cé định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung địch đệm trung tính (10% formalin) va dic khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần Hoặc có định 48 giờ trong
formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng
phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch
Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số
kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể Tuy nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chỉ tiết về hình thái của mô và tế bào, đòi hỏi phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh trước khi mô được trữ đông và thao tác thực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học Phương thức trữ đông tốt
nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng
nitơ lỏng hay ở —70°C
IL2.4 Thao tác
Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ yếu dựa trên loại mâu (vết bôi, đúc parafin hay đông lạnh), đạng mẫu vật để phát hiện
bệnh và độ nhạy cần đạt được
Những thông tin cần có khi thực hiện IHC là: (1) cách có định mẫu; (ii) thời gian cố định; (11) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (v1) loài
IL2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp 1.2.5.1 Uu diem: - Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mô học hay nhuộm truyền thống - _ Xác định chính xác tác nhân gây bệnh đựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với kháng nguyên
-_ Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự
tương tác ở mức tê bào vê mặt hình thái hoặc câu tạo
Trang 30IL2.5.2 Nhược điểm:
- _ Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng đễ gây ra hiện tượng liên kết giữa
các kháng nguyên tạo kêt quả dương tính giả
- Đồi hỏi quá trình tạo ra kháng thê chuyên biệt, kiêm tra tính ổn định của phản ứng
giữa kháng thê và kháng nguyên
- _ Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh
- _ Kết quả âm tính hay đương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được su dung, phương pháp và thời gian có định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của
người phân tích
IL3 KỸ THUẬT NUOI VI SINH VAT
Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chan đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở
mức họ hoặc có khi đến mức giống Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác
định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chân đoán bệnh là thường dé gap trường hợp âm tính giả đôi với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy đặc biệt Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy rất đễ gây nên hiện tượng dương tính giả trong chân đoán
IL2.1 Nuôi vi khuẩn
II.2.1.1 Ứng dụng
Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm H.2.1.2 Phương pháp
Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo đạng vi khuẩn được nuôi Vị khuân thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng Cách
làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng
kháng thuốc trong cùng một quân thê cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực
với loài vi khuẩn đó Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh
vi khuân ở thủy sản như: - Vibrio sp: TCBS
- Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin agar
Trang 31IL2.1.3 Mẫu phân tích
Co, gan, thận hay mau cua sinh vat bị bệnh Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy sản lở loét mâu có thê được thu băng cách dùnh gạc bông gòn lây mẫu tại vêt thương Mẫu cũng có thê được thu từ dịch cơ thê của bệnh phâm
IL2.1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mâm bệnh
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và đễ bị tạp nhiễm với các
mâm bệnh cơ hội
IL.2.2 Nuôi nguyên sinh động vật II.2.2.1 Úng dụng
Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm H.2.2.2 Phương pháp
Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bỗ sung fetal bovine serum va kháng sinh nhu penicillin, streptomycin dé tranh nhiệm khuân
1.2.2.3 Mau phan tich
Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thê Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước
muôi sinh lý có chứa kháng sinh đê tránh nhiễm khuân, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi
chuyên mâu đên phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ 1.2.2.4 Ủu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được xử lý trong vòng 24 gio
IL2.3 Nuôi vi-rút 1.2.3.1 Ung dung
Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chân đoán nhiễm vi-rút
Việc phân lập vi-rút thường găn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp
thu mau cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút
Trang 32H.2.3.2 Phương pháp
Vi-rut la sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên VIỆC nuôi vi-rút thường được thực hiện trên
tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng, Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và
nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển
II.2.3.3 Mẫu phân tích
Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hiện diện
trên cơ thé vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý Tùy theo điều kiện
thực tế mà mẫu có thể được vận chuyên sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng
để chuyển về phòng thí nghiệm
Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình nghỉ bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó Mẫu được thu có thê là mẫu mô hoặc dung dich trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu
được thu với dung dịch chống đông
Điều kiện vận chuyên và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm
phân tích hướng dẫn Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi
trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mau phải được vận chuyển
trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyền trong vòng 5 ngày Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mâu ở -70°C, v.v
II.2.3.4 Đọc kết quả
Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng cứ cho sự nhiễm vi-rút Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu Điều cần thiết trong quá trình chân đoán là phải
có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là
Trang 33IL3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II
1 Alday de Graindorge, V and Flegel, T.W, (1999) Diagnosis of shrimp diseases with
emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon
Austin, B., and Austin, D A (999) Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition
FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease Fisheries technical paper 402/2
Forbes, B A., Sahm, D F., and Weissfeld, A S (2002) Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology 11th edition
Hirsh, D C., MacLachlan, N J., and Walker, R L (2004) Laboratory Diagnosis In:
Veterinary Microbiology 2nd edition
Lightner, D V (1996) A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures
for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp
Noga, E J (1999) Fish Disease: Diagnosis and Treatment OIE (2006) Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals,
Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải (2002) Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi
10 Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S
(1999) Diagnostic Procedures for Finfish Diseases
11.Từ Thanh Dung, Dang Thi Hoang Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa (2005) Giáo trình
bệnh học thủy sản
Trang 34CHƯƠNG HI: CÁC KỸ THUẬT HUYÉT THANH
Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thé dé phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký
sinh trùng trong mẫu huyết, thanh Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự
tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về
tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi
II.1.PHƯƠNG PHÁP KÉT TỦA MIỄN DỊCH IIL.1.1 Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá
thừa kháng nguyên hoặc kháng thẻ Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù
hợp với kháng thé
Nguyên lÿ chung: kết tủa miễn dich chi có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan Hiện tượng kết tủa miễn dịch Xây fa in vitro
Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thé là do hình
Trang 35Hình 3.1 Hiện tượng tua voi sự hình thành mạng lưới cân bằng
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau:
- _ Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị
- - Kháng nguyên đa hóa trị
- _ Kháng nguyên phải hòa tan và thành phần của môi trường như lực ion hay pH có
vai trò nhât định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa
- Cac khang thê IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn
kháng thê IgM chứa tới 10% nên đề hòa tan và ít kêt tủa hơn
- _ Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dé kết tủa III.1.2 Ứng dụng
Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mâu huyệt thanh hay huyết tương băng cách định tính hay định lượng
III.1.3 Mẫu phân tích Mẫu huyết thanh hay huyết tương
IIL.1.4 Các dạng khuếch tán miễn dịch IIL.1.4.1 Kết tủa trong môi trường lỏng
Phương phap Heideiberger va Kendall
Phương pháp này cho phép định lượng một phan ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỷ lệ
nông độ tương đối giữa khang thé va khang nguyên Trong một loạt ô ống thí nghiệm, cho
đều cùng một lượng kháng thé khéng thay đổi Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình
3.2) Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống
Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thé bị tủa Nếu lây ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể Có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp
Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lẫy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những
ông đâu và kháng thê vào những ông cuôi thì vần có được tủa thêm Điêu này cho phép
xác định được 3 khu vực:
Trang 36- Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên
nên đã ngăn không cho kết tủa hệt kháng thê
- Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép
hình thành mạng lưới 3 chiêu
- Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng
nguyên và kháng thê có tỉ lệ nông độ tôi ưu cho phép tủa gân hệt các phân tử kháng thê và kháng nguyên
Hình 3.2 Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng
Định lương bang do dé duc
Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa
càng nhiều Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thê và nhờ việc đọc
độ cán quang rồi so sánh với đường chuẩn Việc sử đụng tia laser cho phép việc định
lượng có giá trị cao
Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l nhu IgG, IgA, IgM va
trong việc tìm các kháng kháng thê
Trang 37HIL1.4.2 Tủa trong môi trường geÏ Nguyên lý
Kháng thê cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ây không di chuyên và hiện lên trông thây băng mắt thường hoặc nhuộm
Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)
Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách này phụ thuộc vào hệ sô khuếch tán của từng chất phản ứng Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ đối điện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể Thời gian xuất hiện các đường cung tủa có thê là hai ngày đến một tuần
Hình 3.3 Khuéch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony)
Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thê Muốn so sánh piữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thê trong một huyết thanh thì có thé bé trí hai lô kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết thanh Kết quả có thé: (i) Phán ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nói liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt nếu hai kháng nguyên khác nhau thì sẽ kết hợp riêng với hai kháng thê và hai đường kết tủa sẽ cắt chéo nhau hoặc (iii) Phản ứng giống một phần khi hai kháng nguyên có cùng một epitop và một epitop riêng khác nhau thì các kháng thể tương ứng sẽ cho một
đường tủa chung liền với nhau và một đường tủa phụ gắn với đường tủa trước đối với
kháng nguyên thứ hai (hình 3.3)
Ngược lại, có thê dùng kỹ thuật này để so sánh với nhau hai kháng huyết thanh gây tủa để
xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không Kỹ thuật này rât hay được
dùng đê phát hiện các kháng thê chông nhân của một người so với một huyết thanh chuẩn
Trang 38Miễn dịch khuếch tứn vòng (kỹ thuật Mancini)
Kỹ thuật này đùng để định lượng kháng nguyên Kháng thê đặc hiệu được hòa đều vào
trong thạch trước khi dé dãy thạch lên trên kính hay hộp petri Sau đó, đục các lỗ và cho
vào đó dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau Kháng nguyên sẽ khuếch tán va gap khang thé ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ
lệ thuận với nồng độ kháng nguyên Việc định lượng được suy ra từ một đường biểu diễn
chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên III.1.4.3 Miễn dịch khuếch tán điện
Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell)
Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di
chuyên của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường Do đó vùng
kết tủa có hình tên lửa (còn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4) Chiều dài của hình tên lửa tỷ
lệ với nồng độ kháng nguyên Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều
chất phản ứng hơn
,
Hình 3.4 Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu
Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar va Williams)
Khi đung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng nguyên thì khuếch tán kép không đủ để xác định mọi đường kết tủa Miễn dịch điện di bồ sung thiếu sót ấy bằng cách tách trước các kháng nguyên theo tốc độ đi chuyên của chúng trong điện trường rội mới gây tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào săn đọc theo chiều điện di Các đường tủa xuất hiện theo hình thức những cung ở hai bên rãnh
Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay
không so với một đôi chứng Đây là một kỹ thuật tôt để xác định một Ig đơn dòng do tạo ra một cung tủa dày hơn, cong và gân rãnh hơn đông thời nội liên với cung tủa của lg
huyết thanh cùng lớp
HI.1.4.4 Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in sifu
Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó
cho tác dụng của kháng thê đặc hiệu ngay trên lớp thạch đề hình thành kệt tủa kháng
Trang 39ngay trên bề mặt của thạch Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của
thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng Những phân tử không bị kết tủa thì sẽ được rửa cho đến hết Từ đó, để dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thé va
sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di Kỹ
thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điện đi để chuẩn đoán những bất thường đơn dòng của Ig Nó có lợi hơn là kháng nguyên không có thời gian để khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể Tính thuần nhất của một thành phần đơn đòng nào đó nếu có ở một lượng rất thấp thì cũng được báo tồn trong kỹ thuật này Sau cùng việc giải thích những hình ảnh thu được cũng đễ dàng hơn trong kỹ thuật miễn địch điện di
IIL1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp HI.1.5.1 U u đi ỗm:
Kỹ thuật đơn giản
111.1.5.2 Nhuge diem:
Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở đạng hòa tan thì mới có thê khuếch tán được Mặt
khác phương pháp này có tính nhạy không cao II.2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH
IIL2.1 Nguyên lý
Hiện tượng ngưng kết là đo cơ chế hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và
kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường có thé nhìn thấy được Mạng lưới chỉ có thê xuất hiện với các kháng
thé có ít nhất là hai hóa trị IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết
manh hon IgG Noi chung các kháng nguyên hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên
không bị hạn chế
Ở phản ứng ngưng kết miễn địch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình Đó là kháng nguyên có
kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật Kháng nguyên hữu hình có epitop bề
mặt có thể liên kết chéo với các kháng thê tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh
Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng
trong một dung môi Các tiêu phân giữ được trạng thái
Trang 40IIL2.2 Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tỉnh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chat tro làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của nó,
trong đó thường dùng là hông cầu đã xử lý bằng formol
IIIL2.2.1 Ngưng kết trực tiếp:
Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng n guyên tiếp xúc với kháng thê ở các nồng độ pha loãng khác nhau Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn
trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết
IIIL2.2.2 Ngưng kết gián tiếp:
Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ phản ứng,
sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điêu kiện như
ngưng kết trực tiếp
III.2.2.3 Ngưng kết nhân tạo:
Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết
hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy Ta mà vẫn có hiện tượng ngưng kết Coombs đã cho thêm kháng thé anti-globulin tạo một cầu nói giữa globulin mién dịch đã có sẵn trên
hạt theo hai hình thức sau: /esí coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách
tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì
sẽ gây ngưng kết, Test Coombs gián tiếp là mot test huyết thanh cho phép tìm xem trong
một huyết thanh có hay không có kháng thé chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhớm Sau đó, rửa sạch thì trên
hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti-