Đang tải... (xem toàn văn)
Tài liệu này nêu được tác hại và ảnh hưởng của bệnh tằm bủng (bệnh bủng mủ) đối với sản xuất dâu tằm tơ và phát triển bền vững nghề trồng dâu nuôi tằm. Tài liệu đã chỉ rõ tác nhân gây bệnh là Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus và xác định được trình tự ADN, đồng thời chỉ rõ nguồn gốc của nó. Đề từ đó đề xuất biện pháp phòng chống.
BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH TẰM BỦNG Ở VIỆT NAM Nguyễn Thuý Hạnh, Liujiping SUMMARY The study preliminary determined ADN’s order of some virus strains cause for Bombyx mori nuclear polyhedron diseases The curent study introduces methods of colection, and determination of ADN structure of NPV virus (Nuclear Polyhedrosis Virus) and ArNPV virus (Attacus ricini Nuclear Polyhedrosis Virus) in sericulture Virus samples collected from Quang Dong in China, Lam Dong and Ha Noi in Vietnam Results from PCR analysis and structure analysis (using a software) showed the difference of nucleic acid concentration in ADN of virus Based on these results, producers can detemine source of virus as well as have a better plan for prevention and treatment to silkworm virus diseases Keywords: Silkworm ((̣Bombyx mori), Attacus ricini, BmNPV, Gene polh I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tằm bủng gọi bệnh virus nhân đa diện (Bombyx mori nuclear polyhedrosis) loại bệnh thường gặp q trình ni tằm Đây loại bệnh truyền nhiễm Nguyên nhân virus NPV (nuclear polyhedrosis virus) gây nên, virus kí sinh tế bào máu tổ chức nhân tế bào hình thành đa giác thể (nên gọi virus đa giác thể) Đây loại bệnh truyền nhiễm cấp tính, nơi có điều kiện nuôi tằm không tốt, bệnh bủng bùng phát mạnh gây tổn thất nghiêm trọng hộ nuôi tằm Trên giới sử dụng phương pháp nghiên cứu truyền thống phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học để tách chiết phân lập virus, tìm nguyên nhân, nguồn gốc, phân lập chủng loại virus gây bệnh từ có biện pháp, định hướng phòng trừ bệnh tằm bủng để hạn chế tổn thất Ở Việt Nam, công tác nghiên cứu bệnh hại tằm nói chung bệnh tằm bủng nói riêng cịn ít, bắt đầu Nhận thây ý nghĩa quan trọng nghiên cứu bệnh tằm, tiến hành thực đề tài: “Bước đầu xác định trình tự ADN số chủng virus gây bệnh tằm bủng Việt Nam” Đề tài thực trường Đại học Nông nghiệp Hoa Nam, tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc Kết nghiên cứu đề tài sở cho việc xác định nguồn gốc chủng virus hại tằm, thông qua việc xác định nguồn gốc thăm dị tìm định hướng giải pháp phòng trừ bệnh bủng hại tằm hạn chế tổn thất II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Virus đa giác thể gây bệnh hại tằm dâu (gọi tắt BmNPV) thu thập Quảng Đông, Hà Nội, Lâm Đồng (ký hiệu BMNPV-Gd; BmNPV-Hn; BmNPV-Lđ) virus đa giác thể gây hại tằm thầu dầu (gọi tắt ArNPV-Hn) - Giống tằm tứ nguyên: 932.Phù Dung x 7532.Tương Huy Trung tâm chuyển giao giống tằm Quảng Đông cung cấp - Thiết bị hoá chất chủ yếu: Agarose, EDTA, Marker 200bp, Protein K (PK), loading Buffer, Taq DNA Polymerase, dNTPs, phenol, Chlorofom (do công ty trách nhiệm hữu hạn Tiangen sản xuất), nước cất, cồn, máy PCR PE Applied Biosystem 9700 Mỹ sản xuất, hệ thống chụp ảnh UVP (sản xuất Anh) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Nuôi cấy virus đa giác thể Mỗi chủng virus lấy 25ml dung dịch huyền phù BmNPV, nồng độ pha loãng 106tế bào/ml cho vào cốc thuỷ tinh Cắt dâu thành miếng nhỏ có kích thước x cm, sau tiến hành ngâm dâu cắt vào dung dịch huyền phù BmNPV (thấm mặt dâu) Dùng đũa đảo cho dâu thấm dung dịch huyền phù BmNPV, sau tiến hành cho tằm tuổi ăn Sau giờ, tiến hành quan sát cách ăn dâu Mỗi ngày theo dõi quan sát tình hình phát sinh bệnh 2.2.Thu thập phân lập virus BmNPV Thu thập tằm bệnh theo chủng virus Dùng dao cắt chân đuôi dung dịch máu có màu trắng sữa chảy vào bình tam giác nhỏ Bịt kín miệng bình tam giác, bảo quản 4oC Lấy 13ml dung dịch màu trắng sữa cho vào ống li tâm 1,5ml, điều chỉnh cân tiến hành ly tâm 2500-3000 vòng/1 phút, ly tâm 20 phút Đổ bỏ phần nước phía Phần kết tủa cho thêm 13ml nước cất, lắc tiếp tục ly tâm 2-3 lần Đổ bỏ phần nước phía trên, quan sát thấy kết tủa phân thành tầng, tầng có màu vàng nhạt, tầng gữa có màu trắng sữa, tầng cuối có màu đen Thêm 23ml nước vô trùng, nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch màu vàng Tiếp tục thêm 2-3ml nước vơ trùng, cẩn thận hút lấy 10ml phần dịch có màu trắng sữa chuyển sang ống ly tâm 1,5ml Bảo quản 4oC 2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số virus đa giác thể BmNPV ArNPV Sau pha lỗng, tiến hành ly tâm 5000 vịng/1 phút, ly tâm 10 phút Đổ bỏ phần nước phía trên, thêm 1ml dung dịch đệm (bao gồm: 10 nmol/l Tris-Cl, mol/l EDTA, 0,5% SDS), dùng pipet nhẹ nhàng khuấy đều, thêm 400-500µg/ml protein K, lắc nhẹ Sau cho vào nồi nước 50oC từ 2-5 Sau đó, tiếp tục cho thêm 500ml Phenol:Chlorofom: Isoamyl Alcohol (25:24:1) vào lắc đều, ly tâm 12000 vòng/1 phút, ly tâm 10 phút Dùng pipet nhẹ nhàng hút chuyển phần nước sang ống li tâm mới, tiếp tục thêm 500ml Phenol:Chlorofom: Isoamyl Alcohol (25:24:1) vào, ly tâm 12000 vòng/1 phút, ly tâm 10 phút Lại dùng pipet hút lấy phần nước sang ống li tâm Thêm ethanol đến thể tích 1.5ml, bảo quản -20oC để hình thành kết tủa Tiếp tục ly tâm 12000 vòng/1 phút, ly tâm phút, đổ bỏ phần nước phía trên, phần kết tủa phía lầ ADN Dùng 1ml cồn 70 o để rửa kết tủa Sau hong khơ để cồn bay hồn tồn Cho 20µl TE (10 mmol/L Tris-Cl, mmol/L EDTA) pH vào hoà tan kết tủa bảo quản -20oC 2.4 Chạy PCR kiểm tra đoạn ADN Sử dụng cặp mồi Phy 35/Phy 36 có nguồn gốc từ gen polh virus BmNPV Phy35: 5’-ACYTAYGTGTACGACAACAAATAYTACAAA-3’(30bp) Phy36:5’-GGYGCGTCKGGYGCAAAYTCYTTWACYTTRAA-3’ (32bp) Tm = 50oC (Chú ý: Y T C; R A G; K T G; W A T; S G C; M A C) Cặp mồi Công ty trách nhiệm hữu hạn Kỹ thuật vi sinh vật Anh Xuân- Thượng Hải thiết kế, dùng chu trình PCR khuyếch đại gen ADN virus đa giác thể hại tằm Điều kiện để phản ứng PCR xảy sau: 10xPCR Buffer µl dNTP Mixture µl Mồi µl Mồi µl DNA 1,5 µl Enzim Taq (2.5 U/µl) 0,25 µl dd H2O 37,25 µl Bước 1: khởi đầu 94oC min; bước 2: biến tính 94oC 45s; bước 3: gắn mồi 50oC 45s; bước 4: kéo dài 72oC (các bước từ 2-4 lặp lại 42 vịng tuần hồn); bước 5: kéo dài 72oC 10 phút; bước 6: giữ hỗn hợp 4oC 2.5 Xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus Sử dụng NCBI BLAST để xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu thu chủng virus III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết ADN tổng số chủng virus BmNPV Sau phân lập xác định chủng NPV theo phương pháp phân tích vi sinh vật đơn giản, từ kết tách chiết thu nhận ADN tổng số tiến hành kiểm tra kết việc khuyếch đại gen dựa ADN tổng số chủng virus Sản phẩm ADN tổng số mẫu virus kiểm tra điện di gel agarose 1,2%, đệm TAE 1x nhuộm Goldview Kết cho thấy mẫu bệnh tằm điện di thu hình ảnh ADN tổng số Trên ảnh điện di, hình ảnh ADN chủng virus có kích thước khoảng 600-700bp M Macker phân tử lượng 2000 bp; 1-3.Sản phẩm ADN virus đa giác thể hại tằm dâu có nguồn gốc từ Quảng Đông, Hà Nôi, Lâm Đồng; 4.Sản phẩm ADN virus đa giác thể hại tằm thầu dầu có nguồn gốc Hà Nội; Đối chứng Hình 1: Sản phẩm PCR mồi Phy35/Phy36 virus đa giác thể vùng địa lý Kết phân tích PCR mẫu ADN loại virus hại tằm dâu tằm thầu dầu địa điểm khác thể hình Kết phân tích hàm lượng acid Nucleic chủng BmNPV Kết phân tích PCR mẫu virus với cặp mồi Phy 35/Phy 36 cho thấy mẫu ADN loại virus xuất băng phản ứng PCR nhân lên CÁc băng có kích thước tương tự nhau, kích thước khoảng 500-700bp mẫu ADN chủng virus tiến hành phân tích xác định trình tự (kết thể bảng 1) Bảng cho thấy hàm lượng nucleotid đoạn ADN loại virus nhân lên Nhìn vào ta thấy đoạn ADN chủng virus khác cấu trúc lượng A, T, G, C Trong đó, lồi virus có nguồn gốc từ Hà Nội Lâm Đồng giống kích thước hàm lượng acid nucleotid đoạn gen nhân lên Bảng Hàm lượng acid nucleotid loại virus thí nghiệm Tên Virus A (%) C (%) G (%) T (%) A+T (%) G+C (%) Kích thước (bp) BmNPV-Gđ 30,67 25,00 22,70 21,63 52,30 47,70 652 BmNPV-Hn 30,51 24,96 23,11 21,42 51,93 48,07 649 BmNPV-Lđ 30,51 24,96 23,,11 21,42 51,93 48,07 649 ArNPV-Hn 30,69 23,66 23,05 22,60 53,28 46,72 655 Nhìn vào bảng thấy đoạn ADN chủng virus khác cấu trúc hàm lượng A, T, G, C Trong đó, lồi virus có nguồn gốc từ Hà Nội Lâm Đồng giống kích thước hàm lượng acid nucleotid đoạn gen nhân lên Hàm lượng A+T từ 51,93%-53,28%, hàm lượng G+C có 46,72%48,07% Từ hàm lượng loại acid nucleotid cho thấy Adenin có hàm lượng cao nhất, chiếm khoảng 30% Timin có hàm lượng tương đương khoảng 23-24% Kết kiểm tra cho thấyn đoạn ADN virus đa giác thể hại tằm thầu dầu khác rõ rệt hàm lượng A, T, G, C Kết xác định trình tự ADN chủng BmNPV 3.1 Trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus BmNPV có nguồn gốc từ Quảng Đơng ACTTTGGGGGCTGTCTTATCAAAAACGCCAAGCGCAAGAAGCACCTAGTC GAACATGAACAAGAGGAGAAGCAATGGGATCTTCTAGACAACTACATGGT TGCCGAAGATCCCTTTTTAGGACCGGGCAAAAACCAAAAACTTACCCTTT TTAAAGAAATTCGCAGTGTGAAACCCGATACCATGAAGTTAATCGTCAACT GGAGCGGCAAAGAGTTTTTGCGTGAAACTTGGACCCGTTTTGTTGAGGAC AGCTTCCCCATTGTAAACGACCAAGAGGTGATGGACGTGTACCTCGTCGC CAACCTCAAACCCACACGCCCCAACAGGTGCTACAAGTTCCTCGCTCAAC ACGCTCTTAGGTGGGAAGAAGACTACGTGCCCCACGAAGTAATCAGAATT GTGGAGCCATCCTACGTGGGCATGAACAACGAATACAGAATTAGTCTGGCT AAAAAGGGCGGCGGCTGCCCAATCATGAACATCCACAGCGAGTACACCA ACTCGTTCGAGTCGTTTGTGAACCGCGTCATATGGGAGAACTTCTACAAAC CCATCGTTTACATCGGCACAGACTCTGCCGAAGAAGAGGAAATCCTAATT GAGGTTTCTCTCGTTTTCAAAGTAAAAGAATTTGCACCAGACGCACCACT 3.2 Trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus BmNPV có nguồn gốc từ Hà Nội Lâm Đồng CTTGGGGGCTGTCTTATCAAACGCCAAGCGCAAGAAGCACCTAGTCGAAC ATGAACAAGAGGAGAAGCAATGGGATCTTCTAGACAACTACATGGTTGCC GAAGATCCCTTTTTAGGACCGGGCAAAAACCAAAAACTTACCCTTTTTAA AGAAATTCGCAGTGTGAAACCCGATACCATGAAGTTAATCGTCAACTGGA GCGGCAAAGAGTTTTTGCGTGAAACTTGGACCCGTTTTGTTGAGGACAGC TTCCCCATTGTAAACGACCAAGAGGTGATGGACGTGTACCTCGTCGCCAA CCTCAAACCCACACGCCCCAACAGGTGCTACAAGTTCCTCGCTCAACACG CTCTTAGGTGGGAAGAAGACTACGTGCCCCACGAAGTAATCAGAATTGTG GAGCCATCCTACGTGGGCATGAACAACGAATACAGAATTAGTCTGGCTAA AAAGGGCGGCGGCTGCCCAATCATGAACATCCACAGCGAGTACACCAACT CGTTCGAGTCGTTTGTGAACCGCGTCATATGGGAGAACTTCTACAAACCCA TCGTTTACATCGGCACAGACTCTGCCGAAGAAGAGGAAATCCTAATTGAG GTTTCTCTCGTTTTCAAAGTAAAAGAATTTGCACAGGGACGCCACCAA 3.3 Trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus ArNPV có nguồn gốc từ Hà Nội GGATTTGTTCTGGCGGTATCACGACTTTCGCGACGCAGACCACAGCC ACTAGTCGAACATGAACAAGAGGAGAAGCAATGGGATCTTCTAGACAACT ACATGGTTGCCGAAGATCCCTTTTTAGGACCGGGCAAAAACCAAAAACTT ACCCTTTTTAAAGAAATTCGCAGTGTGAAACCCGATACCATGAAGTTAATC GTCAACTGGAGCGGCAAAGAGTTTTTGCGTGAAACTTGGACCCGTTTTGT TGAGGACAGCTTCCCCATTGTAAACGACCAAGAGGTGATGGACGTGTACC TCGTCGCCAACCTCAAACCCACACGCCCCAACAGGTGCTACAAGTTCCTC GCTCAACACGCTCTTAGGTGGGAAGAAGACTACGTGCCCCACGAAGTAAT CAGAATTGTGGAGCCATCCTACGTGGGCATGAACAACGAATACAGAATTA GTCTGGCTAAAAAGGGCGGCGGCTGCCCAATCATGAACATCCACAGCGAG TACACCAACTCGTTCGAGTCGTTTGTGAACCGCGTCATATGGGAGAACTTC TACAAACCCATCGTTTACATCGGCACAGACTCTGCCGAAGAAGAGGAAAT CCTAATTGAGGTTTCTCTCGTTTTCAAAGTAAAAGAATTTGCACCGAACGC CACCA Từ kết xác định trình tự ADN chủng virus cho thấy virus gây bệnh bủng tằm dâu (BmNPV) tằm thầu dầu (ArNPV) có trình tự ADN khác Ngồi cịn thấy chủng BmNPV có nguồn gốc từ Hà Nội Lâm Đồng giống trình tự ADN khác chủng BmNPV có nguồn gốc Quảng Đơng IV KẾT LUẬN Từ kết tách chiết ADN sau thu thập mẫu tằm bủng số địa phương, thông qua phương pháp xác định trình tự xác định trình tự đoạn ADN chủng virus hại tằm Kết cho thấy virus gây bệnh bủng tằm dâu tằm thầu dầu có trình tự ADN khác nhau, đồng nghĩa với việc chủng virus có nguồn gốc khởi thuỷ khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Huy Trí,2004 Nghiên cứu bệnh truyền nhiễm tằm dâu Bombyx Mori Line biện pháp phịng chống chúng vùng đồng sơng Hồng Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp, trang 250-254, 68.39.43 Nguyễn Huy trí,1998 Bệnh ký sinh trùng tằm dâu Nhà xuất Giáo dục trang 37-53 (Nguồn: Tạp chí Khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam Số năm 2012 Trang 118-123 Người phản biện: PGS.TS Nguyễn Văn Viết) ... 4oC 2.5 Xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus Sử dụng NCBI BLAST để xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu thu chủng virus III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết ADN tổng số chủng virus. .. kiểm tra cho thấyn đoạn ADN virus đa giác thể hại tằm thầu dầu khác rõ rệt hàm lượng A, T, G, C Kết xác định trình tự ADN chủng BmNPV 3.1 Trình tự đoạn ADN đặc hiệu chủng virus BmNPV có nguồn gốc... trình tự ADN khác chủng BmNPV có nguồn gốc Quảng Đông IV KẾT LUẬN Từ kết tách chiết ADN sau thu thập mẫu tằm bủng số địa phương, thông qua phương pháp xác định trình tự xác định trình tự đoạn ADN