Luận án tiến sĩ y học nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI, 2019 BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số : 62 72 01 16 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Trường Sinh PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình HÀ NỘI, 2019 i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Cao Trường Sinh, PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình, nhiệt tình dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! PGS.TS Trần Thanh Dương Viện trưởng Ban Giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS TS Cao Bá Lợi tồn cán Phịng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán số vi nấm gây bệnh nội tạng người” Mã số CK.10.32/11-15 PGS.TS Nguyễn Khắc Lực, TS Đỗ Ngọc Ánh toàn thể cán bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học Quân Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập thực đề tài nghiên cứu GS.TS Lê Bách Quang, PGS.TS Nguyễn Mạnh Hùng, PGS TS Nguyễn Ngọc San,… có ý kiến đóng góp quý báu giúp tơi hồn thiện luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị em gia đình bạn bè đồng nghiệp động viên khích lệ tơi vượt qua khó khăn hồn thành luận án Luận án bước đầu nghiệp khoa học Những lời cảm ơn chưa đủ kể hết tình cảm thật ii cao q, tình cảm theo suốt đời không thay đổi! Trần Thị Quỳnh Liên iii LỜI CAM ĐOAN Đây nhánh đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán số vi nấm gây bệnh nội tạng người” Mã số CK.10.32/11-15 mà trực tiếp tham gia Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các kết quả, số liệu thu luận án trung thực chưa công bố luận án khác Các bước tiến hành thực đề tài đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ quy định tiến hành nghiên cứu Nếu có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trần Thị Quỳnh Liên iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) ADN Acid Deoxyribonucleic ARV Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút) CFU Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CNS Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương) CS Cộng CSF Cerebrospinal fluid (Dịch não tủy) DNT Dịch não tủy ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzym) EIA Enzym immunoassay (thử nghiệm miễn dịch enzym) FP False positive (Dương tính giả) FN False negative (Âm tính giả) GACA Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA) GRHP Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ) HE Hematoxylin eosin (Nhuộm HE) HIV Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn dịch người) K Kappa (Hệ số tương đồng) LAT Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex) LFA Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy) MRI Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ) NPV Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) PCR Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PAS Periodic acid schiff (nhuộm PAS) v PPV Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình đoạn phân cắt giới hạn) Se Sensitivity (Độ nhạy) SOP Standard operating procedure (Quy trình thao tác chuẩn) Sp Specificity (Độ đặc hiệu) TN True negative (dương tính giả) TP True positive (dương tính thật) vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học vai trò y học nấm Cryptococcus neoformans 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm C neoformans 1.1.2 Vai trò y học 1.1.3 Tình hình viêm màng não nấm C neoformans giới Việt Nam 1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans 13 1.2.1 Chẩn đoán trực tiếp 14 1.2.2 Chẩn đoán miễn dịch học phát kháng nguyên 16 1.2.3 Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử 17 1.3 Nghiên cứu xây dựng chuẩn hóa sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 23 1.3.1 Thiết kế chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR 25 1.3.2 Chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR 27 1.3.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương kỹ thuật 31 1.4 Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 32 1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm chẩn đốn 32 1.4.2 So sánh tính tương đồng sinh phẩm 35 1.4.3 Đánh giá tính ổn định sinh phẩm 36 1.4.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở sinh phẩm 36 vii Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 38 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: 39 2.2 Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng nghiên cứu 39 2.2.1 Cơ sở vật chất trang thiết bị, máy móc 39 2.2.2 Sinh phẩm hóa chất 39 2.2.3 Các hóa chất, sinh phẩm khác 40 2.2.4 Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm 40 2.3.2 Mẫu nghiên cứu 42 2.3.3 Nội dung nghiên cứu 44 2.3.4 Các số nghiên cứu 50 2.3.5 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 51 2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu sai số nghiên cứu 63 2.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 63 2.6 Đạo đức nghiên cứu 66 2.7 Nhiễm sai số cách hạn chế 66 2.8 Hạn chế đề tài 67 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 68 3.1 Kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 68 3.1.1 Kết giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng cho nghiên cứu 68 viii 3.1.2 Kết thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 71 3.1.3 Kết xác định điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 78 3.1.4 Kết chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 92 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy 97 3.2.1 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm phịng thí nghiệm 97 3.2.2 Kết đánh giá sinh phẩm mẫu DNT lâm sàng 102 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm định chất lượng sinh phẩm chế tạo 107 Chương BÀN LUẬN 109 4.1 Về kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 109 4.1.1 Bàn luận kết giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình 109 4.1.2 Về kết thiết kế/lựa chọn mồi xác định điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 112 4.1.3 Kết chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans 122 4.2 Bàn luận độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy 124 4.2.1 Bàn luận kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm phịng thí nghiệm 125 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction determine Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 6/2018 Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable of nestedPCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid” Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 6/2018 Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả chẩn đoán Cryptococcus neoformans dịch não tủy sinh phẩm nested-PCR với kỹ thuật nuôi cấy, soi tươi sinh phẩm PCR chẩn đoán Norgen'' Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 61/20194 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Nhữ Thị Hoa CS (2012), "Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng viêm não-màng não Cryptococcus neoformans Bệnh viện Nhiệt đới Tp.HCM từ 11/2008 đến 6/2009", Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, chuyên đề Ký sinh trùng, 16(1/2012), tr 76-82 Martins M.A; Brighente K.S; Matos T.A et al (2015), Molecular diagnosis of cryptococcal meningitis in cerebrospinal fluid: comparison of primer sets for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complex, Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(1), pp 62-67 Bicanic T; Harrison T.S (2004), Cryptococcal meningitis, British medical bulletin, 72(1), pp 99-118 Day Jeremy N (2004), Cryptococcal meningitis, Practical neurology, (11/2004), pp 274-285 Safdieh J.E; Mead P.A; Sepkowitz K.A et al (2008), Bacterial and fungal meningitis in patients with cancer, Neurology, 70(12), pp 943-947 Louie J.K; Chi N.Huu; Thao L.T.T et al (2004), Opportunistic infections in hospitalized HIV-infected adults in Ho Chi Minh City, Vietnam: a crosssectional study, International journal of STD & AIDS, 15(11), pp 758-761 Anil A Panackal; Simone C Wuest; Yen-Chih Lin et al (2015), Paradoxical Immune Responses in Non-HIV Cryptococcal Meningitis, PLOS Pathogens, 11(5), e1004884 Eileen K Maziarz and John R Perfect (2016), Cryptococcosis, Infectious disease clinics of North America, 30(1), pp.179-206 Perfect J.R (2013), Fungal diagnosis: how we it and can we better?, Current medical research and opinion, 29(sup4), pp 3-11 10 Khater W.S; Elabd S.H (2016), "Identification of Common Bacterial Pathogens Causing Meningitis in Culture-Negative Cerebrospinal Fluid Samples Using Real-Time Polymerase Chain Reaction", International Journal of Microbiology, 2016, pp 4197187 11 Tang Y.W; Stratton C.W (2012), Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, Springer US 12 M Wilks (2012), PCR Detection of Microbial Pathogens, Humana Press 13 Kwon-Chung K.J; Fraser J.A; Doering T.L et al (2014), Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis, Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 4(7), a019760 14 Fang W; Fa W; Liao W (2015), Epidemiology of Cryptococcus and cryptococcosis in China, Fungal Genetics and Biology, 78, pp 7-15 15 Kwon-Chung K.J; Varma A (2006), Do major species concepts support one, two or more species within Cryptococcus neoformans?, FEMS Yeast Research, 6(4), pp 574-587 16 Lin X; Heitman J (2006), The biology of the Cryptococcus neoformans species complex, Annu Rev Microbiol, 60, pp 69-105 17 Xiaorong Lin (2009), Cryptococcus neoformans: morphogenesis, infection, and evolution, Infection, Genetics and Evolution, 9(4), pp 401416 18 Montagna M.T; Antonella D; Caggiano G et al (2018), Molecular characterization of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii from environmental sources and genetic comparison with clinical isolates in Apulia, Italy, Environmental research, 160, pp 347-352 19 Jahromi S.B; Khaksar A.A (2006), Paranasal sinus mycosis in suspected fungal sinusitis, Arch Clin Infect Dis, 1, pp 25-29 20 Hagen F; Khayhan K; Theelen B et al (2015), Recognition of seven species in the Cryptococcus gattii/Cryptococcus neoformans species complex, Fungal Genetics and Biology, 78, pp 16-48 21 Alspaugh J Andrew (2015), Virulence mechanisms and Cryptococcus neoformans pathogenesis, Fungal genetics and biology, 78, pp.55-58 22 Infectious Disease Epidemiology Section (2017), Cryptococcosis, Office of Public Health, Louisiana Department of Health, http://ldh.la.gov/assets/oph/Center-PHCH/Center-CH/infectiousepi/EpiManual/CryptococcosisManual.pdf 23 Edwards V.E; Sutherland J.M; Tyrer J.H (1970), Cryptococcosis of the central nervous system: epidemiological, clinical, and therapeutic features, Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 33(4), pp 415-425 24 Gliksman F.J (2017), "CNS Cryptococcosis in HIV, Medscape, pp.1-8 25 Watkins R; Jason S.K; Simon A.J (2017), Nutritional requirements and their importance for virulence of pathogenic Cryptococcus species, Microorganisms, 5(4), pp 65 26 Colombo F.A; Elsemann R.B; Conde A et al (2014), Updating: cryptococcosis diagnostic aspects, Journal of AIDS and Clinical Research, 5(12) 27 Yadalla H.K.K; Rao G.R.R (2011), Cutaneous cryptococcosis: A marker of life threatening disseminated cryptococcosis in HIV AIDS, Our Dermatol Online, 2, pp 203-206 28 Olszewski M.A; Zhang Y; Huffnagle G.B (2010), Mechanisms of cryptococcal virulence and persistence, Future microbiology, 5(8), pp 12691288 29 Chen Y; Toffaletti D.L; Tenor J.L et al (2014), The Cryptococcus neoformans transcriptome at the site of human meningitis, MBio, 5(1), e01087-13 30 Park B.J; Wannemuehler K.A; Marston B.J et al (2009), Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS, Aids, 23(4), pp 525-530 31 Nalintya E; Kiggundu R; Meya D (2016), Evolution of cryptococcal antigen testing: what is new?, Current fungal infection reports, 10(2), pp.6267 32 Rajasingham R; Smith R.M; Park B.J et al (2017), Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis, The Lancet infectious diseases, 17(8), pp 873-881 33 Althea Campuzano; Floyd L Wormley (2018), Innate Immunity against Cryptococcus, from Recognition to Elimination, Journal of Fungi, 4(1), pp 33 34 Sorrell Tania C; Sharon C-A Chen; Peter Phillips et al (2011), Clinical perspectives on Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii: implications for diagnosis and management, Cryptococcus, American Society of Microbiology, pp 595-606 35 Perfect J R; Bicanic T (2015), Cryptococcosis diagnosis and treatment: what we know now, Fungal Genetics and Biology, 78, pp.49-54 36 Trần Phủ Mạnh Siêu; Lê Mạnh Hùng Trần Văn Hiển (2006), "Tình hình nhiễm vi nấm nội tạng bệnh nhân HIV/AIDS Bệnh viện Nhiệt đới 2003-2005", Y học thành phố Hồ Chí MInh, 10, tr 99-104 37 Kammalac T.N; Dongtsa J; Kouanfack C et al (2015), Cryptoccocal meningitis in Yaoundé (Cameroon) HIV infected patients: Diagnosis, frequency and Cryptococcus neoformans isolates susceptibility study to fluconazole, Journal de mycologie medicale, 25(1), pp 11-16 38 Boulware D.R; Rolfes M.A; Rajasingham R et al (2014), Multisite validation of cryptococcal antigen lateral flow assay and quantification by laser thermal contrast, Emerging infectious diseases, 20(1), pp.45–53 39 Kozel T.R; Wickes B (2014), Fungal diagnostics, Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 4(4), a019299 40 Saha C D; Immaculata X; Ashutosh B et al (2009), Detection of Cryptococcus by conventional, serological and molecular methods, Journal of medical microbiology, 58(8), pp.1098-1105 41 Rivera V; Marcela G; Cesar M.C et al (2015), Validation and clinical application of a molecular method for the identification of Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii complex DNA in human clinical specimens, The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(6), pp.563-570 42 Mitchell T G; Freedman E Z; White T J et al (1994), Unique oligonucleotide primers in PCR for identification of Cryptococcus neoformans, Journal of clinical microbiology, 32(1), pp.253-255 43 Prariyachatigul C; Chaiprasert A; Meevootisom V et al (1996), Assessment of a PCR technique for the detection and identification of Cryptococcus neoformans, Journal of medical and veterinary mycology, 34(4), pp.251-258 44 Mirhendi S.H; Kordbacheh P; Kazemi B et al (2001), A PCR-RFLP method to identification of the important opportunistic fungi: Candida species, Cryptococcus neoformans, Aspergillus famigatus and Fusarium solani", Iranian Journal of Public Health, 30(3-4), pp.103-106 45 Paschoal R.C; Hirata M.H; Hirata R.C et al (2004), Neurocryptococcosis: diagnosis by PCR method, Revista Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 46(4), pp.203-207 46 Diaz M R; Fell J W (2005), Use of a suspension array for rapid identification of the varieties and genotypes of the Cryptococcus neoformans species complex, Journal of clinical microbiology, 43(8), pp.3662-3672 47 Sugita T; Masamitsu N; Reiko I et al (2001), A nested PCR assay to detect DNA in sera for the diagnosis of deep‐seated trichosporonosis, Microbiology and immunology, 45(2), pp.143-148 48 Rappelli P; Are R; Casu G et al (1998), Development of a Nested PCR for Detection of Cryptococcus neoformans in Cerebrospinal Fluid, Journal of clinical microbiology, 36(11), pp.3438-3440 49 Rivera V; Marcela G; Cesar M.C et al (2015), Validation and clinical application of a nested PCR for paracoccidioidomycosis diagnosis in clinical samples from Colombian patients, Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(4), pp.376-383 50 Jahromi S.B; Khaksar A.A (2006), Paranasal sinus mycosis in suspected fungal sinusitis, Arch Clin Infect Dis, 1, pp 25-29 51 Bialek R; Michael W; Kubrom B.N et al (2002), Detection of Cryptococcus neoformans DNA in tissue samples by nested and real-time PCR assays, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(2), pp.461469 52 Velegraki.A; Kiosses V G; Kansouzidou A et al (2001), Prospective use of RFLP analysis on amplified Cryptococcus neoformans URA gene sequences for rapid identification of varieties and serotypes in clinical samples, Medical mycology, 39(5), pp.409-417 53 Feng X; Yao Z; Ren et al (2008), Simultaneous identification of molecular and mating types within the Cryptococcus species complex by PCR-RFLP analysis, Journal of medical microbiology, 57(12), pp.1481- 1490 54 Đỗ Ngọc Ánh CS (2015), "Xác định thành phần loài nấm men phân lập từ máu người kỹ thuật PCR-RFLP", Tạp chí Y dược lâm sàng 108, 10(9/2015), tr 51-56 55 Đỗ Ngọc Ánh CS (2013), "Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh người", Tạp chí Y học Việt Nam, 4(1/2013), tr 79-85 56 Sousa D.R.T; Santos C.S.S; Wanke B et al (2015), PCR-RFLP as a useful tool for diagnosis of invasive mycoses in a healthcare facility in the North of Brazil, Electronic Journal of Biotechnology, 18(3), pp.231-235 57 Ito‐Kuwa S; Nakamura K; Aoki S et al (2007), Serotype identification of Cryptococcus neoformans by multiplex PCR, Mycoses, 50(4), pp.277-281 58 Rhein J; Nathan C B; Andrew C H et al (2016), Diagnostic performance of a multiplex PCR assay for meningitis in an HIV-infected population in Uganda, Diagnostic microbiology and infectious disease, 84(3), pp.268-273 59 Leal A.L; Faganello J; Cristina B.M (2008), Cryptococcus species identification by multiplex PCR, Medical mycology, 46(4), pp.377-383 60 Taira C.L; Okay T.S; Delgado A.F et al (2014), A multiplex nested PCR for the detection and identification of Candida species in blood samples of critically ill paediatric patients, BMC infectious diseases, 14(1), pp.406 61 Nguyễn Trọng Chính Nguyễn Duy Bắc (2017), Nấm Cryptococcus neoformans Sinh học, bệnh học, chẩn đoán, điều trị, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 62 Tavares E.R; Azevedo C.S; Panagio L.A et al (2015), Accurate and sensitive real-time PCR assays using intergenic spacer region to differentiate Cryptococcus gattii sensu lato and Cryptococcus neoformans sensu lato, Medical mycology, 54(1), pp.89-96 63 Bialek R; Kubrom B.N; Michael W et al (2002), Detection of Cryptococcus neoformans DNA in tissue samples by nested and real-time PCR assays, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(2), tr pp.461-469 64 Eberling A J; Jill B.S; Monica M R et al (2011), Development, optimization, and validation of a Classical swine fever virus real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay, Journal of veterinary diagnostic investigation, 23(5), pp.994-998 65 Klein K R; Hall L; Deml S M et al (2009), Identification of Cryptococcus gattii by use of L-canavanine glycine bromothymol blue medium and DNA sequencing, Journal of clinical microbiology, 47(11), pp.3669-3672 66 Veron V; Simon S; Blanchet D et al (2009), Real-time polymerase chain reaction detection of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii in human samples, Diagnostic microbiology and infectious disease, 65(1), pp.69-72 67 Satoh K; Maeda M; Umeda Y et al (2011), Detection and identification of probable endemic fungal pathogen, Cryptococcus gattii, and worldwide pathogen, Cryptococcus neoformans, by real‐time PCR, Microbiology and immunology, 55(6), pp.454-457 68 Cidiane G.M; Rocha S.F; Christo P.P et al (2016), Use of Polymerase chain Reaction for Cryptococcus neoformans Genome Detection in Cerebrospinal Fluid for Neurocryptococcosis Diagnosis, Med Mycol Open Access, 2(2: 13) 69 Abd-Elsalam K.A (2003), Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design, african Journal of biotechnology, 2(5), pp.91-95 70 Nelson Ndegwa (2013), PCR Primer Desig http://hpc.ilri.cgiar.org/beca/training/IMBB/lectures/PCR_Primer_Design_2013.pdf 71 Apte A; Daniel S (2009), PCR primer design, Cold Spring Harbor Protocols, 2009(3), doi pdb ip65 72 Tabone T; Mather D.E; Hayden M (2009), Temperature switch PCR (TSP): Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs, BMC genomics, 10(1), pp.580 73 Scott M.C; Harmon J.R; Tsao J.I et al (2012), Reverse line blot probe design and polymerase chain reaction optimization for bloodmeal analysis of ticks from the eastern United States, Journal of medical entomology, 49(3), pp.697-709 74 Naeger D.M; Kohi M.P; Webb E.M et al (2013), Correctly using sensitivity, specificity, and predictive values in clinical practice: how to avoid three common pitfalls, American Journal of Roentgenology, 200(6), pp.W566-W570 75 Nugent W.R (2005), The role of prevalence rates, sensitivity, and specificity in assessment accuracy: Rolling the dice in social work process, Journal of social service research, 31(2), pp.51-75 76 Nishikawa R.M; Pesce L.L (2013), Estimating sensitivity and specificity for technology assessment based on observer studies, Academic radiology, 20(7), pp 825-830 77 Cruz M.L; Perez A; Domínguez M.et al (2016), Assessment of the sensitivity and specificity of serological (IFAT) and molecular (direct‐PCR) techniques for diagnosis of leishmaniasis in lagomorphs using a Bayesian approach, Veterinary Medicine and Science, 2(3), pp.211-220 78 Mackenzie D (2017), Statistical aspects of screening tests, including knowledge of and ability to calculate, sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, and the use of ROC curves Https://www.healthknowledge.org.uk 79 Trevethan R (2017), Sensitivity, specificity and Predictive values: Foundations, Pliabilities, and Pitfalls in research and Practice, Frontiers in public health, 5, pp 307 80 Nugent W R (2005), "The role of prevalence rates, sensitivity, and specificity in assessment accuracy: Rolling the dice in social work process", Journal of social service research, 31(2), pp.51-75 81 Hetal S Shah (2011), Evaluation of conventional and serological methods for rapid diagnosis of Cryptococcal meningitis in HIV seropositive patients at tertiary care hospital, National Journal of Community Medicine, 2(3), pp.354-357 82 Binnicker M.J; Jespersen D.J; Bestrom J.E et al (2012), "A comparison of four assays for the detection of cryptococcal antigen", Clinical and Vaccine Immunology, CVI 00446-12 83 Margaret V.P; Kimberly E.H (2016), Nonculture diagnostics in fungal disease, Infectious Disease Clinics, 30(1), pp.37-49 84 Klausner J.D; Vijayan T and Chiller T (2013), Sensitivity and specificity of a new cryptococcal antigen lateral flow assay in serum and cerebrospinal fluid, MLO: medical laboratory observer, 45(3), pp.16-20 85 Bộ Y Tế (2017), Hướng dẫn lấy mẫu, đóng gói, bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm, Y Học, Hà Nội, 44 86 Bộ Y tế (2017), Kỹ thuật vi sinh, Nhà xuất Y Học, Hà Nội, 303 87 Dyal J; Akampurira A; Rhein J et al (2016), Reproducibility of CSF quantitative culture methods for estimating rate of clearance in cryptococcal meningitis, Sabouraudia, 54(4), pp.361-369 88 Luo G; Mitchell T.G (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, journal of clinical microbiology, 40(8), pp 2860–2865 89 Lalkhen A.G (2008), Clinical tests: sensitivity and specificity, Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain, 8(6), pp.221-223 90 Carvajal D.N; Rowe P.C (2010), Sensitivity, specificity, predictive values, and likelihood ratios, Pediatr Rev, 31(12), pp.511-513 91 Idnurm A; Lin X (2015), Rising to the challenge of multiple Cryptococcus species and the diseases they cause, Fungal Genetics and Biology, 78, pp.1-6 92 Raja H.A; Miller A.N; Pearce C.J et al (2017), Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community, Journal of Natural Products, 80(3), pp.756-770 93 Zhao J; Kong F; Li R et al (2001), Identification of aspergillus fumigatus and related species by nested PCR targeting ribosomal DNA internal transcribed spacer regions", Journal of Clinical Microbiology, 39(6), pp.2261-2266 94 Kumari S; Verma R.K; SinghD.P et al (2016), Comparison of Antigen Detection and Nested PCR in CSF Samples of HIV Positive and Negative Patients with Suspected Cryptococcal Meningitis in a Tertiary Care Hospital, Journal of Clinical and Diagnostic Research : JCDR, 10(4), pp DC12DC15 95 Paschoal RC et al (2004), Neurocryptococcosis: diagnosis by PCR method, Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 46(4), pp.203–207 96 Đỗ Ngọc Ánh CS (2014), "Nghiên cứu phát nấm Cryptococcus neoformans kỹ thuật Nested-PCR", Tạp chí phịng chống Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, (3/2014), tr.75-80 97 Guizhen Luo et al (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, J Clin Microbiol, 40(8), pp 2860–2865 98 Đỗ Ngọc Ánh (2015), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát nhiễm Candida sp Cryptococcus neoformans dịch não tủy (Đề tài cấp Bộ Quốc phòng), Học viện Quân y, Hà Nội 99 Đỗ Ngọc Ánh CS (2013), "Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh người", Tạp chí Y học Việt Nam, 4(1/2013), tr.79-85 100 Martins M.A; Brighente K.B; Matos T.A et al (2015), Molecular diagnosis of cryptococcal meningitis in cerebrospinal fluid: comparison of primer sets for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complex, The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(1), pp.62-67 101 Dharmshale S; Bharadwaj R (2015), Role of Polymerase Chain reaction (PCR) amplifying conserved 5.8S and ITS regions of the cryptococcal DNA in the diagnosis of Cryptococcal meningitis, 2015, 4(2), pp.5 102 Takahashi T; Goto M; Kanda T et al (2003), Utility of testing bronchoalveolar lavage fluid for cryptococcal ribosomal DNA, Journal of international medical research, 31(4), pp.324-329 103 Chen Y C; Eisner J D; Kattar M M et al (2001), Polymorphic internal transcribed spacer region DNA sequences identify medically important yeasts, J Clin Microbiol, 39(11), pp.4042-51 104 Mirhendi S.H et al (2001), A PCR-RFLP method to Identification of the Important Opportunistic Fungei: Candida Species, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus and Fusarium solani, Iranian J Publ Health, 30(3-4), pp 103-106 105 Victor A Ma et al (2013), Rapid screening of Candida albicans yeasts associated with vulvovaginal candidiasis in Tanzania using Nested PCR, International Journal of Research in Biological Sciences, 3(3), pp.136-140 106 Guizhen Luo et al (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, Journal of Clinical Microbiology, 40(8), pp.2860–2865 107 Hsu M.C; Chen K.W; Lo H.J et al (2003), Species identification of medically important fungi by use of real-time LightCycler PCR, Journal of medical microbiology, 52, pp.1071-1076 108 Coovadia Y.M.C; Mahomed S; Dorasamy A et al (2015), A comparative evaluation of the Gram stain and India ink stain for the rapid diagnosis of cryptococcal meningitis in HIV infected patients in Durban, Southern African Journal of Infectious Diseases, 30(2), pp.61-63 109 Mbae N.G (2017), Laboratory Diagnosis of Cryptococcal Meningitisin Human Immunodeficiency Virus Infection and Acquired Immune Deficiency Syndrome Patients at Moi Teaching and Referral Hospital, International Journal of Innovative Research and Development, 6(3) 110 Tanner D.C; Weinstein M.P; Fedorciw B et al (1994), Comparison of commercial kits for detection of cryptococcal antigen, Journal of clinical microbiology, 32(7), pp.1680-1684 111 Josephs K.A; Ahlskog J.K; Parisi J E et al (2009), Rapidly progressive neurodegenerative dementias, Archives of neurology, 66(2), pp.201-207 112 Kabanda T; Siedner M.J; Klausner J.D et al (2013), Point-of-care diagnosis and prognostication of cryptococcal meningitis with the cryptococcal antigen lateral flow assay on cerebrospinal fluid, Clinical infectious diseases, 58(1), pp.113-116 113 Tang M.W; Clemons K.V; Katzenstein D.A et al (2016), The cryptococcal antigen lateral flow assay: A point-of-care diagnostic at an opportune time, Critical reviews in microbiology, 42(4), pp.634-642 ... tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học Quân Học vi? ??n Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Vi? ??n Chợ R? ?y; Khoa Vi sinh Bệnh vi? ??n Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh vi? ??n Quân y 103; Bệnh vi? ??n Bệnh Nhiệt đới... v? ?y, để xác định nguyên g? ?y vi? ?m não, màng não cần phải dựa vào xét nghiệm cận lâm sàng [1],[2],[3] Trong số loài vi nấm g? ?y vi? ?m não màng não, nấm Cryptococcus neoformans xác định loài g? ?y vi? ?m... não t? ?y độ nh? ?y phản ứng huyết ngưỡng 100% độ nh? ?y 99,5 huyết 100% 97,7% dịch não t? ?y Độ nh? ?y hay ngưỡng phát LFA so với LA hay ELISA tăng gấp 200 lần [84] Wang cs (2015) đánh giá độ nh? ?y, độ