Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học quốc tế đồng ý tất tác giả báo, chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị khác Tất trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật (Bản) tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập, thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Ngun Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp) TS Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên cứu đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu đáp ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản) tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để thực hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới postdoc, kỹ thuật viên nhân viên nhóm nghiên cứu TS Trần Phan Lam Sơn, nơi thực nội dung luận án hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện vể thời gian cho tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị vợ ủng hộ, động viên, khích lệ chỗ dựa tinh thần cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án nghiên cứu Ngồi ra, tơi gửi lời cảm ơn tới bạn bè đồng nghiệp ln ủng hộ có ý kiến đóng góp q báu để tơi hồn thành luận án nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu luận án 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hạn hán ảnh hưởng bất lợi hạn hán trồng 1.1.1 Những thiệt hại ngành trồng trọt hạn hán gây 1.1.2 Hạn hán nguyên nhân gây hạn hán trồng 11 1.1.3 Ảnh hưởng hạn trồng 12 1.1.3.1 Ảnh hưởng hạn tới sinh trưởng phát triển trồng 13 1.1.3.2 Ảnh hưởng hạn tới đặc điểm hình thái giải phẫu 14 1.1.3.3 Ảnh hưởng hạn tới mối quan hệ nước 15 1.1.3.4 Ảnh hưởng hạn tới trình quang hợp 15 1.1.3.5 Ảnh hưởng hạn tới trình hô hấp 17 1.1.3.6 Ảnh hưởng hạn tới hấp thu dinh dưỡng khoáng 18 1.1.3.7 Ảnh hưởng hạn tới cân hormone 18 1.1.3.8 Ảnh hưởng hạn tới hàm lượng protein, axit amin khoáng chất 19 iii 1.1.3.9 Ảnh hưởng hạn tới lipid 22 1.1.3.10 Ảnh hưởng hạn tới q trình oxy hóa 22 1.1.3.11 Ảnh hưởng hạn tới phân tử 23 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn 24 1.3 Vai trị yếu tố phiên mã NAC q trình đáp ứng với stress hạn trồng 27 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC 27 1.3.2 Cấu trúc đặc trưng protein NAC 29 1.3.3 Chức yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với hạn trồng 29 1.4 Vai trò họ đậu 35 1.4.1 Vai trò đậu tương 35 1.4.2 Vai trò đậu gà 37 1.4.3 Ảnh hưởng hạn tới đậu tương đậu gà 39 1.5 Cải thiện khả chống chịu hạn họ đậu sử dụng kỹ thuật chuyển gen 43 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 Vật liệu nghiên cứu 47 2.1.1 Vật liệu thực vật 47 2.1.2 Các chủng khuẩn, nấm men vector 47 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng cho PCR qRT-PCR 47 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 47 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 47 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 48 2.3 Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Trồng xử lý đậu tương 48 2.3.2 Tách chiết, tinh RNA tổng hợp cDNA cho tách dòng gen GmNAC085 48 2.3.3 Thiết kế cấu trúc vector phân tích khả hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 49 iv 2.3.4 Thiết kế cấu trúc vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 50 2.3.5 Phương pháp biến nạp sàng lọc Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 52 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 35S:GmNAC085 kỹ thuật lai southern blot 53 2.3.7 Đánh giá khả sinh trưởng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện thường 53 2.3.8 Phương pháp đo hàm lượng diệp lục 54 2.3.9 Đánh giá khả chịu hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 54 2.3.9.1 Phương pháp đánh giá hạn khay 55 2.3.9.2 Phương pháp cân trọng lượng cốc 55 2.3.10 Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt WT chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 56 2.3.11 Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion độ ẩm đất 56 2.3.12 Xác định hàm lượng malondiadehyde khả hoạt động enzyme chống oxy hóa 57 2.3.13 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu gà 57 2.3.14 Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, tổng hợp cDNA cho phân tích qRT-PCR 58 2.3.15 Phân tích biểu gen kỹ thuật qRT-PCR 58 2.3.16 Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm 59 2.3.17 Phân tích ý nghĩa thống kê 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với điều kiện hạn mơ hình Arabidopsis 61 3.1.1 Kết thiết kế cấu trúc vector phân tích hoạt động phiên mã GmNAC085 nấm men 61 3.1.2 Kết phân lập thiết kế vector biểu gen GmNAC085 mơ hình Arabidopsis 63 v 3.1.3 Kết sàng lọc lựa chọn dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 66 3.1.4 Kết đánh giá kiểu hình Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 OE2 điều kiện thường 68 3.1.5 Kết đánh giá khả kháng hạn Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 70 3.1.6 Kết đánh giá mức độ phá hủy tế bào tốc độ thoát nước chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện xử lý hạn 72 3.1.7 Sự biểu GmNAC085 tăng cường bảo vệ Arabidopsis chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa stress hạn gây 74 3.1.8 Sự biểu GmNAC085 làm tăng mức biểu gen thị Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 điều kiện stress hạn 77 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen CaNAC đậu gà điều kiện xử lý hạn ABA 84 3.2.1 Kết so sánh tỷ lệ thành phần nước hai giống đậu gà Hashem ILC482 điều kiện xử lý nước 84 3.2.2 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý hạn 85 3.2.3 Đặc trưng biểu gen CaNAC rễ giống Hashem ILC482 điều kiện xử lý ABA 94 3.2.4 Sự biểu khác gen CaNAC giống ILC482 Hashem 102 3.2.5 Sự biểu khác gen CaNAC rễ giống ILC482 Hashem 105 3.2.6 Lựa chọn gen CaNAC tiềm cho nghiên cứu chức sâu 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 134 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic Ade Adenine A-đê-nin ABRC3 ABA response complex Phức hợp đáp ứng ABA AD Activation domain Vùng trình tự hoạt hóa AP2/ERF APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng element binding factors với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase AREB/ABF Abscisic acid-responsive Liên kết yếu tố đáp ứng ABA element binding ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphat bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza CCA1 Circadian clock associated Liên kết nhịp sinh học cDNA complementary DNA ADN bổ sung CO2 Carbon dioxide cacbon điơxít CSD1 Copper/Zinc superoxide Copper/Zinc superoxide dismutase dismutase D Drought Xử lý hạn DAD Days after drought Ngày sau xử lý hạn DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive Protein liên kết với yếu tố đáp element-binding protein ERD1 GM Early ứng nước to Đáp ứng sớm với bất lợi responsive dehydration stress nước Germination medium Môi trường nảy mầm vii GR Glutathione reductase Glutathione reductase His Histidine Histidin IAA Indole-3-acetic acid Axit indole-3-acetic LB Lysogeny broth Môi trường giàu dinh dưỡng nuôi khuẩn E.coli LEA Late embryogenesis abundant Sự phát triển phôi muộn LHY Late elongated hypocotyl Chậm kéo dài trụ mầm MDA Malondiadehyde Malondialdehyd MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol miRNA microRNA ARN không mã hóa mRNA Messenger RNA RNA thơng tin MYB/MYC MYB/MYC transcription Yếu tố phiên mã MYB/MYC factor NAC NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC ATAF1/2, CUC2 (cup- shaped cotyledon) NACRS NAC recognition sequence NADPH Nicotinamide adenine Nicotinamit dinucleotide phosphate NCED Nine-cis-epoxy Trình tự nhận biết NAC adenin dinucleotit phosphat carotenoid Nine-cis-epoxy carotenoid dioxygenase dioxygenase O2- Superoxide Superoxit OE Overexpression Sự biểu PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase POD Peroxidase Peroxidase PSI Photosystem I Hệ thống quang hợp I PSII Photosystem II Hệ thống quang hợp II qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng thời gian thực viii ... PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201... khoa học với tiêu đề ? ?Nghiên cứu vai trò yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn họ đậu? ?? Trong đó, nghiên cứu tập trung làm rõ chức gen GmNAC085 trình đáp ứng với hạn hán đối tượng mơ hình... Ảnh hưởng hạn tới phân tử 23 1.2 Sự đáp ứng trồng với hạn 24 1.3 Vai trò yếu tố phiên mã NAC trình đáp ứng với stress hạn trồng 27 1.3.1 Tổng quan yếu tố phiên mã NAC