NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NI CÁ RƠ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM Ngành đào tạo : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 62540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HỊA - 2017 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: GS TSKH Nguyễn Trọng Cẩn Trường Đại học Nha Trang PGS TS Vũ Ngọc Bội Trường Đại học Nha Trang Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Lại Văn Hùng Trường Đại học Nha Trang Phản biện 3: TS Nguyễn Duy Nhứt Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi giờ, ngày 21 tháng 10 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Nha Trang DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Hương Thủy (2009), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng bã thải từ sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi”, Hội thảo Khoa học Đánh giá kết thực đề tài, dự án Công nghệ Sinh học Nông nghiệp -Thủy sản giai đoạn 2007 - 2008, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, Tr 193-195 Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thủy, Lê Thị Lan Oanh (2010), “Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng thủy phân bã thải agar”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải sản, Số 15, tr 20 – 24 Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc, Lê Thị Lan Oanh (2011), “Tối ưu hóa điều kiện sinh cellulase ngoại bào từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B-505 Bacillus lichenformis Li môi trường lên men công nghiệp”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải sản, Số 19, tr 20 - 25 Lê Hương Thủy (2011), “Nghiên cứu ứng dụng bã rong thủy phân sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải sản,Số 22, tr 19 -26 Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc (2011), “Nghiên cứu sàng lọc tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng thủy phân bã thải agar”, Tạp chí KHCN Nơng nghiệp phát triển nông thôn, Tr 140 – 148 Lê Hương Thủy (2013), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng bã thải sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn ni Tạp chí KHCN Nơng nghiệp phát triển nông thôn Tr 275 - 284 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Rong biển loại nguyên liệu có chứa nhiều chất tự nhiên có giá trị cao sử dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp, y dược thực phẩm như: agar, carrageenan,… Trong công nghệ chế biến sản phẩm từ rong biển cơng nghệ sản xuất agar từ rong câu ý nghiên cứu nhiều agar sử dụng nhiều lĩnh vực đời sống…Trên giới, ước tính sản lượng agar vào khoảng 7.000 - 10.000 tấn/năm Ở Việt Nam, sản lượng rong tươi vào khoảng 3000 tấn/ năm, phần lớn dùng để sản xuất agar carrageenan Hàng năm, nước ta sản xuất khoảng 500 agar Trong trình chế biến agar, lượng phế thải hữu thải môi trường cao vào khoảng - phế thải/1 sản phẩm, ước tính lượng phế thải từ trình chế biến rong nước ta vào khoảng 7000-9000 Bã thải rong có chứa lượng lớn chất hữu nên thải môi trường thường bị phân hủy gây mùi hôi thối ảnh hưởng đến sức khỏe người Vì việc nghiên cứu tìm kiếm hướng xử lý tận thu cách hợp lý nguồn bã thải rong cần thiết góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường tận dụng nguồn phế thải hữu cách hiệu Trong bã thải rong thường chứa protein, khoáng chất có nguồn gốc từ biển iod, phosphate, nguyên tố vi lượng hữu ích cho sinh trưởng phát triển động vật nuôi Đặc biệt, bã rong có chứa lượng lớn cellulose – thành phần khó tiêu hố động vật Do nghiên cứu công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi cá từ bã rong phế thải mang lại hiệu kinh tế giúp tận dụng lượng phế thải cách có hiệu Nhưng quan trọng giúp giảm thiểu nguy gây ô nhiễm mơi trường Ngồi cịn giúp tiết kiệm chi phí xử lý chất thải cho nhà máy chế biến agar Do việc nghiên cứu tận dụng bã rong câu mang tính cấp bách thực tế sản xuất Từ yêu cầu thực tiễn nêu trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng sản xuất thức ăn ni cá rơ phi đơn tính giai đoạn thương phẩm” Ý nghĩa thực tiễn luận án Luận án lần Việt Nam sử dụng enzyme cellulase từ vi khuẩn xử lý bã thải rong sau sản xuất agar sử dụng dịch thủy phân bã rong làm thức ăn nuôi cá rơ phi Luận án có ý nghĩa khoa học cao kết nghiên cứu Luận án khẳng định hồn tồn ứng dụng enzyme cellulase để chuyển bã thải rong sau sản xuất agar thành sản phẩm hữu ích dùng ni cá rơ phi quy mô công nghiệp Thành công đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ công nghệ sản xuất agar giúp nâng cao giá trị rong câu vàng, giảm chi phí sản xuất ni cá rô phi đem lại hướng trọng tận dụng bã thải rong sau chế biến Mục tiêu luận án Sử dụng phế thải rong câu sản xuất Agar để tạo nguồn nguyên liệu bổ sung vào thức ăn chăn ni, góp phần giảm thiểu nhiễm môi trường Nội dung nghiên cứu luận án 1) Đánh giá lượng bã thải rong xác định thành phần bã thải rong sau sản xuất agar 2) Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh cellulase cao từ sưu tập giống vi khuẩn Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội 3) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ chủng vi khuẩn lựa chọn ứng dụng thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) sau sản xuất agar 4) Thử nghiệm sử dụng sản phẩm thủy phân bã rong enzyme cellulase từ vi khuẩn sản xuất thức ăn ni cá rơ phi đơn tính giai đoạn thương phẩm Tính luận án Từ 17 chủng vi sinh vật giống có khả sinh enzyme cellulase ngoại bào Viện Công nghệ Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia khảo sát, sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase Cx ngoại bào có hoạt tính cao Bacillus lichenformis (Li) Bacillus subtilis VTCC-B-505 để thủy phân cellulose bã thải rong câu sử dụng vào sản xuất thức ăn chăn ni góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trường, giảm chi phí xử lý phế thải mang lại nguồn thức ăn q giá cho vật ni Bố cục luận án Luận án bao gồm 127 trang, chia làm chương, 33 bảng số liệu, 24 hình, sơ đồ, 10 biểu đồ 146 tài liệu tham khảo (Tiếng Việt 40 tài liệu, Tiếng Anh 102 tài liệu, tài liệu tra cứu internet tài liệu) CHƯƠNG TỔNG QUAN Ở nước có kinh tế phát triển người ta chăn ni gia súc, gia cầm theo phương thức công nghiệp địi hỏi cung cấp lượng lớn thức ăn với chất lượng cao, ổn định, hệ số hấp thụ cao giá thành rẻ Do việc tận dụng nguồn phế liệu để sản xuất thức ăn cho chăn ni giá thành rẻ coi tính chiến lược Nhiều quốc gia tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu cung cấp chất xơ sản xuất thức ăn gia súc Phụ phẩm nông nghiệp sản phẩm phụ thu từ từ trồng như: rơm lúa, thân ngô, thân lạc, mía, bã mía, cỏ khơ, bã sắn,… Nguồn phụ liệu thường nghèo chất dinh dưỡng, hàm lượng chất xơ cao, tỷ lệ tiêu hóa thấp dùng làm thức ăn chăn nuôi Sản lượng agar giới ước tính đạt khoảng 7.000 đến 10.000 tấn/năm Theo số liệu thống kê năm 1992 sản lượng rong đỏ giới 1.256.981 (Fao year book of fishery statistic, 1992), sản lượng agar sản xuất tiêu thụ năm 1984 6685 (Coppen, 1989) Đặc thù công nghệ sản xuất Agar lượng phế thải hữu tương đối cao khoảng phế thải/1 sản phẩm Nếu không tận thu gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng lãng phí nguồn phế liệu Qua tài liệu việc khảo sát trạng xử lý chất thải sở sản xuất Agar cho thấy, việc xử lý bã thải Agar quan tâm Đặc biệt chất thải hữu cơ, bã rong có chứa lượng nước cao, chất hữu dễ phân huỷ thối rữa gây mùi chua thối độc hại cho người Vì vậy, vấn đề xúc cần giải sớm tốt Thành phần hàm lượng chất bã thải agar phụ thuộc vào quy trình cơng nghệ sản xuất agar, nhìn chung chứa 15 -20% chất khô, độ ẩm khoảng 7580% Thành phần chất khơ có bã rong bao gồm khoảng 40-50% hợp chất hữu cơ, chủ yếu cellulose (sơ sợi), chất dinh dưỡng, protein – % 50-60% hợp chất vơ cơ, đó, có khoảng 55% muối vô không tan nước nhiều nguyên tố vi lượng [10] Nhiều nghiên cứu khoa học cho thấy, phần lớn lượng protein rong đỏ tồn dạng hợp chất với glucid Do đó, muốn sử dụng hiệu protein rong để phục vụ chăn ni bã rong cần phải xử lý hố học sử dụng công nghệ sinh học lên men phân giải để phá huỷ liên kết nhóm ngoại glucid với phân tử protein phức hợp glucoprotein Khi đó, enzyme protease động vật tiêu hoá hấp thụ protein đồng thời với thành phần hữu ích khác Số lượng lồi vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có điều kiện tự nhiên phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn số trường hợp, nhà khoa học thấy nấm men tham gia qúa trình phân giải Các chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase có ý nghĩa có nhiều ứng dụng rộng rãi thực tiễn ứng dụng rộng rãi đời sống Hải Phòng nơi tập trung xưởng sản xuất agar, tính mơ khác có khoảng 40 xưởng với tổng sản lượng agar ước tính sản xuất đạt 500 tấn/năm với tổng doanh thu khoảng 60 tỷ đồng giải công ăn việc làm cho hàng nghìn lao động vấn đề xử lý phế thải vấn đề nan giải cho nhà máy sản xuất agar Các bã thải đa số xử lý cách đào hố chôn vùi ủ làm phân bón cho trồng gây mùi hôi thối, ô nhiễm môi trường khu vực sản xuất dân cư Các sở sản xuất người dân sinh sống gần nơi đổ phế thải nhà quản lý quan tâm đến việc xử lý phế thải nói Việc tận dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất thức ăn chăn ni vừa có ý nghĩa thực tiễn, kinh tế bảo vệ môi trường CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng 2.1.1 Bã thải rong sau sản xuất agar Bã thải rong sau sản xuất agar thu nhận từ sở sản xuất agar Công ty TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Quận Kiến An, thành phố Hải Phịng Sau q trình nấu chiết thu agar, bã agar loại thải qua giai đoạn lọc khung Mẫu lấy ngẫu nhiên lần nấu chiết sau ép để giảm bớt hàm lượng nước bảo quản nhiệt độ lạnh 2.1.2 Giống vi sinh vật sinh cellulase Các chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng qúa trình nghiên cứu lấy từ sưu tập giống vi sinh vật sinh cellulase Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam sưu tập giống vi sinh vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội 2.1.3 Cá rô phi giống 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân tích + Xác định hàm lượng protein theo TCVN 4328-1:2007 (ISO 5983-1:2005) + Xác định hàm lượng nước theo TCVN 4326:2001 (ISO 6596:1999) + Xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:2007 (ISO 5984:2002) + Xác định hàm lượng cellulose AOAC No 973.09.1997/TCVN 4329:2007 (ISO 6865:2000) + Xác định hàm lượng lipit TCVN 4331:2001 + Xác định nấm mốc độc theo HPLC 3.19-05-2/CL1/ST + Xác định NaCl theo TCVN 4330:1986 + Xác định Canxi theo TCVN 1526: 2007 + Xác định Phospho theo TCVN 1525 - 2001 + Phân tích nguyên tố kim loại máy quang phổ hấp phụ nguyên tử 2.2.2 Các phương pháp thu nhận xác định hoạt tính cellulase 2.2.2.1 Phương pháp thu nhận enzym cellulase thơ 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase phương pháp xác định đường khử 2.2.3.3 Phương pháp xác định độ bền chế phẩm enzym cellulase theo thời gian bảo quản 2.2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính cellulase phương pháp điện di 2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính tương đối thủy phân bã agar 2.2.3 Phương pháp ni cấy đánh giá hoạt tính sinh cellulase vi sinh vật 2.2.3.1 Các phương pháp nuôi vi sinh vật 2.2.3.2 Đánh giá sinh trưởng vi khuẩn 2.2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh cellulase vi sinh vật 2.2.3.4 Phương pháp xác định pH tối ưu enzym cellulase 2.2.3.5 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu enzym cellulase 2.2.3.6 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn B505 Li lựa chọn Lựa chọn môi trường nuôi cấy: tiến hành xác định khả sinh trưởng tiết enzyme cellulase ngoại bào chủng Li B505 số loại chất Xác định thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH nuôi cấy tối ưu cho khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào vi khuẩn 2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm tổng quát 2.2.4.2 Bố trí thí nghiêm tối ưu hóa q trình thủy phân bã thải rong enzym cellulase 2.4.4.3 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong thức ăn nuôi cá rô phi 2.2.4.3 Phương pháp xây dựng phần công thức thức ăn 2.2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm thức ăn bổ sung bã rong thủy phân nuôi cá rô phi 2.2.4.5 Phương pháp xác định thơng số ni cá rơ phi 2.3 Hóa chất thiết bị 2.3.1 Hóa chất Carboxymethyl cellulose (CMC), Glucose, Pepton, cao thịt, tinh bột, cao nấm men, cao malt, MgSO4, CaCl2, K2HPO4, NaHCO3, NaCl,… hóa chất nhập ngoại hãng có uy tín giới Sigma, Merk, Bio-Canada,… 2.3.2 Thiết bị Các thiết bị chủ yếu bao gồm: Tủ ủ, Tủ sấy, Thiết bị thủy phân có khuấy đảo, Máy ly tâm, Cân, Máy đo pH, Máy quang phổ UV vis, máy xay, máy nghiền, máy ép viên thức ăn, Các thí nghiệm nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Phịng Nghiên cứu công nghệ Sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Hải sản Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học, có sẵn thiết bị, máy móc đại, có độ xác cao đảm bảo cho việc thực đề tài 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Phân tích thống kê số liệu sử dụng tiêu chuẩn t-test, xử lý số liệu tối ưu phần mềm Design Expert version 6.0 (DX6), phần mềm Excell K-graph sử dụng để phân tích vẽ đồ thị [1], [4] (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) môi trường kinh tế mơi trường MT1’ + Về hoạt tính cellulase chủng B lichenformis (Li): Kết nghiên cứu trình bày hình cho thấy điều kiện dinh dưỡng môi trường MT5 (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) chủng Li có khả sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase cao có đường kính vịng thủy phân 1,12 cm cao gấp 1,24 lần so với MT2; cao gấp 1, 27 lần so với MT2’ MT4, ; cao gấp 1,33 lần so với MT3 MT6 Như môi trường MT5 môi trường thích hợp cho hai chủng Li B505, sở đề tài tiến hành xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 Bacillus lichenformis (Li) 3.3.1.2.Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Vì thí nghiệm tiến hành khảo sát khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào chủng B505 Li nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45 50ºC 250C 300C Li 35oC B505 Li B505 40ºC Li B505 45ºC Li Li B505 B505 Hình 3.6 Khả sinh trưởng vịng hoạt tính chủng B505 chủng Li nhiệt độ khác 13 Nhiệt độ mơi trường có ảnh hưởng lớn sinh trưởng vi sinh vật Trên thực tế, vi sinh vật thường sinh vật đơn bào chúng mẫn cảm với biến đổi nhiệt độ, thường bị biến đổi với biến đổi nhiệt độ mơi trường Từ phân tích cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng B505 sinh trưởng tiết cellulase 300C nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Li sinh trưởng phát triển, sinh cellulase 450C 3.3.1.3 Xác định pH nuôi cấy tối ưu pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn Vì chúng tơi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào B505 Li 4 8 6 Hình 3.7 Vịng hoạt tính cellulase chủng B505 chủng Li nuôi cấy pH khác pH có ảnh hưởng rõ rệt sinh trưởng vi sinh vật Mỗi vi sinh vật có phạm vi pH sinh trưởng định pH sinh trưởng tốt Phần lớn vi khuẩn động vật nguyên sinh ưa trung tính pH 5,5-8,0 Kết bảng 3.7 cho thấy khả tiết cellulase ngoại bào chủng B505 chủng Li chịu ảnh hưởng nồng độ pH khác cách rõ rệt Chủng B505 nuôi môi trường pH = tiết cellulase mạnh chủng Li tiết cellulase mạnh ni mơi trường có pH= 3.3.1.4 Thời gian nuôi cấy tối ưu Thời gian nuôi cấy nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng khả sinh enzyme chủng vi khuẩn Trong q trình ni cấy xác định 14 hoạt tính B subtilis VTCC-B-505 B lichenformis (Li) theo dõi mốc thời gian Họa tính tương đối (%) 100 90 80 70 60 24 48 60 72 96 Thời gian nuôi cấy (h) Biểu đồ 3.8 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng Li theo thời gian ni cấy Hoạt tính tương đối cellulase (% so với cực đại) 100 90 80 70 60 24 48 60 72 96 Thời gian nuôi cấy (giờ) Biểu đồ 3.9 Sự thay đổi hoạt tính cellulase chủng B505 theo thời gian nuôi cấy Từ kết phân tích hình 3.8 hình 3.9 cho thấy chủng Li sau 60 ni cấy tiết cellulase ngoại bào mạnh sau 60 nuôi cấy chủng B505, enzym CMCase ngoại bào thô thu có hoạt tính đạt 99 % so với hoạt tính enzym CMCase ngoại bào thu 72 nuôi cấy Như 60 nuôi cấy chủng B505 thu dịch enzyme cho hiệu kinh tế cao nhất, tiết kiệm giá thành sản xuất Các kết nghiên cứu ghi nhận sau: điều kiện tối ưu cho sinh trưởng sinh cellulase có hoạt tính chủng vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B505 Bacillus lichenformis (Li), môi trường MT5; pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời gian 60 phút 15 3.3.2 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm cellulose thơ Chủng giống vi sinh vật VTCC-B-505 Li) A Phổ điện di cellulase chế phẩm enzyme Nhân giống cấp (pH=5; T=12-14h; to=28oC) Nhân giống cấp (pH= 5; T=12-14h; to = 28oC) Lên men (B505: T= 60h, to = 30oC, 200v/ph; Li: T= 72h, to = 45oC, 200v/ph) Thu nhận dịch cellulaza ngoại bào (Ly tâm 12000 v/ph; T= 10 ph; to = 4oC) Li B505 Li B505 Marker Chế phẩm cellulase ngoại bào thô (B505 hoạt độ 72 UI/ml; Li hoạt độ 54 UI/ml) Sơ đồ 3.10 Quy trình thu nhận chế phẩm cellulase thơ 3.3.3 So sánh đánh giá hoạt tính cellulose chủng Li B505 với chế phẩm cellulose từ VSV khác So sánh hoạt tính cellulase ngoại bào chủng Li B505 với enzym ngoại bào chủng nấm Tricoderma Aspergillus enzym cellulase chủng Bacillus T3 Viện Công nghệ Sinh học cung cấp phương pháp xác định hoạt tính cellulase mơi trường chứa chất CMC (môi trường tối ưu để phát enzym Cx) mơi trường Cell có bổ sung bột giấy (môi trường tốt cho enzym C1 hoạt động) 16 Hình 3.11 Đường kính vịng thủy phân cellulase từ Li, B505 T3trên đĩa thạch có chất CMC 0,2% Hình 3.12 Đường kính vịng thủy Hình 3.13 Hoạt tính cellulase phân cellulase từ Tricoderma đĩa Aspergillus đĩa thạch có chất thạch có chất CMC 0,2 % CMC 0,2 % Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A niger nuôi môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase từ T konigii nuôi môi trường Cell; Mẫu 3: Cellulase từ A niger nuôi môi trường Zapek; Mẫu 4: Cellulase từ T konigii nuôi môi trường Zapek; Mẫu 5: Cellulase từ T konigii nuôi môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6: Cellulase từ A niger ni mơi trường riêng cho chủng 17 Hình 3.14 Hoạt tính cellulase chủng nấmTricoderma Aspergillus ni mơi trường khác đĩa thạch có chứa chất bột giấy 0,2 % Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A niger nuôi môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase từ T konigii nuôi môi trường Cell; Mẫu 3: Cellulase từ A niger nuôi môi trường Zapek; Mẫu 4: Cellulase từT konigii nuôi môi trường Zapek; Mẫu 5: Cellulase từ T konigii nuôi môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6: Cellulase từ A niger ni mơi trường riêng cho chủng Hình 3.15 Hình ảnh đường kính vịng thủy phân cellulase từ Li, B505 T3 đĩa thạch có chất bột giấy 0,2 % 18  Về hoạt tính cellulase chủng VSV đĩa thạch có chất CMC 0,2% Kết hình 3.12 ÷ 3.13 cho thấy chủng nấm Aspergillus niger, Tricoderma konigii nuôi cấy điều kiện môi trường tối ưu cho nấm hoạt tính cellulase ( Cx) thủy phân chất CMC yếu chủng vi khuẩn B505, Li T3 Enzym Cx chủng B505 có hoạt tính gần tương đương với hoạt tính Cx chủng T3 (một chủng Bacillus sinh cellulase sử dụng chế phẩm Viện Công nghệ Sinh học).Như chủng B505 chủng Li tiết enzym cellulase Cx ngoại bào mạnh nhiều so với cellulase ngoại bào chủng nấm Tricoderma Aspergillus  Về hoạt tính cellulase chủng VSV đĩa thạch có chất bột giấy 0,2% Kết hình 3.14 ÷ 3.15 cho thấy chủng nấm Tricoderma konigii ni mơi trường Zapek cho hoạt tính cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh Tuy nhiên chủng vi khuẩn B505, Li sinh cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh gần chủng nấm Tricoderma konigii Các số liệu thu phù hợp với kết tác giả khác, cellulase chủng nấm thường có hoạt tính C1 cao hơn, hoạt tính Cx thấp cellulase chủng vi khuẩn Như chủng vi khuẩn T3, B505 Li có khả thủy phân chất CMC bột giấy có hiệu cao Việc nuôi cấy vi khuẩn thu chế phẩm enzym thường đơn giản rẻ tiền so với nuôi cấy chủng nấm Trong nhóm vi khuẩn, chủng thuộc chi Baccillus chiếm ưu (87%) ứng dụng vào xử lý phế thải , chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh bào tử nên có khả tồn sinh trưởng tốt đống ủ phế thải có nhiệt độ cao Giá thành để sản xuất 1lit chế phẩm enzym thô dạng lỏng mà đề tài nghiên cứu cần 40.000 ÷45.000 đồng Trong chế phẩm cellulase thơ Công ty Phát triển Sinh học 186 Ngô Gia Tự, Hà Nội sản xuất giá 250.000 đồng/1 lit chế phẩm Các chế phẩm cellulase nhập ngoại giá thành cao, sử dụng để thuỷ phân bã thải agar đại trà.Việc nghiên cứu thu nhận enzym cellulase từ vi sinh vật giúp đề tài chủ động khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất lại rẻ so với enzym thương mại sản xuất nước 19 Kết thu cho thấy cellulase từ hai chủng B505 Li có hoạt tính Cx C1 cao so với cellulase từ chủng nấm Aspergillus niger, Tricoderma konigii, không chủng T3 chế phẩm Viện Cơng nghệ sinh học Như sử dụng chủng B505 Li riêng biệt, hay đồng thời hai chủng để thu nhận cellulase làm chế phẩm sinh học để thuỷ phân bã thải agar cho hiệu cao Việc nghiên cứu thu nhận enzym cellulase có khả thủy phân bã agar từ chủng B505 Li giúp chủ động khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất rẻ nhiều so với enzym thương mại sản xuất nước 3.3.4 Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar enzym cellulase từ hai chủng vi khuẩn B 505 Li 3.3.4.1 Tối ưu hóa trình thủy phân bã rong cellulase vi khuẩn Trên sở thí nghiệm thăm dị để chọn vùng ảnh hưởng yếu tố (nồng độ enzyme so với chất, thời gian thuỷ phân, pH, nhiệt độ) đến q trình thủy phân, tiến hành tối ưu hóa phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng mơ hình thiết kế BoxBehnken trình thủy phân bã thải agar với thông số biên sau: nồng độ enzyme với chất (1 % - 3%), thời gian thủy phân (24 - 48 giờ), nhiệt độ 40 – 60 0C Cố định yếu tố: pH 6,5 Kết thí nghiệm cho thấy có mối liên hệ hàm bậc hàm lượng đường tổng số (mg/g) với thời gian thủy phân (giờ), nồng độ Enzyme so với chất (%) nhiệt độ thủy phân (0C) (P F lack of fit = 0,8081) Y= 2,77 + 0,15 X1 + 0,21X2 + 0,058X3 - 1,12X12 - 0,13X22 + 0,071 X32 – 0,11X1X2 + 0,078 X1X3 – 0,068 X2X3 Trong đó: Y: hàm lượng đường tổng số (mg/g) X1: Thời gian thủy phân (giờ) X2: Tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với chất (%) X3: Nhiệt độ (0C) Kết xử lý thống kê cho thấy khoảng nghiên cứu hai yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường tổng số (mg/g) thời gian thủy phân (p=0.0137) nồng độ enzym so với chất (p= 0,0026) Thời gian thủy phân nồng độ enzyme tăng 20 hàm lượng đường tổng số (mg/g) tăng Kết xử lý thống kê cho thấy nhiệt độ thủy phân ảnh hưởng khơng đáng kể đến q trình thủy phân (p=0,2538), hay nói cách khác khoảng nhiệt độ nghiên cứu từ 40 – 60 0C việc nhiệt độ thủy phân không làm tăng hàm lượng đường tổng số (mg/g) Hình 3.16 Đường đồng mức bề mặt đáp ứng (3D) hàm lượng đường tổng số (mg/g) theo thời gian thủy phân (giờ) nồng độ Enzyme so với chất (%) Kết dự đoán vùng tối ưu cho hàm lượng đường tổng số (mg/g) thể hình 3.16 Kết vùng tối ưu hàm lượng đường tổng số (mg/g) 2,98 (mg/g) Hình 3.17: Đường đồng mức bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường tổng số (mg/g) tối ưu theo thời gian thủy phân (giờ) nồng độ Enzyme so với chất (%) Kết kiểm chứng thực nghiệm cho thấy có tương thích lý thuyết thực nghiệm Hàm lượng đường tổng số 2,68 ± 0,09 (%) thủy phân bã thải agar chế 21 phẩm enzym thô nhiệt độ 600C, pH = 5,5 thời gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzym so với chất 2,6 % Kết đánh giá cảm quan cho thấy bã rong mềm, bóp nhẹ bã rong nát, màu nâu sáng, mùi rong Sản phẩm thủy phân protein thu từ bã thải agar sử dụng để phối trộn sản xuất thức ăn chăn ni Từ chọn điểm tối ưu nhiệt độ 600C, pH = 5,5 thời gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với chất 2,6 % 3.3.4.2 Đề xuất quy trình thủy phân bã rong cellulase từ vi khuẩn Từ kết nghiên cứu đề tài rút quy trình sản xuất chế phẩm thủy phân bã rong dạng bột sau: Bã thải Agar Thủy phân (pH=5,5; E/S= 2,6 %, to = 60oC) Phối trộn Enzym cellulase Cám gạo (10%) Làm khô Xay nghiền Chế phẩm thủy phân bã rong dạng bột Hình 3.18 Quy trình thuỷ phân bã rong cellulase từ vi khuẩn 3.4 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CHẾ PHẨM THUY PHÂN BÃ THẢI RONG TRONG THỨC ĂN NUÔI CÁ RƠ PHI 3.4.1 Xây dựng cơng thức thức ăn nuôi cá rô phi Dựa vào đặc điểm sinh học nhu cầu dinh dưỡng theo giai đoạn phát triển cá rô phi, dựa vào nhu cầu protein lipit làm chuẩn để thay đổi cơng thức thích hợp, tính tốn tỷ lệ cho phù hợp để đáp ứng nhu cầu lượng protein cho thức ăn nuôi cá rô phi 22 Từ lựa chọn nguyên liệu trên, tiến hành xác định thành phần hóa học loại nguyên liệu phối trộn dùng phần mềm WUFFF DA tính tốn thành phần dinh dưỡng công thức phối trộn thức ăn cá rô phi 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn ni cá rơ phi Sơ đồ quy trình Bã thải Agar Nguyên liệu Enzym cellulase Xử lý Thủy phân Chế phẩm bã thải agar thủy phân Phối trộn Ép viên Sấy khơ Thức ăn ni cá Hình 3.19 Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi 3.4.3 Kết nuôi thử nghiệm cá rô phi 3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng công thức thức ăn đến sinh trưởng cá rô phi Nghiên cứu ảnh hưởng protein đến sinh trưởng cá rô phi tiến hành thử nghiệm Cá rô phi nuôi 18 giai có kích thước (3m x 2m x m) loại thức ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ phối trộn 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% có hàm lượng protein 25% tương ứng với nghiệm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Số đơn vị thí nghiệm tương ứng 18 đơn vị thí nghiệm (18 giai nuôi) Mật độ nuôi con/m2 Khối lượng trung bình cá bắt đầu thí nghiệm 205,9 ± 4,3 g/con Cá cho ăn hàng ngày lần vào 8h sáng 16h cho ăn suốt thời gian thí nghiệm Khẩu phần cho ăn hàng ngày tùy thuộc vào giai đoạn cá: từ 40 – 100g/con 5% khối lượng thân, 100 – 150g/con 4% khối lượng thân giai đoạn 23 từ 150 – 200g/con 3% khối lượng thân Khẩu phần cho ăn điều chỉnh theo tăng trưởng cá cách bắt ngẫu nhiên 10 cá thể cá đem cân sau 20 ngày ni để có khối lượng trung bình làm sở ước tính lượng cá nghiệm thức thí nghiệm Tốc độ sinh trưởng khối lượng cá thí nghiệm sau 80 ngày ni trình bày Hình 3.19 ÷ 3.20 Hình 3.20 Tốc độ sinh trưởng (g/con) DWG (g/ngày) cá rô phi với thức ăn phối trộn bã rong thủy phân khác sau 80 ngày ni Qua kết hình 3.19 cho thấy khối lượng cá sáu công thức có tăng lên khối lượng Khối lượng trung bình giai ni thử nghiệm từ 652 đến 765 g Cơng thức thức ăn có hàm lượng protein 25% với tỷ lệ phối trộn bã rong thủy phân 15%/ khối lượng có tăng trọng tốt với trọng lượng cao 765 ±4,2 (g tốc độ tăng trưởng cao 4,65±0,03 (g/ngày) Thức ăn có hàm lượng protein 25% (Pr25) với công thức đối chứng không phối trộn bã rong thủy phân có tốc độ tăng trưởng thấp suốt q trình ni thí nghiệm, trung bình tăng trưởng 3,52 ± 0,04 (g/ngày) 2,67 2,38 Hệ số thức ăn 2,5 1,92 1,57 1,69 1,84 1,5 0,5 CT1 Ct CT 3Công thứcCT CT CT Hình 3.21 Hệ số chuyển đổi thức ăn nuôi thử nghiệm công thức thức ăn Tỷ lệ sống hệ số thức ăn cá sau thời gian nuôi thử nghiệm nghiệm thức đối chứng (CT1) khơng có phối trộn bã rong thủy phân 76,4 % 2,67 Trong 24 nghiệm thức thức ăn có phối trộn thêm bã rong thủy phân có hệ số thức ăn từ 1,57 đến 2,4 tỷ lệ sống từ 80,6% - 88,5% Nếu so sánh với số kết ni tác giả cơng bố tỷ lệ sống cao nhiều Kết thử nghiệm nuôi cá rô phi công thức thức ăn CT4 CT5 cho thấy công thức thức ăn CT4 CT5 cho kết nuôi tốt công thức khác do: trình thủy phân bã thải rong enzyme cellulase, polyme cellulose, hemicellulose, bị thủy phân thành đơn phân đường glucose, loại đường đơn thường dễ hấp thu qua thành ruột Mặt khác, chế phẩm thủy phân từ bã thải rong cịn chứa khống chất, ngun tố vi lượng chất khác từ bã thải rong Do vậy, thức ăn ni cá rơ phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, cung cấp đủ khoáng chất, nguyên tố vi lượng có nguồn gốc từ biển thức ăn bình thường Mặt khác loại thức ni cá rơ phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong lại chứa chất thủy phân dạng đơn phân (ví dụ glucose) nên dễ hấp thụ Do vậy, nuôi cá rơ phi thức ăn có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, cá lớn nhanh hơn, hệ số thức ăn thấp 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: 1) Kết khảo sát đánh giá bã thải rong sau sản xuất agar số doanh nghiệm sản xuất agar từ rong câu Hải phòng số địa phương khác cho thấy hàng năm doanh nghiệp sản xuất agar Hải Phòng thải 3.500 bã thải rong có thành phần sau: hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose 74,26 ± 4,68%; hàm lương tro 12,28 ± 3,77 % có hàm lượng kim loại nặng mức cho phép Bộ Y tế 2) Đã tiến hành nghiên cứu, sàng lọc khả sinh enzyme cellulase 17 chủng vi sinh vật sưu tập giống vi sinh vật Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội lựa chọn chủng: B subtilis VTCC-B-505 (B505) B lichenformis (Li) có hoạt tính sinh cellulase cao 3) Khi ni cấy điều kiện tối ưu để chủng vi khuẩn B subtilis VTCC-B505 B lichenformis (Li) sinh enzyme cellulase với hoạt tính cao: mơi trường MT5 (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit); pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời gian 60 phút, hai chủng vi khuẩn B substilis VTCC-B-505 B lichenformis Li có khả sinh cellulase với nồng độ cao, tương ứng 72UI/ml 54 UI/ml 4) Xác định số điều kiện tối ưu cho trình thủy phân bã rong câu sau sản xuất agar chế phẩm cellulase từ chủng vi khuẩn (B substilis VTCC B505 B lichenformis Li): nhiệt độ thích hợp 600C, pH thích hợp 5,5, thời gian thủy phân tối ưu 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với chất 2,6 % Sản phẩm thủy phân bã thải agar dạng bột có độ mịn tơi, mùi đặc trưng rong biển khơ có hàm lượng protein 4,55 %, xơ thô 23,12%, độ ẩm 12,97 % 5) Bước đầu khẳng định bả thải rong câu xử lý thích hợp chế phẩm enzyme cellulase từ vi khuẩn sử dụng để bổ sung (khoảng 15%) vào thành phần thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính, mang lại hiệu kinh tế cao (tỷ lệ cá sống 26 cao 80 %, hệ số thức ăn thấp 1,57 - 1,94), đồng thời góp phần xử lý chất thải làm môi trường KIẾN NGHỊ Từ nghiên cứu cho phép đề xuất kiến nghị: 1) Tiến hành sản xuất cellulase từ chủng B subtilis VTCC-B-505 (B505) B lichenformis (Li) qui mô lớn để thu chế phẩm enzym cellulase dùng công nghiệp thủy phân bã rau câu sau sản xuất agar 2) Thử nghiệm sản xuất thức ăn bổ sung chế phẩm bã thải agar thủy phân theo công thức Luận án đề xuất để triển khai ni cá rơ phi số lồi cá nước quy mô công nghiệp 27 ... chủng: Bacillus lichenformis (Li), Bacillus subtilis VTCC-B-505, Bacillus subtilis VTCC-B-26 CFd) Với điều kiện pH (5,5) nhiệt độ (5 0-6 0oC) tối ưu cho thấy enzym cellulase ngoại bào chủng Li... VTCC-B505 Bacillus lichenformis (Li), môi trường MT5; pH 5-7 ; nhiệt độ 30 – 450C, thời gian 60 phút 15 3.3.2 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm cellulose thơ Chủng giống vi sinh vật VTCC-B-505... nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội lựa chọn chủng: B subtilis VTCC-B-505 (B505) B lichenformis (Li) có hoạt tính sinh cellulase cao 3) Khi ni cấy điều kiện tối ưu để chủng vi khuẩn B subtilis VTCC-B505