CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁTQUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG)

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6831-1:2010 ISO 11348-1:2007 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN MỚI NUÔI CẤY Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using freshly prepared bacteria Lời nói đầu TCVN 6831-1:2010 thay TCVN 6831-1:2001 (ISO 11348-1:1998) TCVN 6831-1:2010 hoàn toàn tương đương ISO 11348-1:2007 TCVN 6831-1:2010 Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 6831 Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế mẫu nước đến phát quang vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) gồm tiêu chuẩn sau: - TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn nuôi cấy; - TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô lỏng; - TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông khô Lời giới thiệu Phép đo quy định TCVN 6831 (ISO 11348) tiến hành sử dụng vi khuẩn nuôi cấy, vi khuẩn đông khơ khơ lỏng Cơng việc tiêu chuẩn hóa DIN Normenausschuss Wasserwesen ISO/TC 147/SC 5/WG tiến hành cho thấy, trường hợp đặc biệt, kỹ thuật khác cho kết khác nhau, đặc biệt có mặt kim loại nặng Độ nhạy thay đổi khác thành phần môi trường sử dụng để chuẩn bị vi khuẩn đông khô khô lỏng Các môi trường bảo vệ ảnh hưởng đến tính có sẵn sinh học chất độc và/hoặc phát quang vi khuẩn phát quang Điều có nghĩa nguồn gốc phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần xem xét biểu thị kết Đơi khi, việc khó khăn, vi khuẩn đơng khơ khơ lỏng nhà cung cấp khác Do vậy, việc có nghĩa thành phần chi tiết người sử dụng khơng thể diễn giải Vì lý này, ngồi phép đo độc tính dùng vi khuẩn khơ lỏng TCVN 6831-2 (ISO 11348-2) vi khuẩn đông khô TCVN 6831-3 (ISO 11348-3), quy trình dùng vi khuẩn ni cấy mơ tả tiêu chuẩn này, tính thực quy trình người sử dụng diễn giải chi tiết Phịng thí nghiệm chịu trách nhiệm kết có hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp dựa lời khuyên chuyên gia thông tin mẫu nước thử nghiệm CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN MỚI NUÔI CẤY Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using freshly prepared bacteria CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn cần phải thành thạo với thực hành phòng thí nghiệm thơng thường Tiêu chuẩn khơng đề cập tới vấn đề an toàn liên quan đến người sử dụng Trách nhiệm người sử dụng phải xác lập độ an toàn, bảo đảm sức khỏe phù hợp với quy định quốc gia QUAN TRỌNG - Điều chủ yếu phép thử theo tiêu chuẩn cần tiến hành nhân viên đào tạo phù hợp Phạm vi áp dụng TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quy định ba phương pháp xác định ức chế phát quang vi LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177) TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1) quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn nuôi cấy Tiêu chuẩn áp dụng cho: - Nước thải; - Dịch chiết dịch ngâm chiết nước; - Nước (nước mặt nước ngầm); - Nước mặn nước lợ; - Dịch rửa giải trầm tích (nước ngọt, nước lợ nước biển); - Nước giếng khoan; - Chất ô nhiễm đơn, pha loãng nước Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượng nước - Xác định oxy hòa tan - Phương pháp đầu đo điện hoá TCVN 6184 (ISO 7027), Chất lượng nước - Xác định độ đục ISO 5667-16, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples (Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học mẫu) Nguyên tắc Sự ức chế phát quang cấy vi khuẩn Vibrio fischeri xác định cách thử nghiệm theo mẻ Điều thực việc kết hợp thể tích quy định mẫu thử mẫu pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng ống thử Chuẩn phép thử giảm độ phát quang mẫu thử suốt thời gian tiếp xúc, cường độ phát quang mẫu đo sau thời gian phản ứng 15 30 đo thêm sau min, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu (fkt) Ảnh hưởng ức chế mẫu nước xác định LID (xem Phụ lục B) giá trị EC 20 và/hoặc giá trị EC50 thơng qua dãy pha lỗng (EC nồng độ ảnh hưởng) Các chất gây nhiễu Các chất khơng tan, tan dễ bay chất có phản ứng với nước pha lỗng với huyền phù, làm thay đổi trạng thái chúng q trình thử, ảnh hưởng đến kết làm giảm độ tái lập kết thử Trong trường hợp nước đục đậm màu, xảy phát quang việc hấp thụ ánh sáng tán xạ ánh sáng gây Sự gây nhiễu đơi khắc phục cách xử lý độ đục mẫu (7.2) hoặc, ví dụ, cách sử dụng cuvet hiệu hấp thụ hai ngăn (xem Phụ lục A) Vì phát quang sinh học[6] cần đến oxy, nên mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) gây thiếu hụt oxy mẫu bị ức chế Các chất dinh dưỡng dễ phân hủy sinh học mẫu làm giảm tự nhiễm việc phát quang sinh học[1] Mẫu có pH nằm ngồi khoảng từ 6,0 đến 8,5 ảnh hưởng đến phát quang vi khuẩn phải điều chỉnh pH mẫu ảnh hưởng độc pH không mong muốn [6],[7] Cần Vì vi khuẩn thử nghiệm Vibrio fishcheri vi khuẩn biển, nên việc thử nghiệm mẫu nước mặn theo quy trình chuẩn thường dẫn đến hiệu ứng kích thích phát quang sinh học mà che hiệu ứng ức chế (xem Phụ lục D) Nồng độ muối mẫu ban đầu vượt 30 g/l NaCI, hàm lượng thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, với lượng muối cần phải thêm vào thử gây hiệu ứng siêu thẩm thấu Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối có mẫu thử không vượt độ thẩm thấu dung dịch NaCI 35 g/l Thuốc thử vật liệu Sử dụng hóa chất đạt chất lượng tinh khiết phân tích Dùng nước cất nước có độ tinh khiết LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn tương đương 5.1 Vi khuẩn thử Sử dụng chủng vi khuẩn phát quang thuộc loại Vibrio fischeri NRRL B - 11177 Chủng vi khuẩn mua ngồi thị trường dạng thuốc thử đông-khô khô-lỏng từ chủng ni cấy, ví dụ Deutsche Sammlung fur Mikroganis und Zellkuturen Gmbh, Mascheroder Weg 10, D-38124 Braunschweug, Germany, NRRL, ARS culture collection NCAUR, 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA Các huyền phù vi khuẩn dùng để xác định độc tính cần phải ni cấy 5.2 Dung dịch natri clorua, làm chất pha lỗng Hịa tan 20 g natri clorua (NaCI) nước thêm nước đến lít 5.3 Dung dịch natri hydroxit, ví dụ c(NaOH) = mol/l 5.4 Axit clohydric, ví dụ c(HCI) = mol/l Để điều chỉnh pH sử dụng axit bazơ nồng độ thấp cao 5.5 Dung dịch dùng cho vi khuẩn nuôi cấy 8,0 g D(+)- Glucoza ngậm nước (C6H12O6.H2O) 20,0 g Natri clorua (NaCI) 2,035 g Magie clorua ngậm sáu nước (MgCI2.6H2O) 0,30 g Kali clorua (KCI) 11,9 g N- (2- Hydroxyetyl) piperazin-N- (2- axit etanesunfonic) (HEPES) Hòa tan thành phần nước, khuấy 30 điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 dung dịch natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) Thêm nước đến lít Dung dịch bảo quản phần nhiệt độ -18 °C tới -20 °C 5.6 Chất chuẩn Chuẩn bị riêng rẽ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng dung dịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnh pH: 219,8 mg/l Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnSO4.7H2O) mg/l 3,5-dichlorophenol (C6H4OCI2) (Độ tinh khiết ≥ 99%) 22,6 mg/l Kali dicromat (K2Cr2O7) Các nồng độ xấp xỉ gấp hai lần giá trị EC 50 mong đợi chất chuẩn tương ứng tiêu chuẩn Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch có sẵn ngồi thị trường có nồng độ ZnSO4 K2Cr2O7 (titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc chất chuẩn 5.7 Dịch lỏng dùng để cấy sơ cấy 30 g Natri clorua (NaCI) 6,10 g Natri dihydrophosphat ngậm nước (NaH2PO4.H2O) 2,75 g Kali hydrophosphat ngậm ba nước (K2HPO4.3H2O) 0,204 g Magie sunfat ngậm bảy nước (MgSO4.7H2O) 0,500 g Hydrophosphat diammoni [(NH4)2.HPO4] ml Glyxerol 5,00 g Caso- pepton 0,50 g Dịch chiết nấm men Hòa tan thành phần nước điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 dung dịch natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) Thêm nước đến lít Chuyển lần 50 ml vào bình Erlenmeyer (ví dụ dung tích 250 ml) khử trùng nồi hấp nhiệt độ 121 °C 20 Caso-pepton cao men nhiều hãng cung cấp nên có chất lượng khác Trong trường hợp có trở ngại (ví dụ: ức chế phát triển), cần mua sản phẩm hãng khác LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 5.8 Môi trường thạch để cấy vi khuẩn gốc Điều chỉnh dịch lỏng cấy (5.7) đến pH 7,0 ± 0,2 Thêm hòa tan 12 g thạch cho lít cách làm ấm nhẹ; khử trùng chuyển sang đĩa Petri vô khuẩn 5.9 Môi trường bảo vệ 66 g D(+)-Glucoza ngậm nước (C6H12O6.H2O) 4g Natri clorua (NaCI) 2g L-histidin 0,5 g Albumin huyết bò, BSA Hịa tan hồn tồn thành phần nước 37 °C, cần dùng natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 nhiệt độ phòng Thêm nước đến 100 ml Sử dụng môi trường bảo vệ để không gây ảnh hưởng đến tế bào vi khuẩn trình làm lạnh BSA nhiều hãng cung cấp có chất lượng khác Trong trường hợp có trở ngại cần mua sản phẩm hãng khác Chuẩn bị môi trường bảo vệ trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ 6.1 Hộp kiểm soát nhiệt độ, để trì mẫu thử nhiệt độ 15 °C ± °C Trong lần thử nghiệm nhiệt độ dao động tối đa ± 0,3 °C 6.2 Bể điều nhiệt hộp kiểm soát nhiệt độ, để trì dung dịch tích 12 ml chuẩn bị 5.5 (ví dụ bình thuốc thử) nhiệt độ 15 °C ± °C 6.3 Máy đo độ phát quang, ngăn đo mẫu trì nhiệt độ 15 °C ± °C, có trang bị cuvet phù hợp 6.4 Cuvet thử, làm chất liệu trơ hóa học, thích hợp để sử dụng với ngăn đo độ phát quang chọn có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn phù hợp với hộp kiểm soát nhiệt độ (6.1) 6.5 pH-mét 6.6 Đồng hồ tính 6.7 Pipet pittơng bơm tiêm nhựa, 10 µl, 500 µl 1000 µl 6.8 Pipet pittơng có dung tích thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml 200 µl đến 5000 µl 6.9 Máy li tâm lạnh 6.10 Máy khuấy từ que khuấy từ 6.11 Tủ ấm lắc rung, để ủ bình Erlenmeyer 6.12 Nồi hấp 6.13 Tủ ủ 6.14 Máy đo phổ máy đo quang kính lọc cuvet, có chiều dài quang học cm 6.15 Vịng cấy (hoặc kim cấy) 6.16 Máy đo độ dẫn 6.17 Tủ lạnh sâu, để bảo quản dung dịch huyền phù 6.18 Đầu đo oxy, Theo TCVN 7325 (ISO 5814) Lấy mẫu xử lý sơ mẫu 7.1 Lấy mẫu Mẫu phải đựng vật chứa sạch, trơ hóa học quy định ISO 5667-16 Nạp đầy mẫu vào vật chứa gắn kín Thử nghiệm mẫu sớm tốt sau lấy mẫu Nếu cần, bảo quản mẫu nhiệt độ từ °C đến °C vật chứa nơi tối không 48 h Nếu phải bảo quản mẫu đến hai tháng để mẫu nhiệt độ ≤ -18 °C Khơng sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu Cần chỉnh -pH thêm muối trước thử LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 7.2 Chuẩn bị mẫu Đo nồng độ oxy tất mẫu Nồng độ oxy cần phải > mg/l thử nghiệm Nếu nồng độ oxy mẫu chưa pha lỗng nhỏ mg/l, phải sử dụng phương pháp làm đủ oxy cho mẫu, ví dụ sục khí khuấy Đo pH tất mẫu Nếu pH khoảng từ 6,0 đến 8,5 khơng cần phải điều chỉnh Tuy nhiên, việc chỉnh giá trị pH làm biến đổi chất mẫu Mặt khác, pH mẫu pH mẻ thử khác khả đệm mơi trường thử Có thể cần phải thực thử nghiệm hai mẫu: mẫu điều chỉnh-pH mẫu chưa điều chỉnh-pH Nếu cần, điều chỉnh-pH mẫu cách thêm axit clohydric (5.4) dung dịch natri hydroxit (5.3) Tùy thuộc vào mục đích phép thử điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 giới hạn (8,5 ± 0,2) giới hạn (6,0 ± 0,2) Lựa chọn nồng độ axit clohydric dung dịch natri hydroxit cho thể tích thêm vào khơng lớn % tổng thể tích Cho thêm 20 g natri clorua cho lít vào mẫu nước vào mẫu nước trung hòa Đối với mẫu có nồng độ muối cao đo độ muối cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm thấu tới NaCI 20 g/l Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/l NaCI tương đương, không cần thêm muối Nồng độ muối tạo nên mẫu thử không vượt độ thẩm thấu 35 g/l dung dịch natri clorua Phụ lục D cung cấp thêm thông tin mẫu nước mặn Các mẫu đục cần để lắng h cho ly tâm, ví dụ 10 5000 g lọc Sử dụng chất lọc cho phép thử Cấy vi khuẩn phát quang 8.1 Cấy vi khuẩn gốc Chuyển vi khuẩn phát quang chủng Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1), điều kiện vô khuẩn sang đĩa Petri chứa môi trường thạch dùng nuôi cấy vi khuẩn gốc (5.8) Ủ tủ ấm từ ngày đến ngày nhiệt độ 20 °C ± °C Đánh dấu khuẩn lạc riêng lẻ phát quang cách quan sát mắt bóng tối, bảo quản đĩa tủ lạnh Chuyển khuẩn lạc đánh dấu điều kiện vô khuẩn sang đĩa sau thời gian bảo quản tuần tối đa hai tuần Các lọ vi khuẩn bảo quản có bán sẵn thường khơng phân phối điều kiện vô khuẩn Để nuôi cấy vi khuẩn tinh khiết nên dùng vài chủng khuẩn lạc đơn Để tránh biến đổi tính di truyền, mở sử dụng lọ vi khuẩn bảo quản tháng lần CHÚ THÍCH: Độ phát quang khuẩn lạc phát quang bị giảm trình bảo quản 8.2 Chuẩn bị nuôi cấy sơ Dưới điều kiện vô trùng, cho 50 ml dịch lỏng nuôi cấy sơ (5.7) vào bình tam giác (dung tích khoảng 250 ml) có khuẩn lạc đơn lẻ phát quang chất cấy gốc ủ từ ngày đến ngày Lắc 21 h ± h 20 °C ± °C với 180 r.min-1 Xác định độ đục dịch pha loãng phần 10 chất cấy dung dịch natri clorua (5.2), ví dụ, 578 nm, tính đơn vị hấp thụ formazin (FAU), quy định TCVN 6184 (ISO 7027) 8.3 Chuẩn bị ni cấy Cho 50 ml dịch lỏng ni cấy (5.7) với thể tích thích hợp chất cấy sơ (8.2) vào bình tam giác 250 ml cho có độ đục ước tính ban đầu 10 đơn vị FAU Lắc 20 h ± h 20 °C ± °C với 180 r.min-1 Xác định độ đục, tính FAU, dịch pha lỗng phần 10 dung dịch natri clorua (5.2) đo quang 578 nm CHÚ THÍCH: Khi tuân thủ điều kiện nêu trên, chất cấy khơng pha lỗng thường cho độ đục từ 700 FAU đến 800 FAU 8.4 Chuẩn bị huyền phù gốc Làm lạnh sơ dung dịch natri clorua (5.2) môi trường bảo vệ (5.9) đá LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Ly tâm huyền phù vi khuẩn thu từ dung dịch cấy (8.3) nhiệt độ °C ± °C máy ly tâm làm lạnh trước, từ 15 đến 20 6000 g ± 2000 g Đối với 50 ml chất cấy chính, gạn bỏ phần hòa phần cặn ml đến 10 ml dung dịch natri clorua làm lạnh trước (5.2) Ly tâm lại điều kiện Đối với 50 ml chất cấy chính, gạn bỏ phần hòa phần cặn 0,5 ml dung dịch natri clorua làm lạnh trước (5.2) Chuyển huyền phù vi khuẩn vào cốc thí nghiệm (ví dụ dung tích 100 ml) làm lạnh trước đặt cốc lên đá lạnh Thêm từ từ khoảng ml cho 50 ml chất cấy môi trường bảo vệ (5.9) điều kiện làm lạnh liên tục nước đá khuấy Tiến hành xác định độ đục dịch pha loãng phần 100 với dung dịch natri clorua (5.2) phương pháp đo quang Thêm thật nhanh môi trường bảo vệ làm lạnh trước (5.9) đạt độ đục ước tính 2500 FAU ± 500 FAU tương đương (xem Chú thích 8.1) Để chuẩn bị huyền phù gốc thích hợp, mililit huyền phù dung dịch natri clorua nên cho thêm 10 ml môi trường bảo vệ Khi cho thêm môi trường bảo vệ độ phát quang sinh học bị giảm rõ rệt, xuất lại sau thêm dung dịch pha loãng Tiếp tục khuấy 15 để thu hỗn hợp đồng Cho hỗn hợp vào cuvet thử thích hợp (6.4), cuvet 100 µl Để thuận tiện nên dùng loại cuvet sử dụng quy trình tiếp sau (Điều 9) Để sử dụng sau này, bảo quản huyền phù gốc tủ đá ≤ -20 °C CHÚ THÍCH: Huyền phù gốc sử dụng vài tháng Huyền phù bảo quản lâu nhiệt độ -70 °C Các huyền phù gốc rã đơng dùng cho thử nghiệm sơ Có thể sử dụng huyền phù gốc vào mục đích thử nghiệm miễn thỏa mãn chuẩn tính đắn (xem Điều 12) Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu chuẩn theo 5.6 Thử nghiệm mẻ vi khuẩn với ba mẫu chuẩn Thử ba mẫu chuẩn song song với cuvet dung dịch huyền phù gốc cho phép thử Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Lấy ống có chứa huyền phù gốc (8.4) tủ lạnh sâu đặt vào bể điều nhiệt 20 °C ± °C để làm tan huyền phù Chuẩn bị huyền phù thử theo hai bước: - Thêm 0,5 ml dung dịch (5.5) cho 100 µl huyền phù gốc vào cuvet thử, trì nhiệt độ 15°C ± °C làm đồng cách lắc nhẹ cuvet thử - Chờ khoảng 15 Dùng pipet hút dung dịch huyền phù cho vào bình định mức, ví dụ dung tích 20 ml, thêm 11,5 ml dung dịch (5.5), trì nhiệt độ 15 °C ± °C, làm đồng cách lắc nhẹ bình thuốc thử Chờ khoảng 15 Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng mẫu, mẫu chuẩn (5.6) mẫu kiểm soát (5.2) vào cuvet thử thứ (6.4) Quy trình thơng thường để chuẩn bị dãy pha lỗng mô tả Phụ lục B Tùy thuộc vào mục đích thử nghiệm yêu cầu thống kê liên quan đến kết phép thử, thiết kế dãy pha lỗng có nồng độ dãy hình học logarit phù hợp Vì hỗn hợp thể tích mẫu/mẫu pha loãng huyền phù thử nghiệm, nên nồng độ mẫu cao phép thử chiếm 50% mẫu thử quy luật Đối với phép thử mẫu nước gần khơng pha lỗng (80 % mẫu), cần thêm mẻ kiểm tra (xem B.2 Bảng 1) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Duy trì cuvet thử có chứa dung dịch natri clorua (5.2) để kiểm sốt, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) mẫu dãy pha loãng (Bảng B.1) 15 °C ± °C Chọn điều kiện thử nghiệm đảm bảo độ lệch nhiệt độ tối đa bể điều nhiệt phép thử không ± 0,3 °C Đối với phép thử tích huyền phù cần thử mẫu thử nhau, dùng pipet hút vào ống đo thứ hai, tương ứng với cuvet thử (6.4) 500 µl huyền phù cần thử, trì nhiệt độ 15 °C ± °C tủ ấm, khoảng thời gian (từ s đến 20 s) phép đo cường độ sau Tiến hành phép xác định song song mức pha loãng nhiệt độ thử 15 °C ± °C Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quang cho thuận tiện gần với mức cực đại Xác định ghi cường độ phát quang, I0, huyền phù thử máy đo phát quang Vì thời gian tiếp xúc tất mẫu phải nhau, nên sử dụng đồng hồ tính (6.6) để đo cường độ phát quang khoảng thời gian đo Khoảng thời gian đo thích hợp s đến 20 s Đo tất huyền phù thử, độ phát quang khác huyền phù thử không đồng Ngay sau đo độ phát quang huyền phù thử ban đầu, làm đầy huyền phù thử tới ml mẫu (7.2), mẫu pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5 6) dung dịch natri clorua (5.2), thích hợp Việc thực cách dùng pipet lấy 500 µl dung dịch mẫu (7.2), mẫu pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) dung dịch natri clorua (5.2), chuẩn bị dãy cuvet thử thứ nhất, cho vào huyền phù thử cần thử cuvet thử dãy ống đo thứ hai tương ứng Lắc tay, bắt đầu bấm đặt cuvet thử trở lại bể điều nhiệt nhiệt độ 15 °C ± °C Lặp lại với tất cuvet thử khác, để khoảng thời gian lần thêm vào Đo ghi cường độ phát quang tất cuvet, kể mẫu kiểm soát, sau 15 sau 30 (I15, I30), đo sau (I5), tùy chọn, để khoảng thời gian đo từ s đến 20 s Ghi lại điều chỉnh dụng cụ 10 Đánh giá 10.1 Ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng cơng thức (1) để tính hệ số hiệu (giá trị ) từ cường độ phát quang đo Hệ số dùng để hiệu giá trị ban đầu I0 tất mẫu thử trước chúng dùng làm giá trị chuẩn cho việc xác định độ giảm phát quang nước (t = min, 15 min, 30 min) (1) Trong hệ số hiệu thời gian tiếp xúc min, 15 min, 30 min; Ikt cường độ phát quang mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính đơn vị phát quang tương ứng; I0 cường độ phát quang huyền phù thử kiểm tra trước cho thêm chất pha lỗng (5.2), tính đơn vị phát quang tương ứng; Tính hệ số hiệu trung bình độ lệch giá trị riêng từ giá trị trung bình tính phần trăm (lấy chữ số có nghĩa) (2) Trong đó: giá trị riêng hai hệ số điều chỉnh giá trị trung bình Dùng cơng thức (3) để tính Ict: (3) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Trong đó: giá trị trung bình ; I0 cường độ phát quang huyền phù mẫu thử, trước thêm mẫu (7.2) mẫu pha loãng (Phụ lục B), tính đơn vị phát quang tương ứng; Ict giá trị hiệu I0 cuvet đựng mẫu thử trước cho mẫu thử vào Dùng cơng thức (4) để tính ảnh hưởng ức chế mẫu thử: (4) Trong đó: Ht ảnh hưởng ức chế mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính phần trăm; Ict xem Cơng thức (3); It cường độ phát quang mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính phát quang tương ứng; Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế Ht cho mức pha lỗng, tính phần trăm Tính chênh lệch số học phép xác định song song Hti từ trung bình tương ứng phần trăm (một chữ số có nghĩa): , tính điểm Trong Hti hai giá trị hiệu ứng ức chế mẫu thử giá trị trung bình 10.2 Xác định giá trị EC Tính tốn mối tương quan ảnh hưởng nồng độ thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợp phân tích hồi quy phi tuyến tính[8] Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ sử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến tính, ước lượng giá trị gamma cho mức pha loãng (tỷ lệ độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng lại thời điểm t) sử dụng Cơng thức (5): (5) Trong đó: giá trị gamma mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min; giá trị trung bình Ht xem Cơng thức (4) CHÚ THÍCH: Khi nồng độ thử định cho độ ức chế phát quang sinh học % 100 %, khơng thể tính giá trị gamma Do đó, có giá trị Ht nằm khoảng 10 % 90 % dùng để tính tương quan nồng độ Mối tương quan ảnh hưởng nồng độ thời điểm tiếp xúc cho thường mơ tả phương trình tuyến tính sau: (6) Trong đó: ct phần mẫu nước có mẫu thử, tính phần trăm; xem Cơng thức (5); b giá trị độ dốc đường tuyến tính; Igα giá trị phần bị chắn đường tuyến tính Bằng phương pháp thống kê hồi quy bình phương tối thiểu chuẩn, tính giá trị EC20 EC50 với giới hạn tin cậy tương ứng, đó: ct = EC20,t = 0,25; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê ct = EC50,t = 1,00; www.luatminhkhue.vn Đối với phân tích hồi quy phi tuyến tính, mơ hình khác có sẵn phần mềm đồ họa chuẩn phần mềm thống kê Các phần mềm dựa hàm phân bố chuẩn (nghĩa phân tích Probit), phân bố logistic (nghĩa phân tích Logit), phân bố Weibull (nghĩa phân tích Weibull) Ảnh hưởng ức chế tính (Ht) dùng trực tiếp để ước lượng thông số ảnh hưởng nồng độ phi tuyến tính, từ đó, giá trị EC mức tính tiếp sau [8] Nếu khoảng cặp giá trị không khớp với đường cong, giá trị EC ước lượng theo hình học sử dụng hệ thống tọa độ logarit kép 11 Biểu thị kết Báo cáo kết theo ví dụ Bảng Báo cáo khoảng thời gian thử (5 min, 15 30 min) Nếu xác định được, báo cáo giá trị LIDlb (xem Phụ lục B) Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC20 EC50 phương pháp để tính độ lệch giá trị Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn sử dụng Bảng - Ví dụ đánh giá thử nghiệm – Mẫu: nước thải sau xử lý trạm xử lý nước thải Thí nghiệm đối chứng Số mẻ Mức pha lỗng Giá trị đo kiểm tra D I0 Ik30 1a ≥ 2a Ik30/I0 Thử nghiệm tính đắn Độ lệch so với giá trị trung bình , tính %b 93 76 0,817 91 74 0,813 92 79 0,858 95 80 0,842 0,815 ± 0,3 0,850 ± 1,0 Thí nghiệm thử Số mẻ Mức pha loãng Giá trị đo Ic30 thử D I0 I30 H30 % Thử nghiệm tính đắn % Độ lệch so với giá trị trung bình, tính % theo điểm c 65,53 ± 1,1 1,901 42,51 ± 1,3 0,740 22,92 ± 0,5 0,297 92 25 75,0 66,7 93 27 75,8 64,4 86 43 73,1 41,2 90 43 76,5 43,8 91 60 77,4 22,5 89 58 75,7 23,4 95 72 80,8 12,4 94 70 79,9 10,9 11,65 ± 0,8 0,132 91 32 77,4 58,7 57,85 ± 0,9 1,372 93 34 79,1 57,0 Chất chuẩn 3,4 mg/l DCP, 2,2 mg/l Zn, 18,7 mg/l Cr 10 a Xem Phụ lục B b Đối với mẻ kiểm tra, độ lệch so với giá trị trung bình tính chênh lệch tốn học lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng, tính phần trăm [Cơng thức (2) 10.1] LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Thí nghiệm đối chứng c Đối với mẻ thử, độ lệch giá trị H30 (tính phần trăm) lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng tính chênh lệch tốn học giá trị H30 (tính phần trăm) so với giá trị trung bình (tính phần trăm) (được gọi điểm phần trăm) Giá trị LIDlb ví dụ LIDlb = Giá trị EC20 ví dụ = 31,9 %, Giá trị EC50 = 58,8 % (thống kê bình phương tối thiểu chuẩn) 12 Chuẩn tính đắn phép thử Phép thử coi - Giá trị- ủ 15 30 nằm khoảng từ 0,6 đến 1,3; - Kết phép xác định song song không chênh lệch so với giá trị trung bình chúng 3% so với mẫu kiểm tra; - Đối với mẫu thử mà xác định giá trị LIDlb giá trị EC20/EC50 tương ứng, độ lệch so với giá trị trung bình chúng “điểm phần trăm” không % - Đối với mẻ nuôi cấy huyền phù gốc theo 8.4, ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch khơng trung hịa, kiểm tra riêng rẽ) gây ức chế từ 20 % đến 80 % sau thời gian tiếp xúc 30 nồng độ sau huyền phù thử cuối 4,5 mg/l 3,5-diclorophenol 25 mg/l Zn(ll) (tương đương 109,9 mg/l kẽm sunfat ngậm bảy nước) mg/l Cr(VI) (tương đương 11,3 mg/l kali dicromat); - Một ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch khơng trung hịa), thử phép thử tiến hành song song dung dịch huyền phù gốc rã đông cho phép thử thực (Điều 9) gây ức chế 20 % đến 80 % sau thời tiếp xúc 30 13 Độ xác Trong chương trình thử nghiệm liên phịng cấp quốc gia có 22 phịng thí nghiệm tham gia, tiến hành suốt mùa thu năm 1991 xác định số liệu độ xác Các kết tóm tắt Phụ lục C 14 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1) Tài liệu cần phải bao gồm thông tin sau: a) Nhận dạng mẫu nước, kể việc lấy mẫu, thời gian lưu giữ điều kiện bảo quản; b) pH nồng độ oxy mẫu nước gốc, tính mg/l % bão hòa; c) Ngày thử nghiệm; d) Phương pháp xử lý sơ mẫu, cần, ví dụ pH sau điều chỉnh; e) Nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; f) Ngày chuẩn bị vi khuẩn; g) Nhiệt độ bảo quản vi khuẩn; h) Biểu thị kết theo Điều 11 Bảng 1; i) Mọi sai lệch so với phương pháp thông tin tình ảnh hưởng đến kết quả; j) Kết thử với chất chuẩn mẻ vi khuẩn thử nghiệm thực tế Phụ lục A (Tham khảo) Phương pháp hiệu màu A.1 Phạm vi áp dụng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Việc giảm độ phát quang hấp thụ ánh sáng xảy mẫu dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt màu từ đỏ đến nâu Nếu quan sát thấy màu nồng độ EC 20, nên thực quy trình sau để kiểm tra thấy cần thiết phải hiệu màu Trong trường hợp, nồng độ mẫu thử gần với giá trị EC50 nên hiệu màu Α.2 Dụng cụ bổ sung Α.2.1 Cuvet hiệu chính-màu: cuvet-hai lớp, lắp vừa với máy đo độ phát quang Α.2.2 Pipet Pasteur Α.3 Cách tiến hành Thực tồn quy trình hiệu màu nhiệt độ 15 °C ± °C tủ ủ kiểm soát nhiệt độ Chuẩn bị dung dịch pha loãng mẫu thử (5.2) có nồng độ gần giá trị EC 20,t (Ck) Nếu giá trị EC20,t chênh lệch nhiều Ck phải gần với giá trị EC20,t thấp CHÚ THÍCH 1: Khơng cần phải chọn Ck khác cho khoảng thời gian tiếp xúc (5 min, 15 min, 30 min) Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua % (5.2) vào khoảng ngồi cuvet hiệu màu Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt Đối với vi khuẩn tươi chuẩn bị theo 8.4, nên sử dụng 1,0 ml huyền phù vi khuẩn gốc Trộn kỹ huyền phù trước dùng pipet Paster để chuyển vào khoang cuvet hiệu màu Thêm huyền phù cho với mức dung dịch có khoang ngồi cuvet hiệu màu Đo mức ánh sáng (B0) sau 15 min, bật đồng hồ bấm Từ thời điểm trở đi, vị trí cuvet hiệu màu khoảng đo phải giữ nguyên cho tất số đọc Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang thay vào 2,0 ml mẫu thử pha lỗng (Phụ lục B) làm lạnh trước đến 15 °C ± °C Đo mức ánh sáng (I5) sau lần đo đầu Dùng pipet lấy hết mẫu thử pha lỗng từ khoang ngồi thay vào 2,0 ml dung dịch natri clorua Đo mức ánh sáng (B10) 10 sau lần đo đầu CHÚ THÍCH 2: Quy trình đơn giản hóa cách dùng hai cuvet hiệu màu giống hệt Khoang cuvet thứ chứa đầy nước, khoang cuvet thứ hai chứa đầy mẫu pha lỗng Sau 15 min, đo mức ánh sáng B0 I0 Những giá trị thay cho giá trị B5 I5 để tính tốn A.4 Α.4 Tính tốn kết Các tính tốn thừa nhận cường độ màu mẫu phù hợp với định luật Beer-Lambert, trường hợp thơng thường Tính B5 theo cơng thức (A.1): (Α.1) Tính độ hấp thụ (At) nồng độ EC20,t chưa hiệu với thời điểm tiếp xúc (t) theo cơng thức (A.2): (Α.2) Trong Ck nồng độ mẫu hóa chất có nồng độ thử (màu); k số hệ thống thu theo thực nghiệm; độ hấp thụ dịch pha loãng cần thử cuvet hiệu màu Tính độ truyền qua tương ứng Tt theo công thức (A.3): LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn (Α.3) Tính giá trị gamma hiệu ( ) theo cơng thức (A.4): (A.4) theo Cơng thức (A.5): (A.5) Trong c hệ số hiệu cho giá trị gamma thời điểm tiếp xúc định (t); giá trị gamma gốc Tiến hành tính lại kết thử với giá trị gamma hiệu Với thời gian tiếp xúc định, tính độ hấp thụ (At) độ truyền qua (Tt) nồng độ thử, từ tính giá trị gamma chưa hiệu theo Cơng thức (A.6): (A.6) Hệ số hiệu giống giá trị gamma, thừa nhận độ dốc đồ thị gốc Do đó, điều đủ để tính hệ số hiệu giá trị gamma Trong phép xác định này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 20,t chưa hiệu ( = 0,25) Cơng thức (A.7) tính hệ số hiệu rút gọn sau: (A.7) Trong Tt giá trị phát quang sinh học đo thời điểm tiếp xúc định (t); c hệ số hiệu cho giá trị gamma thời điểm tiếp xúc định (t); giá trị gamma gốc; giá trị gamma hiệu Α.5 Ví dụ Bảng A.1 – Ví dụ Số liệu hiệu màu Ck = 10,0 % phần thể tích B5 = 81 I0 = 78 k = 3,1 Tính hiệu màu C = phần thể tích 15 = 0,708 30 = 0,670 = 0,657 I0 I5 I15 I30 Mẫu trắng 100 90 80 70 5,625 98 82 0,076 0,054 74 0,059 0,040 65 0,055 0,036 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc: ln = 1,96 x In C - 5,96 ln = 1,95 x In C - 6,16 ln = 1,90 x In C - 6,12 Công thức hiệu chính: ln = 1,96 x In C - 6,30 ln = 1,95 x In C - 6,56 ln = 1,90 x In C - 6,53 EC20,t gốc 10,3 11,6 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 12,1 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Số liệu hiệu màu EC20,t hiệu 12,3 14,3 15,1 Phụ lục B (Tham khảo) Mức pha loãng D - Chuẩn bị dãy pha loãng B.1 Nguyên tắc Khi thử nước thải cách pha loãng dần (D) mẻ thử có nồng độ đậm đặc mà nồng độ khơng có ức chế, có ảnh hưởng ức chế mà khơng vượt q độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, gọi “Độ pha lỗng khơng ảnh hưởng thấp (LID)” Độ pha loãng biểu thị giá trị nghịch đảo phần thể tích nước thải mẻ thử [ví dụ, hàm lượng nước thải (25 % phần thể tích) mức pha lỗng D = 4] Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn thể tích huyền phù thử với thể tích mẫu nước thể tích mẫu pha lỗng Do đó, mức pha lỗng dãy pha lỗng theo thơng lệ D ≥ (nồng độ mẫu cao phép thử: 50 % mẫu) B.2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Mẫu nước thải phải làm đồng cách lắc tay trộn khuấy từ Thêm 20 g dung dịch natri clorua vào lít mẫu nước mẫu nước điều chỉnh-pH Đối với mẫu nước có nồng độ muối cao, đo độ muối tính lượng NaCI (nếu cần) cần để điều chỉnh độ thẩm thấu Nồng độ muối thu mẫu thử không vượt độ thẩm thấu dung dịch natri clorua 35 g/l Chuẩn bị dãy pha loãng dãy cuvet thử thứ Nên dùng dãy pha loãng theo Bảng B.1 Dãy pha loãng chuẩn bị cách pha loãng dần kết hợp hai pha lỗng hình học (D = 2, 4, 8, 16 D = 3, 6, 12, 24, ) Đối với phép xác định song song, thể tích mẫu mẫu pha loãng mẫu kiểm tra 500 µl đủ Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng Mức pha loãng D Thành phần dãy pha lỗng mẫu (Tổng thể tích cho phép xác định song song: 500 µl) Mẫu nước (7.2) Nước pha lỗng (5.2) µl µl 500 500 0 500 500 000 500 750 750 500 000 375 125 12 250 250 16 187,5 312,5 24 125 375 32 93,75 406,25 Đối với D = Mẻ kiểm tra Mẻ thử Đối với D ≥ Mẻ kiểm tra Mẻ thử LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Mức pha loãng D Mẻ chuẩn Thành phần dãy pha lỗng mẫu (Tổng thể tích cho phép xác định song song: 500 µl) 500 (Nồng độ xem 5.6) Cách dễ để chuẩn bị dãy pha loãng tạo hai dung dịch pha loãng gốc ống nghiệm riêng rẽ (xem Hình B.1) CHÚ DẪN Mẫu a Mẫu pha loãng để tạo dãy thử thứ b Mức pha loãng cuối D sau thêm huyền phù thử Hình B.1 - Sơ đồ pha lỗng Pha lỗng 1, 000 µl mẫu chưa pha lỗng (độ pha loãng cuối phép thử sau trộn với thể tích huyền phù thử 2) Pha loãng 3, ví dụ 000 µl mẫu + 000 µl dung dịch 5.2 (độ pha loãng cuối phép thử sau trộn với thể tích huyền phù thử 3) Đối với chuẩn bị pha loãng nữa, chuyển 500 µl mẫu /mẫu pha loãng vào 500 µl dung dịch 5.2 ống thử, trộn sau lần chuyển Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường 500 µl mẫu nước mẫu pha lỗng chuẩn bị dãy thử thứ trộn với 500 µl huyền phù thử (xem Điều 9) chuẩn bị dãy ống thử thứ hai, sau đo cường độ ánh sáng ban đầu huyền phù thử Do vậy, mức pha loãng thu D mẻ thử phép đo ức chế phát quang gấp đơi độ pha lỗng mẫu mẫu pha loãng Nếu cần thử mẫu nước gần chưa pha lỗng, thêm 800 µl mẫu nước chưa pha lỗng (7.2) vào 200 µl huyền phù thử Độ pha loãng mẫu 1,25 (nồng độ mẫu cuối phép thử: 80 % mẫu) Giá trị D tương ứng coi D = Huyền phù thử D = chuẩn bị cách thêm 4,5 ml dung dịch (5.5) vào vi khuẩn tạo huyền phù lại, thay cho 11,5 ml Đối với giá trị này, cần có mẻ kiểm tra thêm để tính tốn hệ số hiệu phục vụ cho việc hiệu giá trị ban đầu Mẻ kiểm tra làm cách thêm 800 µl dung dịch natri clorua (5.2) vào 200 µl huyền phù thử B.3 Cách tiến hành Tiến hành phép thử theo Điều Thực phép xác định kép mức pha loãng Xác định ghi lại cường độ phát quang tất ống thử, kể ống kiểm tra, sau 15 30 min(I30), tùy chọn B.4 Đánh giá Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế (xem 10.1) mức pha lỗng, tính phần trăm Tính độ lệch phép xác định song song H30 so với giá trị trung bình chúng tương ứng cho phép xác định kép H30(%) (trung bình) – H30 (%) tính điểm phần trăm, (một chữ số có nghĩa) theo LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn phần trăm trung bình cho kiểm tra (hệ số hiệu chính, xem 10.1) B.5 Biểu thị kết Thể kết theo Điều 11 Giá trị D thấp thử mức mà hiệu ứng ức chế trung bình < 20 %, gọi LID lb B.6 Báo cáo thử nghiệm Xem Điều 14 Ngoài số liệu yêu cầu tiêu chuẩn này, báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin độ nước thải, điều chỉnh độ muối phương pháp xử lý sơ (lắng, lọc, ly tâm, sục khí) Phụ lục C (Tham khảo) Số liệu độ Đối với chương trình thử nghiệm liên phịng, dung dịch chưa trung hòa gồm 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm bảy nước, kali dicromat xetyltrimethyammonium bromua pha nước cất nước có độ tinh khiết tương đương Những giá trị EC xác định nêu 10.2, kết đưa Bảng C.1 CHÚ THÍCH: Do số phịng thí nghiệm cho kết ức chế lớn 20 % nồng độ thử thấp kết ức chế nhỏ 50 % nồng độ thử cao nên giá trị đơi có khác EC20 EC50 Bảng C.1 - Số liệu độ vi khuẩn tươi bảo quản tủ lạnh sâu =n nAP SR CVR % mg/l mg/l % 3,5-diclorophenol EC20 15 0,0 3,31 0,75 22,6 EC50 15 0,0 5,80 1,28 22,1 EC20 13 13,3 14,6 2,4 16,6 EC50 13 13,3 26,0 3,3 12,8 EC20 11 15,3 0,717 0,283 39,5 EC50 10 28,6 2,726 0,947 34,8 EC20 11 8,3 0,229 0,105 45.6 EC50 13 7,1 0,476 0,152 31,8 Kẽm sulfat heptahydrat a Kali dicromat a Cetyltrimethylammonium bromua Giải thích ký hiệu I: số lượng phịng thí nghiệm tham gia; n: Số lượng liệu; nAP: Số lượng ngoại lệ; : Giá trị trung bình; SR: Độ lệch chuẩn độ tái lập; CVR: Hệ số biến thiên độ tái lập, EC20: Nồng độ hữu ích gây ức chế phát quang 20 % EC50: Nồng độ hữu ích gây ức chế phát quang 50 % LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn nAP =n % a mg/l SR CVR mg/l % Nồng độ Zn(ll) Cr(VI) tương ứng Phụ lục D (tham khảo) Thử mẫu nước mặn với phép thử vi khuẩn phát quang dùng vi khuẩn nuôi cấy D.1 Thông tin chung Sinh vật thử Vibrio fischeri vi khuẩn biển Thử mẫu nước mặn quy trình chuẩn thường dẫn tới ảnh hưởng kích thích mà gây cản trở hiệu ứng ức chế [2] Sự kích thích ion kim loại kiềm kim loại kiểm thổ [2],[3] Với cải tiến quy trình thử, phát quang sinh học kiểm tra tối ưu hóa cách sử dụng nước biển nhân tạo nước lợ nhân tạo kiểm tra pha lỗng Do vậy, hiệu ứng kích thích giảm bớt phương pháp áp dụng cho mẫu nước biển, nước lợ nước lọc tương ứng D.2 Định nghĩa D.2.1 Độ muối (Salinity) Độ muối thực tế (practical sanility) S Đại lượng không thứ nguyên, dùng để kiểm tra chất lượng nước, xem ước lượng nồng độ muối hòa tan nước biển, tính gam kilogram; Nó định nghĩa theo toán học, tỷ số (K15) độ dẫn điện mẫu nước, 15 °C atm *, độ dẫn điện dung dịch kali clorua xác định (32,4366 g/kg mẫu) nhiệt độ áp suất CHÚ THÍCH: Chấp nhận từ TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), định nghĩa 85 D.2.2 Mẫu nước mặn (salt water sample) Mẫu nước mặn lợ có độ muối khoảng từ đến 35 D.2.3 Nước chiết trầm tích biển lợ (Eluates of marine or brackish sediments) Dịch chiết lỏng trầm tích biển nước lợ có nước lợ/biển nhân tạo tự nhiên mơi trường rửa giải D.2.4 Trầm tích nước biển nước lợ (Pore water of marine or brackish sediment particles) Nước nằm hạt trầm tích biển trầm tích lợ D.3 Vật liệu D.3.1 Chất chuẩn - 3,5-dichlorophenol; - Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnSO4.7H2O) D.3.2 Nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) Sử dụng nước loại ion để chuẩn bị nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) với thành phần nêu Bảng D.1 Tất thuốc thử phải cấp độ tinh khiết Bảng D.1 - Nước biển nhân tạo (ASW) (như quy định ISO 10253[5]) nước lợ nhân tạo (ABW) Nước biển nhân tạo (ASW) Nước lợ nhân tạo (ABW) NaCI 22,0 14,19 MgCl2.6H2O 9,7 6,26 Na2SO4 (anhydris) 3,7 2,39 Độ muối (g/l) * Theo quy định hợp pháp, atm chuyển thành Pa: atm = 101 325 Pa LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Nước biển nhân tạo (ASW) Nước lợ nhân tạo (ABW) CaCI2 (anhydris) 1,0 0,65 KCI 0,65 0,42 NaHCO3 0,20 0,13 H3BO3 0,023 0,015 47,000 ± 1,000 31,000 ± 1,000 31 ± 20 ± 7,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 Độ dẫn điện (µS/cm) (20 °C) Độ muối nhân tạo (20 °C) Giá trị pH D.4 Cách tiến hành D.4.1 Khái quát Chuẩn bị làm tan vi khuẩn theo quy trình tiêu chuẩn Tùy thuộc vào độ muối mẫu, sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) làm mẫu kiểm tra âm, nước pha loãng cho dãy pha loãng mẫu nước pha loãng cho chất chuẩn thay cho dung dịch natri clorua % (S 20) (xem tóm tắt Bảng D.2) Bảng D.2 - So sánh quy trình chuẩn quy trình cải biến Quy trình chuẩn TCVN 6831-1 (ISO 11348-1) Nước lợ cải biến Nước mặn cải biến X