TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HÓA BIẾN DƯỠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HÓA BIẾN DƯỠNG Biên soạn: BSTY Trần Thanh Tiến Tài liệu lưu hành nội - 2017 MỤC LỤC trang Nội quy phịng thí nghiệm .3 An toàn phịng thí nghiệm .4 Nội dung 1: Gây bệnh thực nghiệm .7 Nội dung 2: Định tính & định lượng protein huyết Nội dung 3: Định lượng vitamin C huyết 12 Nội dung 4: Định lượng nitrogen amine .14 Nội dung 5: Xác định hoạt lực emzyme amylase huyết 15 Nội dung 6: Xác định hoạt lực emzyme urease bột đậu nành 17 Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM Sinh viên phải có mặt phịng thí nghiệm ấn định Những sinh viên đến trễ 15 phút coi vắng mặt (không thực tập bù) Sinh viên phải hoàn thành tất thực tập đạt yêu cầu phần thực tập dự thi phần lý thuyết Trong buổi thực tập, sinh viên chia thành tiểu nhóm (6 sinh viên), thực theo nhóm thực tập Trước đến phịng thí nghiệm, sinh viên phải đọc tìm hiểu trước nội dung ý nghĩa thực tập, tránh làm thí nghiệm cách máy móc, thụ động Mỗi tiểu nhóm sử dụng chịu trách nhiệm dụng cụ hóa chất bào thực tập làm Cuối buổi thực tập, sinh viên phải rửa dụng cụ, làm vệ sinh, xếp đặt chỗ thực tập gọn gàng bàn giao dụng cụ, hóa chất cho giảng viên phụ trách trước Trong làm thực tập, sinh viên phải giữ trật tự, khơng đùa giỡn phịng thí nghiệm Khi chưa hướng dẫn giảng viên, sinh viên tuyệt đối khơng tị mị sử dụng hóa chất, dụng cụ điện, máy móc, thiết bị phịng thí nghiệm Sinh viên vi phạm phải chịu toàn trách nhiệm thiệt hại gây Nộp tường trình/ báo cáo vào cuối buổi thực tập Phải mặc áo blouse vào phòng thực tập Tài liệu lưu hành nội - 2017 AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM I Nguyên tắc chung: - Phải giữ cho bàn làm việc sẽ, gọn gàng, ngăn nắp - Tránh làm nhiễm tạp hóa chất, sử dụng dụng cụ sạch, đánh dấu dụng cụ sử dụng - Phải tập trung q trình làm thí nghiệm - Sinh viên phải ln nhận thức hóa chất sử dụng phịng thí nghiệm ln tiềm ẩn nguy ngộ độc, kích ứng có khả gây cháy nổ - Sinh viên thực hành cần phải nắm quy trình tiến hành thí nghiệm phải biết tất tính chất vật lý tính chất hóa học hóa chất thuốc thử sử dụng - Sinh viên phải biết sử dụng thiết bị an tồn xử lý tình khẩn cấp *** Lưu ý: Đơi bất cẩn sinh viên nguyên nhân dẫn đến tổn thương cho sinh viên khác Như sinh viên có liên quan đặt biệt đến an toàn bạn lớp II Quy định an toàn chung: - Khơng làm việc phịng thí nghiệm - Khơng tự ý làm thí nghiệm khơng cho phép - Nghiêm cấm ăn, uống, hút thuốc phịng thí nghiệm - Phải biết rõ vị trí cách dùng thiết bị an toàn tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm phải trang bị bình cứu hỏa, vòi rửa mắt, vòi tắm khẩn cấp, tủ hút, dụng cụ sơ cứu - Đeo kính bảo hộ làm việc phịng thí nghiệm Khơng đeo kính sát trịng kể trường hợp dùng kính bảo hộ) tai nạn xảy hoá chất kính sát trịng gây tổn thương nặng - Các thí nghiệm với chất độc, chất bay phải tiến hành tủ hút Tài liệu lưu hành nội - 2017 - Cần tuân thủ nghiêm quy định sử dụng hóa chất, ý ký hiệu vật tư ghi chai lọ đựng hóa chất - Khơng nếm loại hóa chất phịng, khơng ngửi trực tiếp khí hay chất có mùi, mà phải tuân theo phương pháp chuẩn để định mùi với bàn tay - Đi giày kín mũi quần dài hạn chế tổn thương phần chân, khơng sandals hay quần shorts vào phịng thí nghiệm - Tóc dài cần cột gọn lại (nhất dùng lửa ngồi, khơng phải lị kín) - Cặp, túi để kệ riêng - Rửa tay trước khỏi phịng thí nghiệm III Một số qui định đặc biệt: - Trong đun nóng dung dịch phải chắn không đun nhiệt cần lắc khuấy dung dịch suốt trình đun Miệng dụng cụ chứa dung dịch đun nên hướng phía khơng có người - Khi lấy acid base mạnh cần phải ý Vd: pha lỗng acid đậm đặc, phải rót từ từ acid vào nước, tránh làm ngược lại - Phải sử dụng pipette tự động bơm pipette để hút chất độc, chất lỏng sinh học, acid mạnh, base mạnh - Các chất, dung môi độc pha chế sử dụng cần tiến hành tủ hút phải cẩn thận - Các chất, dung môi dễ cháy ether, alcohols, benzene không để gần lửa, không đun lửa trần - Không cho đột ngột nước nóng vào dụng cụ thủy tinh lạnh nhiệt độ thường - Trước sử dụng thiết bị điện cần phải chắn tiếp đất - Các hóa chất, dung môi sử dụng nên thu gom riêng vào can, thùng chứa riêng để xử lý, tuyệt đối không nên xả vào nguồn nước thải - Trước rời khỏi phịng thí nghiệm phải tắt tất hết thiết bị điện khí gas (tuy nhiên khơng nên khóa nguồn nước) Tài liệu lưu hành nội - 2017 IV Cách xử lý tình khẩn cấp trường hợp tai nạn hay tổn thương a Hóa chất dính vào mắt: - Dùng ngón tay ngón trỏ mở rộng mí mắt sau rửa vời rửa mắt khẩn cấp, mắt cần rửa lượng lớn nước - Khi dung dịch acid dính vào mắt, nên rửa mắt NaHCO3 1% cịn dung dịch alkaline dính vào mắt rửa acid boric 1% b Bỏng: - Khi bị bỏng da không nên rửa nước mà nên sử dụng loại băng chuyên dụng - Khám bác sĩ cần thiết c Ngộ độc: - Đưa đến bệnh viện sớm tốt *** LƯU Ý: Tất tai nạn tổn thương phải báo cáo lại với người quản lý phịng thí nghiệm Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 1: GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM - Lớp tổ chức thành nhóm (25 bạn/nhóm) - Mỗi nhóm nhận thỏ (trọng lượng khoảng kg) lồng nuôi - Thỏ gây độc CCl4 - Lấy mẫu máu kiểm tra nồng độ AST, ALT Trung tâm chẩn đoán điều trị, Chi cục thú y TP HCM - Mổ khám ghi nhận bệnh tích đại thể - Đọc kết xét nghiệm - Thảo luận - Báo cáo kết thảo luận Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 2: ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG HUYẾT THANH I Định tính: Khảo sát tính chất sa lắng biến tính protein  Ngun tắc Protein hịa tan nước tạo thành dung dịch keo bền vững Sự bền vững hai yếu tố: - Sức đẩy tĩnh điện hạt keo protein mang điện tích dấu - Lớp vỏ thủy hóa Nếu hai yếu tố hai hạt keo kết dính lại sa lắng Có nhiều cách làm sa lắng protein như: - Sa lắng muối kiềm - Sa lắng dung môi hữu cơ: acetone, alcohol, ether… - Sa lắng kim loại nặng: Hg, Ag, Pb… - Sa lắng acid mạnh: acid trichloracetic, nitric…  Hóa chất - Dung dịch lịng trắng trứng 1% - Dung dịch ammonium sulfate bão hòa - Acetone - Acetate chì 5% - Acid trichloracetic 10%  Cách làm Lấy ống nghiệm đánh số theo thứ tự cho vào hóa chất theo thứ tự sau: Hóa chất Lịng trắng trứng 3ml 3ml 3ml 3ml Ammonium sulfate 3ml Acetone 3ml Acetate chì 3ml Trichloracetic 3ml Quan sát so sánh sa lắng, biến tính protein phương pháp Ghi nhận kết Tài liệu lưu hành nội - 2017 Phản ứng Biurette  Nguyên tắc Phản ứng Biurette phản ứng định tính xác định liên kết peptide (CONH) mẫu xét nghiệm, (định tính protein, polypeptide) Trong mơi trường kiềm, dung dịch sulfate đồng phản ứng với liên kết peptide thành lập phức hợp muối đồng nhị màu tím theo phản ứng: Phức hợp muối đồng nhị (màu tím)  Hóa chất - Thuốc thử Biurette - Huyết - Dung dịch amino acid 1%: glycine  Cách làm Dùng pipette hút: - ml huyết cho vào ống nghiệm - 2ml thuốc thử Biurette, lắc - Quan sát màu tím Lặp lại phản ứng với dung dịch glycine Ghi nhận kết Tài liệu lưu hành nội - 2017 Định lượng II Định hàm lượng protein tổng số huyết khúc xạ kế  Nguyên tắc Dựa vào khác biệt độ chiết xuất n dung dịch huyết thanh, ánh sáng qua dung dịch bị khúc xạ tia ló qua lăng kính định lại qua thị trường làm ranh giới hai vùng sáng tối, lượng protein tổng số thước chuẩn  Hóa chất - Huyết - Acetone - Nước cất  Cách làm Dùng bơng gịn tẩm acetone lau mặt kính, sau rửa lại nhiều lần nước cất lau lại bơng gịn khơ Đậy nắp nhựa mặt kính nhỏ giọt huyết vào rãnh đậy Nhìn qua thị kính có thị trường với hai vùng: vùng tối vùng sáng Ranh giới hai vùng xác định hàm lượng protein tổng số mẫu huyết khảo sát thước chuẩn, đơn vị đo g% (số gram protein có 100ml huyết thanh) Định lượng Albumin Globulin huyết (bằng phương pháp Reinhold)  Nguyên tắc Tiểu phần globulin huyết loại bỏ dung dịch muối ammoni sulfate qua sa lắng ly tâm tách lấy phần nước Sau dùng dung dịch sulfate đồng thuốc thử biurette làm màu liên kết peptide phân tử Độ đậm nhạt màu số liên kết peptide diện xác định mật độ quang học (A) độ dài sóng λ = 550 nm quang kế  - Hóa chất Huyết Thuốc thử Biurette Dung dịch ammonium sulfate ((NH4)2SO4) 23% sodium sulfate (Na2SO4) 23% - Sodium chloride (NaCl) 0.9%  Cách làm - Loại bỏ globulin: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết thanh, thêm 7.5ml Na2SO4 23% lắc đều, để yên phút, ly tâm 3000 vòng/phút phút, loại bỏ cặn cách lọc qua giấy lọc Đây nước lọc 1, cịn albumin 10 Tài liệu lưu hành nội - 2017 - Tìm protein tổng số: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết thanh, thêm 7.5ml NaCl 0.9% Ly tâm bỏ cặn (nếu có) Đây nước lọc - Dùng ống nghiệm đánh số theo thứ tự thêm hóa chất vào sau: Hóa chất Nước lọc Nước lọc Na2SO4 23% ((NH4)2SO4) 23% Thuốc thử Biurette - - Ống 3ml - Ống 3ml Ống - 3ml 3ml 3ml 3ml Lắc đều, để yên 30 phút, đọc độ hấp thu (A) quang phổ kế với bước sóng λ = 550 nm o Ống 3: để chỉnh máy với độ hấp thu o Ống 1: độ hấp thu A1 albumin o Ống 2: độ hấp thu A2 protein tổng số Sau dùng khúc xạ kế đo hàm lượng protein tổng số huyết Cách tính: dựa vào quy tắc tam suất: Protein tổng số: Độ hấp thu A2 Albumin : Độ hấp thu A1 X (g%) ? Y (g%) Globulin = Protein tổng số (g%) - Albumin (g%) 11 Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 3: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG HUYẾT THANH  Nguyên tắc Vitamin C khơng bền, dễ bị oxy hóa khơng khí, mơi trường acid yếm khí vitamin C bền vững 2,6 dichlorophenol indophenolcol màu xanh dương, nhận cặp hydrogen từ acid ascorbic trở thành không màu mơi trường acid yếu biến thành màu hồng, acid ascorbic biến thành acid dehydroascorbic O C C -OH C -OH O H- C HO- C -H CH OH A.Ascorbic Cl + O= =N- -OH Cl 2,6 dichlorophenol indophenol O Cl C C =O C =O O H- C HO- C -H CH OH + HO Cl -NH -OH 2,6 dichlorophenol indophenol A.Dehydroascorbic dạng hoàn nguyên (không màu)  Hóa chất - Huyết - Thuốc thử 2,6 dichlorophenol indophenolcol - Acid metaphosphoric 5%, điều chỉnh pH = 2,5 – HCl 0.1N  Cách làm Cho vào ống nghiệm ly tâm - ml nước cất - 1ml huyết - 1ml dung dịch acid metaphosphoric Lập ống đối chứng có chứa: - 4ml nước cất 12 Tài liệu lưu hành nội - 2017 - 1ml dung dịch acid metaphosphoric Ly tâm ống 3000 vòng/ phút phút Lấy 3ml nước ống đem chuẩn độ 2,6 dichlorophenol indophenolcol đến có màu hồng nhạt bền phút Ghi số ml thuốc thử dùng chuẩn độ cho ống  Tính kết (A-B) x 0.088 x 5x 10 (mg%) X= Trong đó: X= số mg vitamin C 100ml huyết A= số ml thuốc thử dùng chuẩn độ ống huyết B= số ml thuốc thử dùng chuẩn độ ống nước cất 13 Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 4: ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITROGEN AMINE (PHƯƠNG PHÁP SORENXEN)  Nguyên tắc Nitrogen amine nitrogen nhóm amine tự dung dịch amino acid, peptide, protein Định hàm lượng nitrogen amine có ý nghĩa việc đánh giá trình trao đổi protein thể động vật Nhóm amine tự dung dịch thường xuyên tạo liên kết nội phân tử với nhóm carboxyl nên muốn định lượng dùng formaldehyde phong bế nhóm amine để giải phóng nhóm carboxyl tự do, nhóm chuẩn độ định lượng dung dịch NaOH Số nhóm amine carboxyl phần lớn amino acid tương đương nên gián tiếp suy lượng amine Phản ứng xảy khoảng pH – 9.5, nên với thị màu, phenolphthalein phải chuẩn độ màu đến màu đỏ tía Chỉ thị màu thích hợp thymolphtalein  Hóa chất - Dung dịch glycine - Formaldehyde trung tính - NaOH 0.2N - Phenolphtalein 0.05 % alcohol 70o  Cách làm Lấy hai bình nón ghi thứ tự: Hóa chất Glycine Nước cất Formaldehyde Phenolphtalein Bình A 10 ml ml giọt Bình B (đối chứng) 10 ml ml giọt Lắc nhẹ, đem chuẩn độ với NaOH 0.2N từ burette đến có màu đỏ tía Ghi số ml NaOH 0.2N dùng để định chuẩn cho bình tính kết theo công thức: X = (VA – VB) x 2.8 mg Trong đó: X: số mg nitrogen amine chứa 10ml dung dịch glycine VA: số ml NaOH định chuẩn bình A VB: số ml NaOH định chuẩn bình B 2.8: số mg nitrogen tương ứng với 1ml NaOH định chuẩn 14 Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 5: XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC EMZYME AMYLASE TRONG HUYẾT THANH  Nguyên tắc Dưới tác dụng amylase tinh bột bị thủy phân thành cấu tử nhỏ dextrin thủy phân đến sản phẩm cuối maltose hay glucose Phản ứng màu đặc trưng iod với tinh bột dextrin khác Dựa vào nguyên tắc xác định hoạt lực amylase Phản ứng: amylase Tinh bột Dextrin +I2 + I2 Màu xanh chàm Màu nâu Maltose maltase Glucose + I2 + I2 Khơng màu Khơng màu  Hóa chất - Huyết - Dung dịch NaCl 0.9% - Dung dịch iod 0.5% alcohol - Dung dịch tinh bột 1%  Cách làm - Dùng ống nghiệm lớn ghi số thứ tự từ đến 9, cho vào ống 1ml NaCl 0.9% Pha loãng nồng độ huyết (amylase) cách dùng pipette hút xác 1ml huyết cho vào ống 1, lắc (ống có huyết pha lỗng nồng độ ½) Hút xác ml hỗn hợp ống cho vào ống 2, lắc (huyết pha loãng nồng độ ¼) Hút xác 1ml hỗn hợp ống cho vào ống 3…tiếp tục pha loãng đến ống Hút xác 1ml hỗn hợp ống bỏ Sau cho vào ống 2ml tinh bột 1% lắc ống 15 Đặt tất ống nghiệm vào nước ấm/tủ ấm 37oC 30 phút Tài liệu lưu hành nội - 2017 - - 16 Nhỏ giọt dung dịch iod vào ống, lắc Quan sát thay đổi màu (chú ý thứ tự ống) Đọc kết cách chọn số thứ tự ống có màu nâu cạnh ống có màu xanh Tra bảng để suy hoạt lực amylase huyết xét nghiệm Hoạt lực amylase: Ống số Đơn vị/ml 16 32 64 128 256 512 1024 Tài liệu lưu hành nội - 2017 NỘI DUNG 6: XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC EMZYME UREASE TRONG BỘT ĐẬU NÀNH  Nguyên tắc Urease enzyme thủy giải urease theo phản ứng sau: (NH2)2CO + H2O → (NH4)2CO3 Nếu thêm formol vào môi trường, có phản ứng tạo thành hexamethylene tetramine acid carbonic theo phản ứng sau: (NH4)2CO3 + HCHO → (CH2)6N4 + H2O + H2CO3 Acid tạo thành định phân kiềm xác định lượng urea bị thủy giải, từ suy hoạt tính enzyme urease  Hóa chất - Dung dịch NaOH 0.05N Dung dịch urea 2% (w/v) Formol trung tính Dung dịch urease: Khuấy gam bột đậu nành 100 mL nước cất Để yên 15 phút Dịch chứa nhiều urease Đem lọc thu lấy dịch lọc Dung dịch phenolphtalein 1% cồn  Cách làm - Chuẩn bị bình nón theo bảng sau: Bình nón Thể tích dung dịch urea 2% (ml) Thể tích dung dịch enzyme urease (ml) Thể tích dd enzyme urease đun sôi (ml) Y 5 - Ủ bình nón nước ấm 40oC 20 phút - Cho vào bình nón 5ml formol trung tinh - Lắc vài phút - Chuẩn độ H2CO3 giải phóng dung dịch NaOH 0.05N với thị màu phenolphtalein 1% 17 X 5 Tài liệu lưu hành nội - 2017  Kết - Hoạt lực enzyme urease biểu thị số mol urea bị thủy giải lượng enzyme có gam bột đậu nành thời gian phút 40oC, hoạt lực tính theo cơng thức sau: A= 20 103 t e m (mol/ g/ phút) (VX - VY) E Trong đó: - VX: Số ml NaOH 0.05N định chuẩn bình X - VY: Số ml NaOH 0.05N định chuẩn bình Y - e: Thể tích enzyme cho vào bình (ml) - E: Tổng thể tích enzyme thu từ m gam bột đậu nành (ml) - t: Thời gian thủy phân (phút) 18 Tài liệu lưu hành nội - 2017 ... dụng chịu trách nhiệm dụng cụ hóa chất bào thực tập làm Cuối buổi thực tập, sinh viên phải rửa dụng cụ, làm vệ sinh, xếp đặt chỗ thực tập gọn gàng bàn giao dụng cụ, hóa chất cho giảng viên phụ... sinh viên phải giữ trật tự, khơng đùa giỡn phịng thí nghiệm Khi chưa hướng dẫn giảng viên, sinh viên tuyệt đối khơng tị mị sử dụng hóa chất, dụng cụ điện, máy móc, thiết bị phịng thí nghiệm Sinh. .. ứng có khả gây cháy nổ - Sinh viên thực hành cần phải nắm quy trình tiến hành thí nghiệm phải biết tất tính chất vật lý tính chất hóa học hóa chất thuốc thử sử dụng - Sinh viên phải biết sử dụng