Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều kiện thử nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn định. Vì vậy kết quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống kê. Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy
KN phương pháp sinh học ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Nội dung Phương pháp thử động vật Phương pháp thử vi sinh vật Xác định hoạt lực kháng sinh ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Chất chuẩn Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng chất thử Chất chuẩn chia làm hai loại: Chất chuẩn gốc: chất đồng có độ tinh khiết cao Chất chuẩn gốc thường làm viện nghiên cứu quốc gia quốc tế riêng chất chuẩn sinh học Chất chuẩn thứ cấp: chất có độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học xác định theo chất chuẩn gốc quốc tế tương ứng Chất chuẩn phải bảo quản ống thuỷ tinh nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường nhiệt độ < 5oC) điều kiện khơ, tránh ánh sáng ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Đánh giá kết Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài phụ thuộc vào nhiều yếu tố tính chất đáp ứng sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, điều kiện thử nghiệm Các yếu tố thường khơng ổn định Vì kết thử nghiệm sinh học phải đánh giá toán thống kê Độ xác phép thử thể giới hạn tin cậy ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Phương pháp thử động vật Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phép thử động vật dựa đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đưa vào thể liều lượng theo quy định thí nghiệm để đánh giá chất lượng chế phẩm cần thử Động vật thí nghiệm Động vật dùng thí nghiệm phải đồng đều, khiết nòi giống, khoẻ mạnh khơng nhiễm bệnh, khơng có thai ni dưỡng đầy đủ Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khác giống, trọng lượng, tuổi động vật Chất lượng động vật định độ xác phép thử ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Thử in vivo in vitro Thử nghiệm thực thể động vật sống gọi thử in vivo Người ta dựa thông số nhiệt độ thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện não đồ, thay đổi huyết áp, phản xạ hệ thần kinh tỷ lệ sống, chết động vật thí nghiệm… để đánh giá tác dụng chất lượng thuốc Phép thử tiến hành quan cô lập động vật, tim, tử cung, ruột, máu… gọi thử in vitro ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Liều (Dose) Liều lượng chế phẩm thử đưa vào thể động vật lần cho mục đích thí nghiệm Ví dụ: Liều LD0, LD50, LD100, MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt Các thử nghiệm động vật áp dụng kiểm nghiệm thuốc Trong dược điển thường có thử nghiệm sau thực phép thử động vật như: • Thử độc tính bất thường • Thử chất hạ huyết áp • Thử chất gây sốt • Định lượng hormon: gonadorelin, corticotrophin, insulin, oxytocin, menotrophin, • Kiểm tra tính an tồn vaccin sinh phẩm • Xác định hiệu lực vaccin antitoxin ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Phương pháp thử vi sinh vật Đại cương vi sinh vật Môi trường nuôi cấy Thử vô trùng Thử giới hạn vi sinh vật ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Vi khuẩn (bacteria) Việc phân loại theo nhóm dựa hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram khả hơ hấp chúng -Theo hình thể: + Cầu khuẩn (Coccus): Vi khuẩn hình cầu đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành đám (Staphylococcus), chuỗi (Streptococcus), hay xếp thành đôi (Diplococcus) +Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng lẻ hay thành chuỗi (Bacillus anthracis) hình que hai đầu trịn (Escherichia coli) +Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lị xo như: Treponema Pallidum +Phẩy khuẩn (Vibrio): Vi khuẩn hình dấu phẩy Vibrio cholerae -Theo tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram +Vi khuẩn có màu tím sau nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram + +Vi khuẩn có màu đỏ sau nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram – -Theo đặc tính trình hơ hấp: +Sử dụng oxy tự q trình hơ hấp: Vi khuẩn hiếu khí +Phát triển điều kiện hiếu khí kỵ khí, có q trình hơ hấp nitrat: vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc +Chỉ sống điều kiện kỵ khí, có q trình hơ hấp sulfat: Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Vi khuẩn sinh sản cách phân đôi tế bào Sự phân chia tế bào xảy nhanh Trong điều kiện mơi trường thích hợp khơng có yếu tố kìm hãm tế bào vi khuẩn sau sinh 250.000 tế bào Tuy nhiên, nhân lên vi khuẩn vơ tận, cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong môi trường nuôi cấy, sinh sản vi khuẩn sau thời gian định bị ngừng lại nhiều nguyên nhân như: thức ăn bị hết dần, vi khuẩn tiết chất kìm hãm phát triển chúng ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com * Kiểm tra chất ức chế thực theo cách sau: Cấy khoảng 100 tế bào vi khuẩn vào ống mơi trường chọn lọc khơng có mẫu thử có mẫu thử nồng độ thích hợp cho E coli Salmonella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Mẫu thử khơng có tác dụng ức chế vi khuẩn mọc tốt hai ống môi trường ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Đếm số lượng vi sinh vật: - Đối với vi khuẩn: Cho vào đĩa petri 1ml chất thử nồng độ thích hợp cho khơng q 300 khuẩn lạc 1ml Thêm 15 - 20ml môi trường thạch casein - đậu tương môi trường thạch thường để nguội 45oC, xoay nhẹ đĩa để chất thử trộn vào môi trường Nuôi cấy 30 350C - ngày - Đối với vi nấm: Cho vào đĩa petri 1ml chất thử nồng độ thích hợp cho không 100 khuẩn lạc vi nấm 1ml Thêm 15-20ml thạch Sabouraud + kháng sinh Nuôi cấy 25 - 28oC - ngày - Thí nghiệm thực với hay nồng độ pha loãng cuối Mỗi nồng độ làm - đĩa thử để lấy giá trị trung bình Sau thời gian ni cấy, đĩa có số khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ 300 vi nấm nhỏ 100 đếm để tính số lượng ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Tính kết quả: Tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi nấm 1g (1ml) tính theo cơng thức: X = A1k1 + A 2k 2 A1 : Số khuẩn lạc vsv trung bình nồng độ pha lỗng k1 A2 : Số khuẩn lạc vsv trung bình nồng độ pha loãng k2 k1, k2 : Độ pha loãng Các dược điển có quy định: mẫu thử có 10 vi sinh vật/1g (1ml) khơng có khuẩn lạc mọc đĩa thử nồng độ 10-1 ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Xác định hoạt lực kháng sinh ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Mục đích Trong lĩnh vực kiểm nghiệm, để định lượng kháng sinh người ta sử dụng phương pháp khác Một số chất kháng sinh định lượng phương pháp hố học, phương pháp hóa lý Tuy nhiên, phương pháp sinh học đóng vai trị quan trọng việc đánh giá hoạt tính sinh học thuốc kiểm tra giảm hay hoạt lực chất kháng sinh mà phương pháp lý, hố khơng thực Các chất kháng sinh có cấu trúc phức tạp thành phần có tác dụng gồm hỗn hợp nhiều thành phần, thường phải dùng thử nghiệm vi sinh vật để xác định hoạt lực thuốc Phép thử vi sinh vật cho biết độ nhạy cảm vi khuẩn gây bệnh chất kháng sinh thử, mức độ kháng thuốc chúng Trên sở chọn kháng sinh thích hợp cho bệnh nhân điều trị ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Nguyên tắc Hoạt lực chất kháng sinh xác định cách so sánh khả ức chế chủng vi sinh vật thị, nồng độ biết kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) nồng độ biết kháng sinh chuẩn (đã biết rõ hoạt lực) Chủng thị Chủng thị chủng vi sinh vật khiết, nhạy cảm chất kháng sinh, chủng thị thường phân lập từ bảo tàng giống Quốc gia, bảo quản ống đơng khơ mơi trường thích hợp - 10oC Tuỳ theo dược điển nước, chất kháng sinh có vài chủng thị khác ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Chất chuẩn: Chất chuẩn chất có độ tinh khiết cao, dùng chất chuẩn gốc chất chuẩn thứ cấp có hoạt lực xác định theo mẫu chuẩn quốc tế tương ứng Chất chuẩn đóng ống thủy tinh hàn kín bảo quản khô, tránh ánh sáng, 0oC Đơn vị hoạt lực: Hoạt lực chất kháng sinh tính đơn vị hoạt lực quốc tế (viết tắt U UI, IU) Một đơn vị hoạt lực hoạt lực đặc trưng lượng định chất kháng sinh chuẩn sinh học quốc tế chế phẩm đối chiếu sinh học với chuẩn quốc tế Ví dụ 1U gentamicin hoạt lực 0,0056mg gentamicin Đơn vị hoạt lực chất kháng sinh xác định viện nghiên cứu lớn tổ chức y tế giới chất chuẩn sinh học Hoạt lực chất kháng sinh thể mcg hoạt lực Đối với chất kháng sinh hoàn toàn tinh khiết, đa số trường hợp mcg hoạt lực tương đương với mcg khối lượng chất kháng sinh Khi chất kháng sinh chưa hoàn toàn tinh khiết, hỗn hợp nhiều thành phần tương tự hoá học khác hoạt tính sinh học mcg hoạt lực khơng thiết tương đương với mcg khối lượng chất kháng sinh ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Môi trường dung môi Tùy theo chất kháng sinh vi sinh vật thị để chọn môi trường thích hợp cho thí nghiệm Dung mơi chất pha lỗng khơng ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật Các chất pha loãng như: nước cất, dung dịch HCl, ethanol, methanol, dung dịch đệm có pH khác nhau… sử dụng tuỳ thuộc vào độ tan chất kháng sinh Các vấn đề cần tham khảo dược điển Định lượng chất kháng sinh phương pháp khuếch tán Có hai phương pháp vi sinh vật để định lượng chất kháng sinh là: Phương pháp đo độ đục: (Turbidimetric method) Phương pháp khuyếch tán: (Diffusion method) Phương pháp khuyếch tán thường sử dụng nhiều định lượng kháng sinh ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Phương pháp khuyếch tán Nguyên tắc: Chất kháng sinh khuyếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc cấy vi sinh vật thị, tạo vùng ức chế vi sinh vật có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tương ứng Hoạt lực chất thử so sánh với chất chuẩn theo phương pháp thống kê ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử: Pha chuẩn: Cân lượng chất chuẩn thích hợp hồ vào dung mơi để có dung dịch gốc nồng độ khoảng 1000 UI/ ml Từ dung dịch gốc pha thành nồng độ cuối theo cấp số nhân hệ số hai s1, s2, s3 hai nồng độ s1, s2 (s1 < s2 < s3) Chất thử: pha chất chuẩn với giả định chất thử có hoạt lực tương đương chất chuẩn Chất thử có nồng độ cuối t1, t2, t3 (hoặc t1, t2) ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Tiến hành thí nghiệm: - Đổ vào đĩa Petri lượng môi trường dinh dưỡng cấy chủng thị để tạo lớp đồng có độ dày từ 2-5mm Chiều dày lớp thạch mỏng hay dày quá, không đồng làm cho quan hệ đường kính vùng ức chế logarit nồng độ khơng cịn đường thẳng Cũng làm lớp mơi trường, lớp cấy vi sinh vật thị Chủng thị loại khơng có bào tử, phải cấy vào môi trường để nguội 45oC, dạng có bào tử nhiệt độ cho phép cấy chủng 65 - 70oC Cần cấy vào môi trường lượng vi sinh vật thị cho có vùng ức chế rõ nét với kích thước đường kính thích hợp tương ứng với nồng độ kháng sinh chọn Nếu lượng chủng ít, vùng ức chế to, vi sinh vật mọc thưa thớt, khó xác định vùng ức chế Nếu lượng chủng nhiều, vùng ức chế nhỏ khó đo xác - Các đĩa mơi trường để khơ nhiệt độ phịng thí nghiệm 30 phút trước dùng Bề mặt thạch ướt làm cho vùng ức chế bị nhịe ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Để tạo vùng ức chế to cần thực giai đoạn tiền khuếch tán cách để đĩa thử nhiệt độ phòng cho kháng sinh khuyếch tán vào môi trường (đối với colistin, polymyxin B thời gian để khuyếch tán dài từ – giờ) Sau thời gian khuyếch tán, đĩa thử ủ nhiệt độ thích hợp 16 – 18 Trong trình ủ nhiệt độ phải ổn định phải đồng nơi Các đĩa thử nên để lớp tủ ấm cho vị trí nồng độ t s có khác nguồn nhiệt Đo đường kính vùng ức chế tạo nồng độ chuẩn thử thước đo có độ xác đến 0,1mm Một thí nghiệm tiến hành với 10 đĩa thử song song ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Tính kết quả: phần mềm vi sinh ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ... nghiệm, để định lượng kháng sinh người ta sử dụng phương pháp khác Một số chất kháng sinh định lượng phương pháp hố học, phương pháp hóa lý Tuy nhiên, phương pháp sinh học đóng vai trị quan trọng... tan chất kháng sinh Các vấn đề cần tham khảo dược điển Định lượng chất kháng sinh phương pháp khuếch tán Có hai phương pháp vi sinh vật để định lượng chất kháng sinh là: Phương pháp đo độ đục:... hoangthinh6@gmail.com Phương pháp nuôi cấy trực tiếp: Phương pháp nuôi cấy trực tiếp có kỹ thuật đơn giản, khả phát vi sinh vật giảm số lượng vi sinh vật có phân phối thể tích chất thử lớn Phương pháp khơng