Bài viết xây dựng mô hình ruồi giấm biến đổi gen ABCC4 và nghiên cứu sự thiếu hụt của gen này với biểu hiện đặc trưng của bệnh tự kỷ; xác định các gen/nhóm gen có khả năng tương tác với dABCC và liên quan đến rối loạn tự kỷ ở người.
Khoa học Y - Dược Giảm biểu gen ABCC4 (ATP-binding cassette subfamily C) liên quan đến rối loạn tự kỷ mơ hình ruồi giấm Trần Quốc Đạt*, Nguyễn Trọng Tuệ Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nhận 3/2/2020; ngày chuyển phản biện 12/2/2020; ngày nhận phản biện 27/3/2020; ngày chấp nhận đăng 14/4/2020 Tóm tắt: Rối loạn phổ tự kỷ tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp, bao gồm khiếm khuyết tương tác xã hội, phát triển ngôn ngữ kỹ giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp lặp lạị Việc nghiên cứu bệnh mức độ phân tử tế bào gặp nhiều khó khăn tính phức tạp việc lựa chọn, xây dựng mơ hình thực nghiệm Hầu hết nghiên cứu dừng lại mức độ in vitro, tập trung vào việc phát đột biến gen cho liên quan đến bệnh mà chưa sâu vào nghiên cứu mức độ in vivo Ruồi giấm có lịch sử nghiên cứu 100 năm, với gen nhỏ lại có mức tương đồng với gen người cao, cho thấy mơ hình di truyền vơ ưu việt Do đó, nghiên cứu đặt mục tiêu xây dựng mơ hình ruồi giấm biến đổi gen ABCC4 nghiên cứu thiếu hụt gen với biểu đặc trưng bệnh tự kỷ Kết nghiên cứu cho thấy tương tác cá thể quần thể giảm mạnh nhóm mang gen bệnh nhóm chứng Ruồi biến đổi gen ABCC4 bị rối loạn nhịp thức - ngủ so với có kiểu gen ABCC hoang dại Các biểu ghi nhận tương tự triệu chứng rối loạn tự kỷ người Đây kết bước đầu góp phần làm sáng tỏ vai trò protein chế phân tử bệnh tự kỷ Từ khóa: ABCC, rối loạn phổ tự kỷ, ruồi giấm Chỉ số phân loại: 3.5 Đặt vấn đề Rối loạn phổ tự kỷ bệnh lý rối loạn phát triển thần kinh phức tạp trẻ em giả thuyết phơi nhiễm với chất độc thay đổi yếu tố di truyền Những rối loạn hành vi thường phát triển năm đời Đây bệnh có xu hướng phát triển với tốc độ đáng báo động không Việt Nam mà cịn tồn giới [1] Ở nước ta, nghiên cứu bệnh chủ yếu tập trung vào dịch tễ học, biểu lâm sàng yếu tố nguy cơ, mơ hình động vật thực nghiệm cịn nhiều hạn chế Các protein có vai trò quan trọng liên quan đến đường vận chuyển dự trữ lượng tế bào thần kinh mẻ chưa đầu tư nghiên cứu Việc ứng dụng mơ hình ruồi giấm để nghiên cứu vai trò chức protein này, làm sáng tỏ chế bệnh sinh hướng mẻ thiết thực Trên giới có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mơ hình để mơ bệnh lý rối loạn tự kỷ người với mục tiêu xác định tác động yếu tố gen, môi trường đến hành vi, biểu hiện, khả vận động, khả sống sót, thay đổi nhịp sinh học biến đổi cấu trúc thần kinh ruồi giấm [2-4] Năm 2018, nghiên cứu * Ueoka cs [3] nhận thấy ruồi giấm có chứa gen CG1718 (nằm vùng 19F3 nhiễm sắc thể X) có trình tự chức tương đồng gen ABCA13 người Do đó, nghiên cứu hướng đến gen ruồi gọi tắt Drosophila ABCA13 (dABCA13) Kết việc giảm biểu (knockdown) gen dABCA13 mô não ruồi giấm cho thấy giảm tương tác rõ rệt cá thể quần thể, ruồi bị rối loạn nhịp thức - ngủ cấu trúc thần kinh bị biến đổi thể rõ nút thần kinh Kiểu hình ghi nhận mơ hình tương tự triệu chứng rối loạn tự kỷ người Bên cạnh đó, đột biến gen ABCA13 chứng minh có liên quan đến rối loạn tự kỷ khỉ [5] Bên cạnh ABCA13, gen ABCC4 thành viên thuộc họ gen ABC - mã hoá cho protein có cấu trúc tương tự protein ABCA13 gồm vùng xuyên màng (membrane spanning domain - MSD) MSD1 MSD2, vùng chứa chuỗi helix, vùng gắn nucleotide (NBD1 NBD2) vùng N-tận với khoảng 12 axit amin với nhiều chức vận chuyển chất qua màng tế bào (bao gồm lipid, ion, phân tử thuốc), thụ thể bề mặt tế bào tiết độc tố Nhiều nghiên cứu vai trị việc điều hồ cân nội môi truyền tin nội bào, điều khiển q trình lão hố tế bào tuỷ xương tuyến ức [6] Ngồi ra, protein cịn đóng vai trò sinh bệnh học khối u (u xơ Tác giả liên hệ: Email: tranquocdat.hus@gmail.com 62(7) 7.2020 40 Khoa học Y - Dược Reduction of the ATP-binding cassette sub-family C member (ABCC4) related to the expression of autism spectrum disorder on Drosophila melanogaster model Quoc Dat Tran*, Trong Tue Nguyen Hanoi Medical University Received February 2020; accepted 14 April 2020 Abstract: Autism spectrum disorders (ASDs) are complex neurodevelopmental disabilities that have core diagnostic features including impaired social interaction, language development, and interpersonal skills with repetitive and restrictive behaviors Researching this type of disorder in terms of the molecular and cellular mechanism has met many difficulties because of the complexity in choosing and creating an experimental model organism In Vietnam, most of the studies have focused on identifying the mutation relating to ASDs at in vitro level without any in-depth study at in vivo level Drosophila melanogaster has been widely used as an advantaged model organism in classical and modern genetics for more than 100 years because its genome was small and simple but having homologues for at least 75% of human disease genes, thereby indicating that this has been an extremely excellent genetic model Therefore, this study aimed to elucidate the physiological role of the ABCC4 gene mutant Drosophila model by specifically knocked down this protein in all neurons of these flies and investigated the deficiency of this gene in terms of autism features The result exhibited that the interaction between individuals in the population was sharply reduced between the gene mutant carrier group and the control group The knockdown of dABCC4 protein in all neurons induced early onset of evening activity and hyperactivity during morning peaks and evening peaks The ABCC4 genetically modified flies had a rhythm sleep disorder compared to the wild-type flies (ABCC genes) These phenotypes were similar to defects observed in humans with autism spectrum disorder These preliminary results have contributed to elucidate the role of this protein in the molecular mechanism of the autism Keywords: ABCC, autism spectrum disorder, Drosophila Classification number: 3.5 62(7) 7.2020 nang, u não) số bệnh thoái hoá thần kinh (Parkinson, Alzheimer…) [7, 8] Mặc dù tương đồng cấu trúc chức với ABCA13 vai trò ABCC4 hệ thần kinh ảnh hưởng đến rối loạn tự kỷ lại chưa biết đến chưa có nghiên cứu mơ hình động vật xác định vai trò sinh bệnh học gen [3-5] Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với hai mục tiêu chính: (1) knockdown gen dABCC4 mơ não ruồi giấm sử dụng hệ thống GAL4/UAS (2) phân tích biểu hành vi ruồi knockdown ABCC4 mối liên quan đến bệnh tự kỷ Đây hướng nghiên cứu hồn tồn mới, góp phần làm sáng tỏ vai trò gen chế phân tử bệnh, đồng thời cung cấp mơ hình tiềm kinh tế cho nghiên cứu thử nghiệm sàng lọc thuốc Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng dòng ruồi giấm chuyển gen thu thập từ trung tâm lưu trữ lớn giới Vienna Stock Center, Italy Bloomington Drosophila Stock Center - Indiana, USA Trong bao gồm: - w; +; elav-GAL4 (mã số #8760 - Bloomington Stock Center): dòng driver định hướng biểu protein GAL4 mô não ruồi giấm - w; UAS-GFP-IR; + (mã số #56179 - Vienna Stock Center): biểu dsRNA gen GFP - w; UAS-dABCC-IR63-155; + (mã số CG7627/v2808 Vienna Stock Center): biểu dsRNA gen ABCC4 ruồi giấm, mã hoá cho protein dABCC4 bị phân giải từ axit amin thứ 63 đến axit amin thứ 155 Ruồi giấm nuôi môi trường thức ăn (bao gồm 0,65% agarose, 10% glucose, 4% nấm men, 5% bột ngô 3% bột cám gạo) điều kiện nhiệt độ 25oC, thời gian chiếu sáng chu kỳ 12 sáng: 12 tối Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng: kháng thể đặc hiệu cho protein dABCC4 (rabbit anti-ABCC4 - Sigma-Aldrich); kháng thể đặc hiệu cho protein α-tubulin (rabbit anti-tubulin Thermo Scientific) Protein G Mag SepharoseTM Xtra (GE Healthcare) để tinh kháng thể; hoá chất thiết bị dùng sinh học phân tử Phương pháp nghiên cứu Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu dABCC4 mô não ruồi: để knockdown gen ABCC4 tế bào thần kinh mô não ruồi giấm, sử dụng hệ thống biểu elav-GAL4/UAS Trong đó, elav promoter điều khiển biểu cho protein GAL4 tế bào thần kinh não; protein GAL4 bám vào vùng trình tự UAS phức hệ gen UAS-dABCC4-IR kích hoạt trình tạo sợi RNA dABCC4 mang trình tự lặp lại ngược chiều 41 Khoa học Y - Dược nhau, sợi RNA hình thành cấu trúc sợi đơi dạng “kẹp tóc” Từ đó, hoạt hố đường RNAi để knockdown gen dABCC4 tế bào thần kinh hệ lai F1 Cách thực hiện: chúng tơi tiến hành lai theo sơ đồ hình Promoter elav Gen GAL4 Trình tự Đoạn trình tự lặp UAS đảo gen GFP Promoter elav Gen GAL4 Trình tự Đoạn trình tự lặp UAS đảo gen dABCC4 ruồi nhóm thí nghiệm - Các số liệu xử lý phần mềm Image-J thống kê Excel SPSS Phương pháp đánh giá khả tương tác cộng đồng (social space assay): phương pháp dựa theo mô tả nghiên cứu Simon cs [10]; sử dụng buồng thí nghiệm hình tam giác cân nằm hai kính vng (18x18 cm), cách đệm acrylic 0,5 cm cho phép ruồi hoạt động khơng gian hai chiều Thí nghiệm sử dụng ruồi đực trưởng thành giai đoạn 3-4 ngày tuổi để đảm bảo tính ổn định Ruồi đực knockdown gen GFP lựa chọn làm nhóm chứng Chọn ngẫu nhiên 40 ruồi đực nhóm, đem gây mê chuyển vào buồng thí nghiệm, đợi chúng tỉnh lại Đập nhẹ buồng thí nghiệm đảm bảo tồn ruồi đáy buồng Cho ruồi tự vận động, giao tiếp với 20 s Quá trình ghi lại camera Sau phân tích khoảng cách gần cá thể ruồi phần mềm Image-J dABCC4 Phương pháp đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm (activity assay): ruồi giấm trưởng thành nuôi điều kiện nhiệt độ 25oC, chu kỳ sáng tối cách 12 trước sử dụng cho thử nghiệm đánh giá nhịp thức ngủ [11] Mỗi cá thể ruồi trưởng thành cho vào ống thuỷ tinh đường kính mm Hình Sơ đồ mơ tả q trình lai tạo dịng ruồi giấm nghiên cứu chế với đầu có chứa thức ăn đặt thiết bị đo chuyên Hìnhcủa Sơ thành đồ mơ tả q trình hoạt động phần lailai F1.tạo dòng ruồi giấm dụng Toàn hoạt động ruồi ghi nhận 24/24 h liên nghiên cứu chế hoạt động thành phần Phương pháp đánh giá biểu protein ABCC4 mô não ruồi giấm tục vòng 7-10 ngày nhờ thiết bị cảm biến kết nối với máy lai F1 kỹ thuật Western Blotting: dòng ruồi giấm sau lai tạo tiến hành đánh giá tính Qua đo thời gian cường độ hoạt động hiệu knockdown protein mô não kỹ thuật Western Blotting, sử dụng Phương pháp đánh giá biểu protein ABCC4 mơ ban ngày/ban đêm ruồi nhóm bệnh so với nhóm chứng kháng thể đặc hiệu với protein ABCC4 Alpha-tubulin sử dụng chứng nội kiểm.não ruồi giấm kỹ thuật Western Blotting: dòng ruồi giấm Phương pháp giá khả trưởng thành Phân tích kết quả: kết thử nghiệm tương tác cộng sau lai tạođánh tiến hànhvận đánhđộng giá hiệuruồi giấm knockdown (Climbing assay): thí nghiệm dựa tập tính leo trèo ngược chiều trọng lực có protein mô não kỹ thuật Western Blotting, sử dụng đồng, thử nghiệm đánh giá khả vận động, đánh giá nhịp lực tác động chiều trọng lực ruồi giấm [9] Dựa nguyên tắc này, ruồi đặchưởng hiệu đến vớikhả protein Alpha-tubulin sử leosinh học ruồi giấm, xử lý phần mềm phân tích biến kháng đổi gen thể bị ảnh ABCC4 vận động bị ảnh hưởng tới khả hình ảnh Image-J, sau phân tích thống kê phần mềm trèo chúng ruồi ảnh hưởng q trình mang thai đẻ trứng nên tồn dụng nhưDo chứng nộibị kiểm SPSS Giá trị p tính tốn sử dụng Kruskal-Wallis test thí nghiệm tiến hành ruồi đực để đảm bảo tính ổn định Các thí Phương pháp đánh động giấm nghiệm tiến hành song song giá giữakhả nhómnăng bệnh vận (knockdown gen ruồi ABCC4) nhóm chứngtrưởng (knockdown GFP) thànhgen (Climbing assay): thí nghiệm dựa tập tính leo Kết - Ruồi giấm lựa chọn làm thí nghiệm gây mê CO2, sau trèo ngược chiều trọng lực có lực tác động chiều trọng chuyển vào ống thủy tinh (15-20 con/ống) có chia vạch từ đến 5, vạch cách Mức độ tương đồng protein ABCC4 người lực ruồi giấm [9] Dựa trêntaynguyên tắcliên này, biếnruồi vềprotein CG7627 ruồi giấm cm Để 10 phút cho ruồi ổn định, dùng đập mạnh tục lầnruồi để đưa đáy ống (về vạchđến xuấtkhả phát) Chovận ruồiđộng bò lênsẽtrong 30 s,hưởng ghi lại đổithủy gentinh bị ảnh hưởng bị ảnh camera, động tác lần chúng Do ruồi bị ảnh hưởng Trình tự axit amin protein CG7627 ruồi giấm tớilặp khảlạinăng leo5 trèo - Sử dụng liệu video ghi s sau kết thúc lần đập để trích xuất từ sở liệu UniProt (mã số Q9VLN6) so trình mang thai đẻ trứng nên tồn thí nghiệm phân tích, so sánh khả leo trèo ruồi nhóm thí nghiệm tiến hành ruồi đực để đảm bảo tính ổn định Các thí sánh với trình tự thành viên họ protein ABCC nghiệm tiến hành song song nhóm bệnh (knockdown người, sử dụng công cụ FASTA BLAST Kết so sánh cho thấy, protein CG7627 ruồi giấm protein ABCC4 gen ABCC4) nhóm chứng (knockdown gen GFP) người có tỷ lệ tương đồng (identity) 44% mức độ giống - Ruồi giấm lựa chọn làm thí nghiệm gây mê (similarity) 63%, cao số thành viên CO2, sau chuyển vào ống thủy tinh (15-20 con/ống) khác thuộc họ protein ABCC Kết so sánh cho thấy có chia vạch từ đến 5, vạch cách cm Để 10 phút mức độ tương đồng cấu trúc protein ABCC4 người cho ruồi ổn định, dùng tay đập mạnh liên tục lần để đưa ruồi ruồi giấm với hai vùng xuyên màng (TMD) hai vùng bám đáy ống thủy tinh (về vạch xuất phát) Cho ruồi bò lên nucleotid (NBD) Các vùng chức hai loài 30 s, ghi lại camera, lặp lại động tác lần xác định với tỷ lệ tương đồng cao (TMD1 TMD2 có tỷ - Sử dụng liệu video ghi s sau kết lệ tương đồng 72 81% Tỷ lệ vùng NBD1 thúc lần đập để phân tích, so sánh khả leo trèo NBD2 87,5 100%) 62(7) 7.2020 42 Khoa học Y - Dược Hình Thử nghiệm hành vi tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành Hình Kết Western Blotting đánh giá mức độ biểu protein dABCC4 mô não ruồi giấm nhóm bệnh lý (knockdown) nhóm đối chứng (control) Chỉ số vận động Knockdown protein ABCC4 mô não ruồi giấm Kết chogian thấy,(B)ruồi knockdown gencách dABCC4 có (A) Phân bố quần thể ruồi không Kếtgiấm phân tích khoảng tương tác mức độ tương tác với quần thể giảm rõ rệt (hình 3) Trên khơng ruồigiá giấm nhóm bệnh knockdown dABCC4 (elav>dABCC-IR63-155) Chủng ruồi giấm sau lai tạo tiếngian hành đánh 80% cá thể ruồi giấm nhóm bệnh có khoảng cách đến nhóm chứng knockdown (elav>GFP-IR) (n=40); ***:p