nghiên cứu cấu trúc gen quy định enzyme n – acetylglucosamine kinase của loài vibrio alginolyticus

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Sinh viên: Nguyễn Thị Thảo MSSV: 20175178 Lớp: KTSH02 – K62 Lớp thí nghiệm: 694235 ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC GEN QUY ĐỊNH ENZYME N – ACETYLGLUCOSAMINE KINASE CỦA LOÀI VIBRIO ALGINOLYTICUS I Tổng quan đề tài 1.1 Tổng quan chi Vibrio Vibrio chi vi khuẩn Gram âm, có hình dạng cong – que (dấu phẩy), vài lồi số gây ngộ độc thực phẩm, thường ăn hải sản chưa nấu chín Các lồi Vibrio lồi vi khuẩn kỵ khí thử nghiệm dương tính với chất oxy hóa khơng hình thành bào tử Các lồi Vibrio thường có hai nhiễm sắc thể, điều khơng bình thường vi khuẩn Mỗi nhiễm sắc thể có nguồn gốc chép riêng biệt độc lập, bảo tồn theo thời gian chi Một số loài Vibrio mầm bệnh Hầu hết chủng gây bệnh có liên quan đến viêm dày ruột, nhiễm trùng vết thương hở gây nhiễm trùng huyết Các loài Vibrio gây bệnh bao gồm V cholerae (tác nhân gây bệnh tả), V parahaemolyticus, V alginolyticus V Vulnificus V cholerae thường lây truyền qua nước bị nhiễm Các lồi Vibrio gây bệnh gây bệnh từ thực phẩm (nhiễm trùng), thường liên quan đến việc ăn hải sản chưa nấu chín 1.2 Tổng quan enzyme N – acetylglucosamine kinase N – acetylglucosamine (GlcNAc) thành phần murein cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn lipopolysacarit màng ngồi Trong q trình tăng trưởng, 60% murein thành bị thối hóa, sản phẩm chính, GlcNAc – anhydro – N – acetylmuramyl peptide, nhập bào vào tế bào chất tách để giải phóng GlcNAc, anhydro – N – axet tripeptide (l – Ala – d – Glu – meso – diaminopimelic acid) d – alanine Giống murein tripeptide, GlcNAc dễ dàng tái chế trình cho liên quan đến q trình phosphoryl hóa, GlcNAc – – phosphate (GlcNAc – – P) sử dụng cách hiệu để tổng hợp murein lipopolysacarit chuyển hóa glycolysis N – acetylglucosamine kinase enzyme đặc hiệu cần thiết cho q trình phosphoryl hóa chuyển đổi N – acetylglucosamine nội sinh (GlcNAc), thành phần carbohydrate phức tạp, từ phân hủy lysosomal (hoặc từ nguồn dinh dưỡng) thành GlcNAc – phosphate NAGK thuộc nhóm N – acetylhexosamine kinase 1.3 Tổng quan loài Vibrio alginolyticus Theo Miyamoto (1961) Vibrio alginolyticus có vị trí phân loại sau: Giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria, Vibrionales, họ Vibrionaceae, giống Vibrio, loài Vibrio alginolyticus Vibrio alginolyticus loài vi khuẩn ưa mặn phân bố rộng, chúng có mặt hầu hết mẫu thu từ nhiều đối tượng thủy sản khác như: cá, thân mềm, rong biển, … Vibrio alginolyticus có mặt mơi trường nước mặn vùng biển nhiệt đới nguyên nhân gây chết cao cho đối tượng nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn cịn có mặt người thường ăn hải sản tươi sống chưa nấu chín dẫn đến viêm dày, ruột bệnh đại tràng Những bệnh thường xuất vào mùa hè nhiệt độ tăng Vibrio alginolyticus vi khuẩn kỵ khí Gram (-), hình que uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm, chúng không sinh bào tử chuyển động nhờ hay nhiều tiêm mao mảnh nằm đầu vi khuẩn Vibrio alginolyticus có đặc điểm đặc trưng phát triển thành cụm bề mặt thạch rắn, môi trường TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng, bờ khơng đều, mơi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang II Thực hành thí nghiệm 2.1 Phân tích đề tài phương hướng thực hành Dựa tìm hiểu lồi Vibrio alginolyticus với việc tìm hiểu đề tài mà em hướng tới có vài điểm em quan tâm sau: - Sử dụng sở liệu giới thiệu mơn Tin Sinh học để tìm hiểu gen quy định tính trạng tổng hợp enzyme N – acetylglucosamine kinase loài Vibrio alginolyticus (Bước 1) - Sử dụng phần mềm Clustal Omega để so sánh trình tự gen tìm hiểu lựa chọn bước Nhận xét đánh giá dự đoán vùng bảo thủ, vùng phân ly sau có kết so sánh (Bước 2) - Sử dụng phần mềm Primer Blast Primer3 để thiết kế mồi, cài đặt thông số phần mềm dựa kết phân tích đánh giá bước (Bước 3) - Sử dụng phần mềm smsPCR để PCR ảo chạy thử đoạn mồi đánh giá kết thu (Bước 4) 2.2 Các bước thực hành thí nghiệm - Bước 1: Truy cập sở liệu để tìm liệu liên quan + Truy cập sở liệu NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov Trang chủ sau: + Gõ vào tìm kiếm trang chủ từ khóa cần tìm kiếm “N acetylglucosamine kinase vibrio alginolyticus” chọn “Gene” ấn “Search”, ta kết tìm kiếm sau: + Truy cập vào link cột “Name/Gene ID” ta được: + Click vào “GenBank” để xem báo, ghi lại lưu ý chủng mà báo công bố (địa điểm, thời gian, canh trường phân lập,…) + Chọn “FASTA” để lấy liệu cho phần mềm Clustal Omega Lặp lại bước hết báo, ta liệu đem so sánh + Mở phần mềm Clustal Omega thiết lập thông số liệu hình: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ + Sau cài xong hết thông tin dán hết liệu dạng fasta vào nhấn “Submit” để chạy chương trình ta kết quả: + Các vùng có dấu “*” biểu thị tương đồng cao, vùng “:” có độ tương đồng thấp hơn, vùng “.” có độ tương đồng thấp vùng trắng thể khơng tương đồng Vùng bảo thủ dự đoán vùng có nhiều kí hiệu thể độ tương đồng cao, cịn vùng có độ tương đồng thấp gần khơng tương đồng dự đốn vùng phân ly + Sử dụng phần mềm Primer Blast để thiết kế đoạn mồi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi? LINK_LOC=BlastHome + Chọn khuôn cho mồi ngược mồi xuôi + Sau thiết lập xong click vào “Get Primers”: + Sử dụng phần mềm sms PCR: Chọn đoạn mồi thứ có kích thước đoạn PCR ảo gần với kích thước đoạn gen quan tâm 709/909 Copy liệu vào cài đặt phần mềm submit ta kết quả: https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html? fbclid=IwAR3gJJz91LYpgqlTLkdLYD6LIAMP1jQ2U6dc4ORrCh_JgEqNw3JfWj iwRm0 + Sử dụng phần mềm BLAST để đánh giá sản phẩm PCR ảo: copy sản phẩm PCR ảo chạy BLAST ta kết quả: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome + Đánh giá kết thu ta thấy đoạn mồi chọn hợp lý có nhiều đoạn gen ngân hàng liệu có độ tương đồng cao E.value nhỏ tiến tới  ... quan đ? ?n việc ? ?n hải s? ?n chưa n? ??u ch? ?n 1.2 Tổng quan enzyme N – acetylglucosamine kinase N – acetylglucosamine (GlcNAc) thành ph? ?n murein cấu tạo n? ?n thành tế bào vi khu? ?n lipopolysacarit màng ngồi... quan tâm sau: - Sử dụng sở liệu giới thiệu m? ?n Tin Sinh học để tìm hiểu gen quy định tính trạng tổng hợp enzyme N – acetylglucosamine kinase loài Vibrio alginolyticus (Bước 1) - Sử dụng ph? ?n mềm... trường n? ?ớc m? ?n vùng bi? ?n nhiệt đới nguy? ?n nh? ?n gây chết cao cho đối tượng nuôi trồng thủy s? ?n Vi khu? ?n c? ?n có mặt người thường ? ?n hải s? ?n tươi sống chưa n? ??u ch? ?n d? ?n đ? ?n viêm dày, ruột bệnh đại