Luận văn thạc sĩ sinh học: Xây dựng quy trình Loop – mediated isothermal amplification (LAMP) dựa vào gen cpn60 nhằm phát hiện Streptococcus suis

Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP trong việc phát hiện đặc hiệu toàn bộ các serotype của S. suis. Nghiên cứu của chúng tôi có thể được xem là đề tài nghiên cứu đầu tiên nhằm xây dựng quy trình LAMP phát hiện S. suis hiệu quả, chính xác, chi phí thấp với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Những ưu điểm của phương pháp LAMP cho thấy đây là phương pháp có nhiều tiềm năng ứng dụng rộng rãi nhằm tầm soát nhiễm S. suis trên đàn heo nuôi và cả trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THANH TUYỀN XÂY DỰNG QUY TRÌNH LOOP – MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION DỰA TRÊN GEN CPN60 NHẰM PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS SUIS Chuyên ngành: vi sinh Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGÔ THỊ HOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 Lời cảm ơn Trước tiên, tơi xin tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Ngô Thị Hoa, người thầy đầy nhiệt huyết với khoa học, định hướng cho tôi, truyền cho lửa say mê nghiên cứu, quan tâm giúp đỡ dẫn đường cho tôi gặp khó khăn suốt thời gian thực đề tài hồn thành luận văn Kế đến, tơi xin chân thành cám ơn đến GS TS Jeremy Farrar Trung tâm bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, Đơn vị Nghiên cứu Lâm Sàng Đại Học Oxford tạo điều kiện cho thực đề tài Tôi xin bày tỏ lịng tri ơn sâu sắc thầy truyền đạt học, kiến thức quý báu hổ trợ em suốt trình học tập Xin cám ơn Ths Trần Thị Bích Chiêu Ths Sầm Đỗ Dũng tất anh chị em nhóm nghiên cứu S suis vi sinh ln nhiệt tình bảo hướng dẫn em kiến thức chun mơn kỹ thuật phịng thí nghiệm Xin chân thành cám ơn anh chị, bạn bè đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ chia sẻ điều quý giá suốt thời gian qua, đặc biệt thành viên tập thể nhóm Micro, Enteric Vibre thân yêu Cuối cùng, xin gởi lời cám ơn ba, mẹ thành viên gia đình tơi, người thân ln bên giúp đỡ nẻo đường Một lần nữa, xin gởi đến tất người lời cám ơn chân thành Tháng 9-2012 Hà Thanh Tuyền Lời mở đầu Liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S suis) tác nhân gây bệnh hàng đầu heo nước có kinh tế chăn nuôi heo phát triển Streptococcus suis cư trú tuyến hô hấp trên, tuyến sinh dục tuyến tiêu hóa heo Có 35 serotype S suis xác định ghi nhận, serotype serotype phổ biến thường phân lập từ heo bệnh người bệnh Ngoài số trường hợp gây bệnh người serotype 14, 16 phát báo cáo Các ca bệnh người xảy rải rác nhiều nước giới nhiên đa số trường hợp bệnh ghi nhận nước Châu Á, Trung Quốc vùng Đông Nam Á Tại Việt Nam, S suis serotype tác nhân hàng đầu gây bệnh viêm màng não mủ người lớn Nhiễm S suis người xem bệnh nghề nghiệp đối tượng tiếp xúc thường xuyên với heo thịt heo người làm công tác thú y, chăn nuôi, bn bán, giết mổ chế biến thịt heo Vì việc tầm soát xác định tỷ lệ heo mang trùng S suis góp phần giúp có biện pháp giảm nguy gây bệnh heo người Đây vấn đề cần quan tâm Hiện có nhiều kỹ thuật cho phép phát phân lập S suis, phổ biến nuôi cấy vi sinh PCR Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy định danh vi khuẩn kit thương mại dựa đặc tính sinh hóa vi khuẩn (API 20 Strep, Biomerieux) PCR phương pháp địi hỏi chi phí cao nên khó áp dụng chi cục thú y trung tâm y tế địa phương Trong nghiên cứu này, xây dựng phát triển phương pháp Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) với ưu điểm: xác, hiệu quả, giá thành thấp, kết ghi nhận chuyển màu, quan sát mắt thường dễ thực so với phương pháp PCR truyền thống nuôi cấy vi sinh Phương pháp LAMP hứa hẹn phương pháp sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi, đặc biệt phịng thí nghiệm với điều kiện sở vật chất hạn chế, nhằm xác định S suis khơng phịng thí nghiệm mà cịn điều kiện thực địa.Với tiền đề trên, tiến hành thực đề tài: “Xây dựng quy trình Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) dựa vào gen cpn60 nhằm phát Streptococcus suis”  Mục đích nghiên cứu  Mục tiêu đề tài - Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát Streptococcus suis - So sánh độ nhạy phương pháp LAMP với nuôi cấy vi sinh  Ý nghĩa lý luận thực tiễn đề tài Hiện nay, giới Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP việc phát đặc hiệu toàn serotype S suis Nghiên cứu chúng tơi xem đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình LAMP phát S suis hiệu quả, xác, chi phí thấp với độ nhạy độ đặc hiệu cao Những ưu điểm phương pháp LAMP cho thấy phương pháp có nhiều tiềm ứng dụng rộng rãi nhằm tầm soát nhiễm S suis đàn heo nuôi chẩn đoán bệnh nhiễm người Trang i MỤC LỤC Mục lục trang i Danh mục hình trang iv Danh mục, bảng, đồ thị trang vi Bảng chữ viết tắt trang vii Tổng quan 1.1 Đặc điểm chung 1.1.1 Hình thái, phân loại số đặc điểm sinh học 1.1.2 Phân loại serotype 1.1.3 Các serotype thường gây bệnh gây bệnh người heo 1.1.4 Nhiễm S suis heo 1.1.4.1 Phương thức lây truyền 1.1.4.2 Triệu chứng lâm sàng heo 1.1.5 Nhiễm S suis người 1.1.5.1 Đối tượng có nguy lây nhiễm 1.1.5.2 Triệu chứng lâm sàng người 1.2 Tình hình nhiễm S suis 1.2.1 Nhiễm S suis giới 1.2.2 Nhiễm S suis Việt Nam 1.3 Cơ chế phát sinh bệnh 1.3.1 Khu trú: trình gắn kết xâm nhiễm bề mặt biểu mô 1.3.2 Xâm nhiễm: phát tán tồn dòng máu 1.3.3 Hoạt hóa đáp ứng viêm sốc nhiễm trùng huyết 10 1.3.4 Xâm nhiễm hệ thần kinh trung ương (CNS) gây viêm màng não 11 1.4 Chaperonin 13 1.4.1 Nguồn gốc 13 1.4.2 CPN60 13 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang ii 1.4.2.1 Cấu trúc 13 1.4.2.2 Sự diện gen cpn60 14 1.4.2.3 Chức .15 1.4.2.4 Tiềm gen cpn60 .16 1.5 Phương pháp Loop mediated isothermal amplification (LAMP) 17 1.5.1 Sơ lược số phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh 17 1.5.2 Lịch sử đời ứng dụng phương pháp LAMP 18 1.5.3 Nguyên tắc hoạt động LAMP .18 1.5.4 Cơ chế hoạt động 19 1.5.5 Đánh giá kết LAMP .21 1.5.5.1 Đánh giá kết LAMP điện di 21 1.5.5.2 Quan sát kết LAMP mắt thường .22 1.5.6 Ưu điểm phương pháp LAMP 24 Vật liệu phương pháp 25 2.1 Vật liệu .25 2.1.1 Chủng vi khuẩn S suis 25 2.1.2 Trang thiết bị hóa chất .25 2.2 Các kỹ thuật nghiên cứu 27 2.2.1 Quy trình tách chiết DNA từ chủng 27 2.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn gram dương từ mẫu máu tồn phần dựa theo quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit 30 2.2.3 Phương pháp Miles - Misra cấy trải theo bậc pha loãng đếm CFU ước tính mật độ vi khuẩn dung dịch 32 2.2.4 Thiết kế mồi thành phần phản ứng PCR 34 2.2.4.1 Thiết kế mồi dựa gen cpn60 S suis phản PCR 34 2.2.4.2 Hóa chất dụng cụ dùng PCR 35 2.2.4.3 Thành phần phản ứng PCR 35 2.2.5 Thiết kế mồi thành phần phản ứng phương pháp LAMP 37 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang iii 2.2.6 Tối ưu hóa thành phần điều kiện phản ứng .42 2.2.7 Khảo sát độ đặc hiệu mồi phản ứng PCR LAMP 42 2.2.8 So sánh độ nhạy phương pháp LAMP phương pháp nuôi cấy 43 Kết .46 3.1 Xác định độ đặc hiệu mồi cpn60 phản ứng PCR .46 Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát S suis 48 3.2 3.2.1 Quan sát kết LAMP điện di chất thị Pico green 48 3.2.2 Khảo sát độ đặc hiệu Pico Green 49 3.2.3 Tối ưu hóa thành phần điều kiện phản ứng .50 3.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng 50 3.2.3.2 Nồng độ Betaine .51 3.2.3.3 Nồng độ dNTPs .52 3.2.3.4 Thời gian phản ứng 53 3.2.3.5 Khảo sát độ đặc hiệu mồi phản ứng LAMP 54 3.3 So sánh ngưỡng phát phương pháp LAMP nuôi cấy 57 3.3.1 Khảo sát nồng độ kháng sinh ceftriaxone gây chết S.suis CM368 57 3.3.2 Xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian (time kill-curve) chủng S suis CM 368 mơi trường có ceftriazone nồng độ 8xMIC 62 3.3.3 So sánh ngưỡng phát phương pháp nuôi cấy LAMP .64 3.4 Thảo luận .65 Kết luận – Đề xuất 67 4.1 Kết luận .67 4.2 Đề xuất 67 Tài liệu tham khảo 68 Phụ lục 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: S suis mơi trường thạch máu kính hiển vi Hình 1.2: Ban hoại tử da, xuất huyết da Hình 1.3: S suis lẫn tránh hệ miễn dịch bẩm sinh tế bào vật chủ 10 Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm vào hệ thần kinh trung ương 12 Hình 1.5: Cấu trúc chaperonin 60 chaperonin 10 14 Hình 1.6: Mơ hình tế bào hình thành chaperonin tình trạng bị stress 15 Hình 1.7: Vị trí mồi phản ứng trình tự DNA mục tiêu 19 Hình 1.8: Cơ chế hoạt động mồi phản ứng LAMP 21 Hình 1.9: Sản phẩm khuếch đại phản ứng LAMP 22 Hình 1.10: Độ đục sản phẩm khuếch đại phản ứng LAMP 23 Hình 1.11: Quá trình phát sản phẩm khuếch đại sử dụng chất thị huỳnh quang kim loại (calcein) 23 Hình 1.12: Pico green đổi màu có hình thành sản phẩm phản ứng LAMP 24 Hình 2.1: Các bước phương pháp Miles-Misra nhằm ước mật độ tế bào vi khuẩn dung dịch 33 Hình 2.2: Hình minh họa điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen cpn60 S suis 34 Hình 2.3: Vị trí mồi trình tự gen cpn60 S suis 39 Hình 3.1: Độ đặc hiệu mồi phản ứng PCR 46 Hình 3.2: Độ đặc hiệu mồi phản ứng PCR 47 Hình 3.3: Sản phẩm LAMP quan sát mắt thường 48 Hình 3.4: Độ đặc hiệu Pico Green 50 Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ 51 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ Betaine 52 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang v Hình 3.7: Ảnh hưởng nồng độ dNTPs 53 Hình 3.8: Ảnh hưởng thời gian phản ứng 54 Hình 3.9: Độ đặc hiệu mồi phản ứng LAMP chủng khác 55 Hình 3.10: Độ đặc hiệu mồi phản ứng LAMP chủng S suis 56 Hình 3.11: S suis CM 368 mọc môi trường thạch máu sau ủ với ceftriaxone với nồng độ 2xMIC (0.4 μg/ml) 24h 58 Hình 3.12: S suis CM 368 mọc môi trường thạch máu sau ủ với ceftriaxone với nồng độ 4xMIC (0.8 μg/ml) 24h 69 Hình 3.13: S suis CM 368 mọc môi trường thạch máu sau ủ với ceftriaxone với nồng độ 8xMIC (1,6 μg/ml) 24h 61 Hình 3.14: Ngưỡng phát phương pháp LAMP sản phẩm quan sát điện di 64 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang vi DANH MỤC BẢNG, ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Trình tự mồi phản ứng PCR 34 Bảng 2.2: Thành phần hóa chất phản ứng PCR 35 Bảng 2.3: Thông số mồi phản ứng LAMP 39 Bảng 2.4: Thành phần hóa chất phản ứng LAMP 41 Bảng 3.1: Nồng độ S suis giảm sau ủ với ceftriaxone (2xMIC 4xMIC) thời điểm 24h 60 Bảng 3.2: Nồng độ S suis giảm sau ủ với ceftriaxone 8xMIC thời điểm 24h 62 Bảng 3.3: So sánh ngưỡng phát phương pháp LAMP nuôi cấy 65 Biểu đồ 1.1: Số ca bệnh S suis bệnh viện Nhiệt Đới 1998-07/2007 Đồ thị 3.1: Đường cong chết phụ thuộc thời gian chủng S suis CM368 nhạy ceftriaxone mơi trường có ceftriaxone nồng độ 8xMIC 64 Sơ đồ 2.1: Quy trình tách chiết DNA từ chủng 28 Sơ đồ 2.2: So sánh độ nhạy phương pháp nuôi cấy LAMP 44 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 77 Các chủng vi khuẩn khác Klebsiella E.coli ATCC 25922 Acinetobacter Pseudomonas Salmonella S.pneumonia ATCC 33400 Methicillin-resistance staphylococcus aureus Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Pasteurella multocida Enterococcus faecium Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) Phòng vi sinh (Oucru) FX: mẫu amidan heo khỏe BM: dịch não tủy bệnh nhân viêm màng não Phụ lục 2: Nồng độ vi khuẩn S suis (1,47x105 cfu/ml) giảm ủ với kháng sinh ceftriaxone 8xMIC khoảng thời gian 0h, 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, 24h Thời gian (h) 16 24 control 8xMIC cfu/ml 147000 147000 3967000 90000 41000000 15000 105000000 3500 186000000 350 207000000 50 207240000 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 78 Phụ lục 3: Kết blast mồi F3, B3, FIP, BIP Kết blast mồi F3 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 79 Kết blast mồi F2 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 80 Kết blast mồi F1c LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 81 Kết bast B2 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 82 Kết blast B1c LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 83 Kết bast B3 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng việt Trịnh Thị Minh Liên, Nguyễn Nguyên Huyền, Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng kết điều trị trường hợp nhiễm khuẩn S suis Bệnh viện Nhiệt đới trung ương Kỷ yếu Hội nghị khoa học Chuyên đề Bệnh Truyền nhiễm, Bệnh viện Bạch Mai, 2011 Sầm Đỗ Dũng, Trần Thị Bích Chiêu, Lê Minh Khánh, Thái Quốc Hiếu, Ngô Thị Hoa, Bội nhiễm Streptococcus suis heo nhiễm virus gây hội chứng hô hấp sinh sản tỉnh Tiền Giang Journal Of Biotechnology  Tiếng Anh 10 11 A Dmitriev M Bhide2, I Mikula, cpn60 Gene Based Multiplex-PCR Assay for Simultaneous Identification of Streptococcal Species ACTA VET BRNO, 2006 75: p 235-240 Arends J P and Zanen H C., Meningitis caused by Streptococcus suis in humans Rev Infect Dis, 1988 10(1): p 131-7 Auer J., et al., Streptococcus infection and splenectomy Lancet, 2001 357(9262): p 1130 Backman A., et al., Evaluation of an extended diagnostic PCR assay for detection and verification of the common causes of bacterial meningitis in CSF and other biological samples Mol Cell Probes, 1999 13(1): p 49-60 Baddeley P G., Streptococcus suis infection Occup Med (Lond), 1995 45(4): p 222 Baums C G., et al., Prevalence of Streptococcus suis genotypes in wild boars of Northwestern Germany Appl Environ Microbiol, 2007 73(3): p 711-7 Benga L., Friedl P., and Valentin-Weigand P., Adherence of Streptococcus suis to porcine endothelial cells J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005 52(9): p 392-5 Benga L., et al., Non-encapsulated strains reveal novel insights in invasion and survival of Streptococcus suis in epithelial cells Cell Microbiol, 2004 6(9): p 867-81 Bonifait L and Grenier D., The SspA subtilisin-like protease of Streptococcus suis triggers a pro-inflammatory response in macrophages through a non-proteolytic mechanism BMC Microbiol 11: p 47 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 69 12 Brousseau R., et al., Streptococcus suis serotypes characterized by analysis of chaperonin 60 gene sequences Appl Environ Microbiol, 2001 67(10): p 4828-33 13 Chanter N., Jones P W., and Alexander T J., Meningitis in pigs caused by Streptococcus suis a speculative review Vet Microbiol, 1993 36(1-2): p 39-55 14 Chau P Y., Huang C Y., and Kay R., Streptococcus suis meningitis An important underdiagnosed disease in Hong Kong Med J Aust, 1983 1(9): p 414-6, 417 15 Cloutier G., et al., Epidemiology of Streptococcus suis serotype infection in a pig herd with and without clinical disease Vet Microbiol, 2003 97(12): p 135-51 16 Devriese L A., et al., Identification and composition of the tonsillar and anal enterococcal and streptococcal flora of dogs and cats J Appl Bacteriol, 1992 73(5): p 421-5 17 Donsakul K., Dejthevaporn C., and Witoonpanich R., Streptococcus suis infection: clinical features and diagnostic pitfalls Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2003 34(1): p 154-8 18 Dukes J P., King D P., and Alexandersen S., Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-andmouth disease virus Arch Virol, 2006 151(6): p 1093-106 19 Endo S., et al., Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method FEMS Microbiol Lett, 2004 234(1): p 93-7 20 Enosawa M., et al., Use of loop-mediated isothermal amplification of the IS900 sequence for rapid detection of cultured Mycobacterium avium subsp paratuberculosis J Clin Microbiol, 2003 41(9): p 4359-65 21 Ewalt K L., et al., In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system Cell, 1997 90(3): p 491-500 22 Fittipaldi N., et al., Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis Future Microbiol 7(2): p 259-79 23 Fittipaldi N., et al., D-alanylation of lipoteichoic acid contributes to the virulence of Streptococcus suis Infect Immun, 2008 76(8): p 3587-94 24 Florence Berthelot-He´Rault Corinne Marois, Marcelo Gottschalk, and Maryle`Ne Kobisch1, Genetic Diversity of Streptococcus suis Strains Isolated from Pigs and Humans as Revealed by Pulsed-Field Gel Electrophoresis JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2001 4(2): p 615-619 25 Gallagher F., Streptococcus infection and splenectomy Lancet, 2001 357(9262): p 1129-30 26 Goonetilleke A K., et al., A comparative analysis of pharmacokinetics of ceftriaxone in serum and pleural fluid in humans: a study of once daily LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 70 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 administration by intramuscular and intravenous routes J Antimicrob Chemother, 1996 38(6): p 969-76 Goto M., et al., Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue Biotechniques, 2009 46(3): p 167-72 Gottschalk M., et al., Characterization of six new capsular types (23 through 28) of Streptococcus suis J Clin Microbiol, 1991 29(11): p 25904 Gottschalk M and Segura M., The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions Vet Microbiol, 2000 76(3): p 259-72 Gottschalk M., Segura M., and Xu J., Streptococcus suis infections in humans: the Chinese experience and the situation in North America Anim Health Res Rev, 2007 8(1): p 29-45 Gruening P., et al., Structure, regulation, and putative function of the arginine deiminase system of Streptococcus suis J Bacteriol, 2006 188(2): p 361-9 Gupta R S., Evolution of the chaperonin families (Hsp60, Hsp10 and Tcp1) of proteins and the origin of eukaryotic cells Mol Microbiol, 1995 15(1): p 1-11 Gutsche I., Essen L O., and Baumeister W., Group II chaperonins: new TRiC(k)s and turns of a protein folding machine J Mol Biol, 1999 293(2): p 295-312 H J Wisselink H E Smith, N Stockhofe-Zurwieden, K Peperkamp, U Vecht, Distribution of capsular types and production of muramidase-released protein (MRP) and extracellular factor (EF) of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven European countries Veterinary Microbiology, 2000 74(3): p 237-248 Halaby T., et al., Streptococcus suis meningitis, a poacher's risk Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2000 19(12): p 943-5 Hemmingsen S M., et al., Homologous plant and bacterial proteins chaperone oligomeric protein assembly Nature, 1988 333(6171): p 330-4 Higgins R., et al., Description of six new capsular types (29-34) of Streptococcus suis J Vet Diagn Invest, 1995 7(3): p 405-6 Hill J., et al., Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of common strains of Escherichia coli J Clin Microbiol, 2008 46(8): p 2800-4 Hill J E., et al., Biochemical analysis, cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32 and 34, isolated from pigs, are Streptococcus orisratti Vet Microbiol, 2005 107(1-2): p 63-9 Huang Y T., et al., Streptococcus suis infection J Microbiol Immunol Infect, 2005 38(5): p 306-13 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 71 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Hui Ac Ng Kc, Tong Py, Mok V, Chow Km, Wu a, Wong Lk., Bacterial meningitis in Hong Kong: 10-years' experience Clin Neurol Neurosurg, 2005 107(Clin Neurol NeurosurgClin Neurol Neurosurg): p 336-370 Ip M., et al., Streptococcus suis in Hong Kong Diagn Microbiol Infect Dis, 2007 57(1): p 15-20 Iwamoto T., Sonobe T., and Hayashi K., Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M avium, and M intracellulare in sputum samples J Clin Microbiol, 2003 41(6): p 2616-22 Kay R., Cheng A F., and Tse C Y., Streptococcus suis infection in Hong Kong Qjm, 1995 88(1): p 39-47 Kirby A C., et al., The potent bone-resorbing mediator of Actinobacillus actinomycetemcomitans is homologous to the molecular chaperone GroEL J Clin Invest, 1995 96(3): p 1185-94 Klunker D., et al., Coexistence of group I and group II chaperonins in the archaeon Methanosarcina mazei J Biol Chem, 2003 278(35): p 33256-67 Kong T H., et al., Mycobacterium tuberculosis expresses two chaperonin60 homologs Proc Natl Acad Sci U S A, 1993 90(7): p 2608-12 Kopic J., Paradzik M T., and Pandak N., Streptococcus suis infection as a cause of severe illness: cases from Croatia Scand J Infect Dis, 2002 34(9): p 683-4 Kubo T., et al., Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for detection of pandemic (H1N1) 2009 virus as a novel molecular method for diagnosis of pandemic influenza in resource-limited settings J Clin Microbiol 48(3): p 728-35 Kwok A Y., et al., Species identification and phylogenetic relationships based on partial HSP60 gene sequences within the genus Staphylococcus Int J Syst Bacteriol, 1999 49 Pt 3: p 1181-92 Lecours M P., et al., Critical role for Streptococcus suis cell wall modifications and suilysin in resistance to complement-dependent killing by dendritic cells J Infect Dis 204(6): p 919-29 Lewthwaite J., Skinner A., and Henderson B., Are molecular chaperones microbial virulence factors? Trends Microbiol, 1998 6(11): p 426-8 Li M., et al., SalK/SalR, a two-component signal transduction system, is essential for full virulence of highly invasive Streptococcus suis serotype PLoS One, 2008 3(5): p e2080 Lutticken R., et al., Meningitis caused by Streptococcus suis: case report and review of the literature Infection, 1986 14(4): p 181-5 M Gottschalk R Higgins and S Quessy, Dilemma of the Virulence of Streptococcus suis Strains JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 1999 37(12): p 4202–4203 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 72 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Madsen L W., et al., Bacterial colonization and invasion in pigs experimentally exposed to Streptococcus suis serotype in aerosol J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2002 49(5): p 211-5 Maguire M., Coates A R., and Henderson B., Chaperonin 60 unfolds its secrets of cellular communication Cell Stress Chaperones, 2002 7(4): p 317-29 Mai N T., et al., Streptococcus suis meningitis in adults in Vietnam Clin Infect Dis, 2008 46(5): p 659-67 Manzin A., et al., Streptococcus suis meningitis without history of animal contact, Italy Emerg Infect Dis, 2008 14(12): p 1946-8 Marcelo G Gottschalk, Sonia Lacouture and J Daniel Dubreuil, Characterization of Streptococcus suis capsular type haemolysin Microbiology, 1995 141: p 189-195 Marcelo Gottschalk, Porcine Streptococcus suis strains as potential sources of infections in humans: an underdiagnosed problem in North America? Journal of Swine Health and Production, 2004 12(4): p 197-199 Marcelo Gottschalk Mariela Segura, The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions Veterinary Microbiology, 2000 76: p 259-272 Matsuo H and Sakamoto S., [Purulent meningitis caused by Streptococcus suis in a pig breeder] Kansenshogaku Zasshi, 2003 77(5): p 340-2 Mazokopakis E E., et al., First case report of Streptococcus suis septicaemia and meningitis from Greece Eur J Neurol, 2005 12(6): p 4879 Meiri-Bendek I., et al., A PCR-based method for the detection of Streptococcus agalactiae in milk J Dairy Sci, 2002 85(7): p 1717-23 Mori Y., et al., Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation Biochem Biophys Res Commun, 2001 289(1): p 150-4 Nagamine K., Hase T., and Notomi T., Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers Mol Cell Probes, 2002 16(3): p 223-9 Nakayama T., et al., Streptococcus suis infection induces [corrected] bacterial accumulation in the kidney Microb Pathog 50(2): p 87-93 Nghia H D., et al., Human case of Streptococcus suis serotype 16 infection Emerg Infect Dis, 2008 14(1): p 155-7 Nghia H D., et al., Risk factors of Streptococcus suis infection in Vietnam A case-control study PLoS One 6(3): p e17604 Norton P M., et al., Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin FEMS Immunol Med Microbiol, 1999 26(1): p 25-35 Notomi T., et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Res, 2000 28(12): p E63 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 73 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 Ohtsuki R., et al., Rapid detection of Brucella spp by the loop-mediated isothermal amplification method J Appl Microbiol, 2008 104(6): p 181523 Perch B Kristjansen P, Skadhauge Kn , Group R streptococci pathogenic for man.Two cases of meningtis and one fatal case of sepsis Acta Pathol Microbiol Scand , 1968 74(1): p 69-76 Perch B., Pedersen K B., and Henrichsen J., Serology of capsulated streptococci pathogenic for pigs: six new serotypes of Streptococcus suis J Clin Microbiol, 1983 17(6): p 993-6 Ranford J C., Coates A R., and Henderson B., Chaperonins are cellsignalling proteins: the unfolding biology of molecular chaperones Expert Rev Mol Med, 2000 2(8): p 1-17 Ranson N A., White H E., and Saibil H R., Chaperonins Biochem J, 1998 333 ( Pt 2): p 233-42 Robertson I D and Blackmore D K., Occupational exposure to Streptococcus suis type Epidemiol Infect, 1989 103(1): p 157-64 Rusmeechan S and Sribusara P., Streptococcus suis meningitis: the newest serious infectious disease J Med Assoc Thai, 2008 91(5): p 654-8 Saibil H R and Ranson N A., The chaperonin folding machine Trends Biochem Sci, 2002 27(12): p 627-32 Sandra F Amass Dvm, Ms; L Kirk Clark, Dvm, Phd; Kay Knox; Ching Ching Wu, Dvm, Phd; and Michael A Hill Ms, Phd, Mrcvs, Streptococcus suis colonization of piglets during parturition Swine Health and Production, 1996 4(6) Segura M., Streptococcus suis: an emerging human threat J Infect Dis, 2009 199(1): p 4-6 Segura M and Gottschalk M., Streptococcus suis interactions with the murine macrophage cell line J774: adhesion and cytotoxicity Infect Immun, 2002 70(8): p 4312-22 Segura M., Stankova J., and Gottschalk M., Heat-killed Streptococcus suis capsular type strains stimulate tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 production by murine macrophages Infect Immun, 1999 67(9): p 4646-54 Smith H E., et al., The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1, 2, and 9: development of rapid serotype-specific PCR assays J Clin Microbiol, 1999 37(10): p 3146-52 Smith T C., et al., Exposure to Streptococcus suis among US swine workers Emerg Infect Dis, 2008 14(12): p 1925-7 Staats J J., et al., Streptococcus suis: past and present Vet Res Commun, 1997 21(6): p 381-407 Strangmann E., Froleke H., and Kohse K P., Septic shock caused by Streptococcus suis: case report and investigation of a risk group Int J Hyg Environ Health, 2002 205(5): p 385-92 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 74 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 Suankratay C., et al., Streptococcus suis meningitis in Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2004 35(4): p 868-76 Tambyah P A., et al., Streptococcus suis infection complicated by purpura fulminans and rhabdomyolysis: case report and review Clin Infect Dis, 1997 24(4): p 710-2 Tanabe S., Gottschalk M., and Grenier D., Hemoglobin and Streptococcus suis cell wall act in synergy to potentiate the inflammatory response of monocyte-derived macrophages Innate Immun, 2008 14(6): p 357-63 Tang J., et al., Streptococcal toxic shock syndrome caused by Streptococcus suis serotype PLoS Med, 2006 3(5): p e151 Teekakirikul P and Wiwanitkit V., Streptococcus suis infection: overview of case reports in Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2003 34 Suppl 2: p 178-83 Tenenbaum T., et al., Strain-dependent disruption of blood-cerebrospinal fluid barrier by Streptoccocus suis in vitro FEMS Immunol Med Microbiol, 2005 44(1): p 25-34 Tenenbaum T., et al., Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro Cell Microbiol, 2009 11(2): p 323-36 Tomita N., et al., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products Nat Protoc, 2008 3(5): p 877-82 Torremorell M., Calsamiglia M., and Pijoan C., Colonization of suckling pigs by Streptococcus suis with particular reference to pathogenic serotype strains Can J Vet Res, 1998 62(1): p 21-6 Wastling S L., et al., LAMP for human African trypanosomiasis: a comparative study of detection formats PLoS Negl Trop Dis 4(11): p e865 Watkins E J., et al., Septicaemia in a pig-farm worker Lancet, 2001 357(9249): p 38 Wertheim H F., et al., Streptococcus suis, an important cause of adult bacterial meningitis in northern Vietnam PLoS One, 2009 4(6): p e5973 Wichgers Schreur P J., et al., Lgt processing is an essential step in Streptococcus suis lipoprotein mediated innate immune activation PLoS One 6(7): p e22299 Wichgers Schreur P J., et al., TroA of Streptococcus suis is required for manganese acquisition and full virulence J Bacteriol 193(19): p 5073-80 Willenburg K S., Sentochnik D E., and Zadoks R N., Human Streptococcus suis meningitis in the United States N Engl J Med, 2006 354(12): p 1325 Wilson S M., et al., Interactions between Streptococcus suis serotype and cells of the myeloid lineage in the palatine tonsil of the pig Vet Immunol Immunopathol, 2007 117(1-2): p 116-23 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 75 105 106 107 108 109 110 Winterhoff N., et al., Identification and characterization of two temperature-induced surface-associated proteins of Streptococcus suis with high homologies to members of the Arginine Deiminase system of Streptococcus pyogenes J Bacteriol, 2002 184(24): p 6768-76 Wisselink H J., et al., Detection of virulent strains of Streptococcus suis type and highly virulent strains of Streptococcus suis type in tonsillar specimens of pigs by PCR Vet Microbiol, 1999 67(2): p 143-57 Ye C., et al., Spread of Streptococcus suis sequence type 7, China Emerg Infect Dis, 2008 14(5): p 787-91 Yen M Y., et al., Streptococcus suis meningitis complicated with permanent perceptive deafness: report of a case J Formos Med Assoc, 1994 93(4): p 349-51 Yu H., et al., Human Streptococcus suis outbreak, Sichuan, China Emerg Infect Dis, 2006 12(6): p 914-20 Zhao-Rong Lun Qiao-Ping Wang, Xiao-Guang Chen, an-Xing Li, XingQuan Zhu, Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen Lancet Infect Dis, 2007 7: p 201-209 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ... ? ?Xây dựng quy trình Loop- mediated isothermal amplification (LAMP) dựa vào gen cpn60 nhằm phát Streptococcus suis? ??  Mục đích nghiên cứu  Mục tiêu đề tài - Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát Streptococcus. .. cho vào đĩa thạch LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 34 2.2.4 Thiết kế mồi thành phần phản ứng PCR 2.2.4.1 Thiết kế mồi dựa gen cpn60 S suis phản ứng PCR Mồi thiết kế dựa trình tự đoạn gen cpn60. .. Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis có tính đặc hiệu cao [3] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Trang 17 Từ kết luận gen cpn60 có tiềm ứng dụng q trình chẩn đốn phát