Một phương pháp được phát triển để định lượng các flavonoids quercetin và kaempferol trong nước tiểu người sử dụng chiết pha rắn theo sắc ký khí. Chất nội chuẩn có dơteri của chất đang phân tích được thêm vào trong các mẫu trước khi chiết. Giới hạn phát hiện của phương pháp khoảng: 10 pg trên cột và độ chính xác của phương pháp định lượng trong mỗi mẫu nước tiểu là ± 9,4% với kaempferol và ± 7,34% với quercetin. Các mẫu nước tiểu được xử lý với β– glucuronidase tăng rõ rệt mức độ của flavonoid được phát hiện, củng cố thêm quan điểm rằng kaempferol và quercetin là bài tiết trong nước tiểu như các glucuronide.
TÓM TẮT Một phương pháp được phát triển để định lượng các flavonoids quercetin và kaempferol nước tiểu người sử dụng chiết pha rắn theo sắc ký khí Chất nội chuẩn có dơteri của chất phân tích được thêm vào các mẫu trước chiết Giới hạn phát hiện của phương pháp khoảng: 10 pg cột và độ chính xác của phương pháp định lượng mỗi mẫu nước tiểu là ±9,4% với kaempferol và ± 7,34% với quercetin Các mẫu nước tiểu được xử lý với β-glucuronidase tăng rõ rệt mức độ của flavonoid được phát hiện, củng cố thêm quan điểm rằng kaempferol và quercetin là bài tiết nước tiểu các glucuronide NỢI DUNG I GIỚI THIỆU Flavonoids là mợt nhóm lớn của polyphenols tự nhiên với một phạm vi dược tính rộng [1] Ví dụ, có khẳng định cho rằng khẩu phần ăn giàu flavonoid tỉ lệ nghịch với nguy mắc bệnh tim mạch vành [2] và đặc tính không bị oxy hóa của một số flavonoid có thể bảo vệ chống lại các loại bệnh ung thư nhất định [3, 4] Quercetin và kaempferol là flavonoid phổ biến thực phẩm và được đặc biệt quan tâm chất chống oxy hóa, chúng có một nhóm 3-hydroxyl với khả oxy hóa tương đối thấp, mà bị oxy hóa vẫn không thay đổi, vậy tránh được sự lặp lại của sự oxy hóa – khử [5] Khi một hàm lượng đáng kể của các flavonoid được tiêu thụ hằng ngày khẩu phần ăn phương Tây, một số nghiên cứu dựa sự hấp phụ, chuyển hóa và bài tiết của các lớp hợp chất thể người Nghiên cứu sự hấp phụ của flavoniod có sự mâu thuẫn và các tranh luận quanh vấn đề chúng hấp thụ các aglycone hay glycosides mặc dù một nghiên cứu gần đã có khả chứng minh được các glycoside flavonoid các cấu tử bình thường của huyết tương người [6] Sự chuyển hóa của các flavonoid theo chế hấp phụ có thể có một ảnh hưởng lớn các đặc tính sinh học của chúng, và gần [7], một nghiên cứu đã đồng ý rằng sự chuyển hóa của kaempferol và quercetin người có thể khác so với quan sát ống nghiệm sử dụng vi lạp thể gan chuột, nơi mà kaempferol được chuyển hóa thành quercetin bởi phản ứng hydro hóa của vòng B các nghiên cứu giống đều không phát hiện được quercetin mẫu nước tiểu Điều này đã khẳng định rằng sự hydro hóa của kaempferol thành quercein có thể không xuất hiện thể người Một phương pháp bán định lượng để đánh giá flavonoid nước tiểu người theo chế độ ăn uống có thuốc Ginkgo bilabo được phát triển gần phòng thí nghiệm của chúng [8] Nghiên cứu gần mô tả một phương pháp nâng cao để định lượng kaempferol và quercetin nước tiểu người cả trước và sau dùng thuốc Ginkgo bilabo sử dụng dẫn xuất có chứa Dơteri của các hợp chất này chất nội chuẩn và dùng phương pháp chiết pha rắn để điều chế mẫu II THÍ NGHIỆM 2.1 Hóa chất Hóa chất được chuẩn bị từ các nguồn sau: kaempferol, quercetin, sulphat (EC 3.1.6.1), β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), KH2PO4, CH3COOH, CH3COONa, Na2SO4 khan, C2D4O2 (98% Dơteri), DCl (99,5% Dơteri), C2H6O (99,5% Dơteri), trifluoroacetic acid (TFA), và dung dịch Dơteri (99,9% Dơteri) từ Sigma – Aldrich Chemical Co (Poole, Dorset, UK) HPLC sử dụng methanol và acetolnitrile từ BDH – Merck (Poole, Dorset, UK) N-O-(bis)trimetylsilyl acetamide (BSA) từ Fluka Chemical Co (Poole, Dorset, UK) Tổng hàm lượng quy định của thuốc Ginkgo biloba là 28,8 mg flavonoid glycosides và được mua từ Boots (Glasgow, UK) 2.2 Điều chế chất nội chuẩn có Dơteri Dẫn xuất Dơteri của kaempferol ([2H4] – kaempferol) và quercetin ([2H5] – quercetin) được điều chế sau: 10 mg của quercetin hoặc kaempferol được hịa tan hỡn hợp của ml CH 3COO2H và ml của dung dịch 1:4 (v/v) của 2HCl (37% w/w) D2O Dung dịch được đun nóng ống nghiệm ở 800C ngày Hỗn hợp phản ứng đã làm nguội được làm bay dưới điều kiện áp suất thấp bởi một hàm lượng nho C2H5O2H (3x1 ml) Chất bã (khoảng mg) được chiết với ethyl acetate (2x4 ml); dịch trích ly hỗn hợp hữu được sấy khô qua một ống pipette Pasteur với Na2SO4 khan (khoảng 2g) và dung mơi bay dưới dịng N Thành phần đờng vị của dẫn xuất dơteri kaempferol và quercetin được đánh giá bởi NICI GC-MS với TMS dùng để kiểm tra ion được chọn Bảng chỉ các peak đồng vị cho cả chất nội chuẩn và flavonoid không có dơteri Đối với trường hợp của quercetin, sự có mặt của năm nguyên tử Si cấu trúc và số lượng lớn carbon M+1 và M+2 là nhiều 2.3 Phân tích GC – MS Hệ thống HP5988A GC-MS được sử dụng phương pháp ion hóa ion âm (NICI) với methane chất khí phản ứng được đưa vào để cung cấp một nguồn ion tại áp suất 133,3 Pa Sắc ký khí được gắn với một cột mao quản Restek RTX – (30 m, 0.32 mm I.D., 0.5 μm) với Heli một chất khí mang tại 68,9 Kpa Nhiệt độ buồng bơm mẫu được điều chỉnh tại 2500C và dịng di chủn GC-MS tại 2800C Bợ phận điều nhiệt có chương trình điều khiển nhiệt độ sau: 160 0C (1 phút), sau đó tại 200C phút-1 là 2900C, và 3200C tại 50C phút-1 Ion được chọn sau đã kiểm tra được sử dụng cho định lượng Kiểm tra các ion này sau: m/z 662 và 574 (tương ứng với TMS từ dẫn xuất quercetin và kaempferol), m/z 577 và 578 (tương ứng với dẫn xuất của kaempferol có doteri) , m/z 666 và 667 (tương ứng với dẫn xuất quercetin có doteri), nhìn hình 2.4 Sự thu thập và điều chế các mẫu nước tiểu Các mẫu nước tiểu được thu thập từ năm người tình nguyện không có chế độ ăn kiêng, giờ trước và sau uống một viên thuốc Ginkgo biloba Các mẫu nước tiểu được giữ tủ lạnh (tại -20 0C) Trước phân tích, dung dich nước tiểu được quay ly tâm (10000 vòng, phút) và lớp bề mặt được đem phân tích Sự thủy phân enzym với sulfat được thực hiện với việc đưa ml nước tiểu gồm 10 đơn vị sulfat 0,25 ml dung dịch đệm CH3COONa 1M (pH =5), mẫu được bảo quản giờ tại 37 0C Sự thủy phân với glucuronidase được thực hiện bởi 100 đơn vị glucuronidase 0,25 ml dung dịch đệm K2PO4 (pH=6,8) được đưa vào ml nước tiểu và bảo quản giờ tại 370C Các mẫu glucuronidase đã xử lý được acid hóa với ml HCl 1M trước đem chiết pha rắn (SPE) Sự thủy phân acid được thực hiện 0,5 ml HCl 3M được đưa vào ml nước tiểu và được đun nóng ở 800C giờ Các mẫu này được đệm pH=6,8 trước chiết pha rắn bởi đưa vào mẫu ml dung dịch đệm phosphate 1M Các mẫu không thủy phân được điều chế cho chiết pha rắn bởi sự thêm vào 0,25 ml dung dịch đệm CH3COONa 1M (pH=5) ml dung dịch nước tiểu Chất nội chuẩn chứa dơteri (200 ng) được đưa vào tất cả các mẫu trước chiết pha rắn 2.5 Chiết pha rắn Hộp ISOLUTE ENV+ (100 mg ml-1) ( Craw ford Scientific, Strathaven) được điều ẩm bằng cách nho giọt liện tục ml của methanol và 0,8 ml nước với mợt tớc đợ dịng chảy khoảng ml phút-1 Hộp đựng các mẫu sau phân tích được làm sạch bởi không khí và sau đó rửa với 1,5 ml (3 x 0,5 ml) của dung dịch methanol nước 7% (được điều chỉnh đến pH 3,5 với TFA 0,01M) tại tớc đợ dịng chảy khoảng 3,5 ml phút -1 Cuối cùng, các hộp đựng mẫu được ngâm ml (2 x 0,5 ml) dung dịch acetonitrile nước (8:2) tại tớc đợ dịng chảy khoảng 3,5 ml phút -1 các mẫu được phụt khí làm khơ bởi dịng N2 và chất bã cịn lại được tạo dẫn xuất bởi 0,2 ml của BSA, đun nóng các mẫu các ống nghiệm có nắp đậy kín tại 70 C phút Các dung dịch mẫu (1μl) được nạp vào GC-MS với một ống bơm Hamilton 10 μl 2.6 Sự tái sinh thí nghiệm Để xác định sự tái sinh của kaempferol và quercetin sử dụng phương pháp chiết pha rắn, ml của nước cất được thêm với 50 ng của cả quercetin và kaempferol và chiết tương tự phương pháp chiết pha rắn sử dụng cho các mẫu nước tiểu Để xác định sự tái sinh, 200 ng của chất nội chuẩn doteri được đưa vào trước hoặc sau chiết rắn Sự tái sinh được tính toán bởi sự so sánh tỉ lệ diện tích peak chứa chất phân tích có dơteri và không dơteri thu được thêm chất nội chuẩn trước và sau chiết rắn 2.7 Sự hiệu chuẩn và định lượng Đường cong hiệu chuẩn được chuẩn bị cho quercetin và kaempferol bởi hỗn hợp có hàm lượng khác (0 – 200 ng) của quercetin hoặc kaempferol không có dơteri với hàm lượng không đổi (100 ng mỗi chất) và sau đó tạo dẫn xuất mô tả Trong các mẫu, tỉ lệ diện tích giữa các peak của quercetin và kaempferol không có doteri (tương ứng m/z 662 và 574) và có dơteri (tương ứng m/z 666 + m/z 667 và m/z 577 + m/z 578) được sử dụng cho định lượng (nhìn hình 1) với sự tham khảo từ các đường cong hiệu chuẩn 2.8 Phân tích thống kê Ý nghĩa giữa các nhóm nghiên cứu được kiểm chứng bằng phương pháp ghép cặp Student’s t-test III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu gần mô tả phương pháp GC-MS định lượng flavonoids nước tiểu người sử dụng dẫn xuất dơteri của kaempferol và quercetin chất nội chuẩn Sử dụng chiết pha rắn trước phân tích để cải thiện nghiên cứu trước đó [8] Sự cải thiện này cho phép định lượng quercetin và kaempferol tại mức thấp các mẫu nước tiểu từ đối tượng trước tiêu thụ thuốc của Gikgo biloba Vì vậy, nồng độ của kaempferol và quercetin từ các mẫu này phản ánh sự đóng góp của một chế độ ăn uống bình thường và không bổ sung Hình tương ứng các chất kaempferol và quercetin có doteri Tất cả các vị trí proton quercetin là kích hoạt để trao đổi với dơteri điều kiện acid và vị trí hoạt hóa kaempferol Từ bảng ta có thể thấy nó không trao đổi hoàn toàn với các proton đó, quercetin là hỗn hợp của các đồng vị 2H4 và 2H5, và kaempferol là hỗn hợp của các đồng vị 2H3 và 2H4 Tiềm cho nhiễu xạ xuyên âm giữa các hợp chất không dơteri và các đồng vị dơteri được accessed và được trình bày bảng Lượng lớn các nguyên tử hydro và silicon cấu trúc của hợp chất không dơteri các peaks đồng vị M+1 và M+2 có cường độ cao Tuy nhiên, không có sự giao thoa đáng kể giữa các ion các đồng vị dơteri Phản ứng của quercetin và kaempferol tuyến tính phạm vi tập trung nghiên cứu Khả lặp lại của phương pháp được đánh giá cho mẫu xử lý β-glucuronidase được phân tích ước số riêng biệt và được đưa ở R.S.D ít 10% cho một lượng của kaempferol và quercetin (tương ứng 13.00 ng/ml ± 9.40 % và 4,45 ng /ml ±7.34 %, n = 6) Chiết pha rắn sử dụng kết hợp C18, cation và anion trao đổi có thể sử dụng để xác định flavonoids nước tiểu Trong nghiên cứu của chúng tôi, thí nghiệm sơ bộ cho thấy rằng sử dụng hộp đựng mẫu C 18 không cho phép loại bo các chất nội sinh có chất phân tích Điều này phù hợp với kết quả của Ishiiet al., [11], báo cáo của họ sử dụng anion mạnh trao đổi các hộp đựng mẫu cho khai thác naringin và naringenin từ nước tiểu người thay vì hộp đựng mẫu C18, nó không hiệu quả việc loại bo các chất ảnh hưởng Nghiên cứu hiện tại của chúng sử dụng pha polymeric (hộp đựng Isolute ENV+) đưa lựa chọn tốt hộp đựng C 18, mặc dù nó loại bo không hoàn toàn các chất nội sinh Tuy nhiên, chọn lọc kiểm tra ion là sở cho độ phân giải của các peak Việc tái sinh flavomoids sử dụng phương pháp hiện ảnh hưởng bởi nhu cầu di chuyển của các hợp chất giao thoa Do đó, sự tái sinh thu được sự tương ứng giữa các chất phân tích và loại bo các chất ảnh hưởng Tuy nhiên, xét sự tái sinh của phenol cho hộp đựng C18 là khoảng 50% (công nghệ HPLC, chứng nhận phân tích) chiết xuất polyphenol tái sinh thu được là hợp lý và phù hợp với yêu cầu cao cho pha polymeric ENV+ so với pha C18 Khả tái sinh của kaempferol và quercetin là tương tự (giữa S.D., n = 6) 76.6 ± 10.5 % và 73.0 ± 9.8 %) Hình và đưa lựa chọn ion điển hình cho cùng mẫu nước tiểu trước và sau xử lý với β-glucuronidase Các vết cho thấy các mẫu không được xử lý của quercetin và kaempferol ở mức thấp, và kết quả với các peak nền lớn Trong tất cả các trường hợp, giải quyết bản cho các peak cần quan tâm từ các chất ảnh hưởng được cải thiện Hình cho thấy mức độ flavonoids mẫu nước tiểu trước và sau tiêu thụ thuốc của Ginkgo biloba Mức flavonoids trước tiêu thụ thuốc cho tín hiệu thấp các mẫu sau tiêu thụ, lượng unconjugated của flavonoids lại cao (đặc biệt là quercetin) được phát hiện so với nghiên cứu trước của chúng [8] Các mức được tìm thấy trước tiêu thụ thuốc chủ yếu phản ánh từ chế độ ăn uống, sự biến đổi giữa các cá nhân là được kỳ vọng Trong thực tế, nghiên cứu gần của Hollman [12] chỉ rằng khả tích lũy sinh học của quercetin từ một số loại thực phẩm rất khác nhau, chỉ có một lượng nho được tiêu thụ Trong cùng một nghiên cứu, khả tích lũy sinh học đạt cực đại là 1.39% của lượng đã tiêu thụ Các mẫu xử lý bằng β-glucuronidase cho tín hiệu (P< 0.05) giảm đối với kaempferol và quercetin (hình 4B), cho thấy flavonoids được bài tiết glucuronides Lượng kaempferol và quercetin bài tiết nước tiểu chỉ là một phần nho so với lượng tiêu thụ, điều đó là phù hợp với kết quả [13] Trên thực tế, một nghiên cứu gần [7] đã sử dụng HPLC và LC-MS thì không phát hiện quercetin acid thủy phân nước tiểu người sau tiêu thụ cải xanh và có một lượng nho kaempferol Mặc dù , sulphatase-xử lý mẫu cho thấy lượng lớn kaempferol và quercetin so với mẫu không được xử lý, sự khác này là không có ý nghĩa thống kê mẫu Tuy nhiên, số các mẫu trước uống thuốc cho thấy quercetin tăng rõ rệt sau xử lý sulphatase, điều đó cho thấy sulphatase đã tham gia quá trình trao đổi chất Mẫu acid thủy phân (hình B) cho thấy quercetin có hàm lượng cao đáng kể (P