Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác là enzym Callera Trans LJP30070. Trên cơ sở đó thực hiện phản ứng transeste hóa điều chế Biodiesel từ nguồn dầu ăn đã qua sử dụng xúc tác enzym đạt hiệu quả cao nhất. Kết quả đề tài đã xác định được enzym Callera Trans LJP30070 hoạt động tối ưu với cơ chất là nguồn dầu ăn đã qua sử dụng trong khoảng pH 7÷8, nhiệt độ tối ưu là 70oC, độ bền nhiệt trong khoảng 50÷55oC và enzym bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của cả metanol và etanol. Khi thực hiện phản ứng transeste hóa nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác enzym Callera Trans LJP30070 ở nhiệt độ 40o C, tỉ lệ mol metanol:dầu là 6:1, lượng enzym là 3% trong thời gian phản ứng là 36 giờ thì hiệu suất chuyển hóa metyl este khá cao và sản phẩm thu được tương đối sạch. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa lại thấp hơn hiệu suất ở nhiệt độ 40oC trong 24 giờ khoảng 3,98%.
ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SƯ PHẠM HÓA HỌC - - KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE VÀ PHẢN ỨNG TRANSESTE HĨA XÚC TÁC ENZYM CALLERA TRANS LJP30070 TRÊN NGUỒN DẦU ĂN ĐÃ QUA SỬ DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: Sư phạm Hóa học Giáo viên hướng dẫn TS Phan Thị Bích Trâm Sinh viên thực Võ Thị Tú Nhi Lớp: Sư phạm Hóa học Khóa 36 MSSV: 2102183 Cần Thơ, 2014 Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm luận văn học tập tích lũy nhiều kiến thức, kinh nghiệm bổ ích làm hành trang vững giúp bước đường tới Để đạt kết ngày hơm ngồi nỗ lực thân; tơi cịn nhận động viên, giúp đỡ gia đình, thầy cơ, bạn bè vào lúc khó khăn Vì thế, tơi xin dành trang để gởi lời cám ơn chân thành đến: - Cơ Phan Thị Bích Trâm trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, động viên tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt luận văn - Cơ Phan Thị Ngọc Mai, thầy Nguyễn Mộng Hồng thầy Nguyễn Điền Trung truyền đạt bảo tơi nhiều kinh nghiệm q trình nghiên cứu - Tất thầy cô Bộ môn Sư phạm Hóa học–Khoa Sư Phạm, Trường Đại học Cần Thơ giúp đỡ đóng góp ý kiến giúp luận văn tơi hồn thiện - Gia đình, bạn bè ln hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cám ơn! SVTH: Võ Thị Tú Nhi i Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SVTH: Võ Thị Tú Nhi ii Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN SVTH: Võ Thị Tú Nhi iii Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN .ii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x Chương PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Enzym lipase 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Cấu trúc lipase 2.1.3 Cơ chế phản ứng lipase [14],[15] 2.1.4 Nguồn thu nhận lipase 2.1.5 Ứng dụng lipase [19] 2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase 2.1.6.1 pH 2.1.6.2 Nhiệt độ 2.1.6.3 Chất hoạt hóa 2.1.6.4 Chất kìm hãm 2.1.6.5 Nồng độ enzym/cơ chất 2.2 Biodiesel (BDF) 2.2.1 Khái niệm SVTH: Võ Thị Tú Nhi iv Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm 2.2.2 Ưu nhược điểm BDF 2.2.3 Các phương pháp điều chế BDF 2.2.3.1 Phương pháp sấy nóng 2.2.3.2 Phương pháp pha loãng 2.2.3.3 Phương pháp Crackinh 10 2.2.3.4 Phương pháp nhũ tương hóa 10 2.2.3.5 Phương pháp transester hóa 10 2.2.4 Các phương pháp thực phản ứng transester hóa điều chế BDF 11 2.2.4.1 Phương pháp hóa học (khuấy – gia nhiệt) 11 2.2.4.2 Phương pháp siêu âm 11 2.2.4.3 Phương pháp vi sóng 11 2.2.4.4 Phản ứng transester hóa mơi trường siêu tới hạn 12 2.2.5 Các loại xúc tác phản ứng transester hóa 12 2.2.5.1 Xúc tác bazơ 12 2.2.5.2 Xúc tác axit 12 2.2.5.3 Xúc tác enzym 13 2.2.5.4 Xúc tác dị thể 13 2.2.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất BDF giới nước 13 2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất BDF giới 13 2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất BDF nước 14 2.3 Phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase 14 2.3.1 Cơ chế phản ứng transester hóa 14 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase ………… 16 2.3.2.1 Nhiệt độ 16 2.3.2.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu 16 2.3.2.3 Tỉ lệ enzym/cơ chất 17 2.3.2.4 Hàm lượng nước 17 2.3.2.5 Thời gian phản ứng 17 SVTH: Võ Thị Tú Nhi v Luận văn tốt nghiệp 2.4 GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm Dầu ăn qua sử dụng 17 2.4.1 Nguồn thu nhận 17 2.4.2 Thành phần hóa học dầu ăn qua sử dụng 18 2.4.3 Tính chất dầu ăn qua sử dụng 18 2.4.4 Ưu nhược điểm dầu ăn qua sử dụng để sản xuất BDF 19 2.5 Sắc ký lớp mỏng 20 Chương THỰC NGHIỆM 22 3.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ trang thiết bị 22 3.1.1 Nguyên liệu 22 3.1.2 Hóa chất 22 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 22 3.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu 22 3.2.1 Xác định số axit 22 3.2.2 Xác định số xà phòng 23 3.2.3 Xác định hàm lượng protein enzym 24 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 25 3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính lipase 25 3.3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase 27 3.3.2.1 Ảnh hưởng pH 27 3.3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 27 3.3.2.3 Ảnh hưởng độ bền nhiệt 28 3.3.2.4 Ảnh hưởng dung môi (metanol etanol) 28 3.4 Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase 29 3.4.1 Quy trình thực 29 3.4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transeste hóa xúc tác enzym lipase 30 3.4.2.1 Nhiệt độ 30 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu 30 SVTH: Võ Thị Tú Nhi vi Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm 3.4.2.3 Tỉ lệ mol metanol/dầu 31 3.4.2.4 Thời gian phản ứng 31 3.5 Kiểm tra độ BDF sắc ký mỏng 32 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Thành phần nguyên liệu 33 4.1.1 Chỉ số axit số xà phòng 33 4.1.2 Hàm lượng protein enzym 34 4.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase 35 4.2.1 Ảnh hưởng pH 35 4.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 36 4.2.3 Ảnh hưởng độ bền nhiệt theo thời gian 37 4.2.4 Ảnh hưởng metanol etanol 38 4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa 39 4.3.1 Nhiệt độ 39 4.3.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu 40 4.3.3 Lượng enzym xúc tác 42 4.3.4 Thời gian phản ứng 44 4.4 Kết luận kiến nghị 46 4.4.1 Kết luận 46 4.4.2 Kiến nghị 46 SVTH: Võ Thị Tú Nhi vii Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số ứng dụng lipase Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn 25 Bảng 4.1 Chỉ số axit số xà phòng dầu 33 Bảng 4.2 Hàm lượng protein enzym Callera Trans LJP30070 34 SVTH: Võ Thị Tú Nhi viii Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Mơ hình enzym lipase Hình 2.2 Phản ứng thủy phân triglyxerit lipase Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp ester lipase Hình 2.4 Cơ chế xúc tác enzym lipase phản ứng transester hóa 15 Hình 3.1 Sắc ký mỏng mỡ cá sắc ký mỏng metyl este 32 Hình 4.1 Đường chuẩn Albumin 34 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt tính lipase 35 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase 36 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt theo thời gian lipase 37 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng metanol etanol đến hoạt tính enzym lipase 38 Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng 39 Hình 4.7 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este nhiệt độ khác 40 Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ mol metanol/dầu đến hiệu suất chuyển hóa metyl este 41 Hình 4.9 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este tỉ lệ mol metanol/dầu khác 41 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng lượng enzym đến hiệu suất chuyển hóa 42 metyl este 42 Hình 4.11 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este lượng enzym khác 43 Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa metyl este 44 Hình 13 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este thời gian phản ứng khác .44 SVTH: Võ Thị Tú Nhi ix Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm Hình 4.11 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este lượng enzym khác Căn vào hình 4.10 4.11 nhận thấy hiệu suất chuyển hóa với lượng enzym 1% (8,96%) 2% (13,93%) thấp, phản ứng xảy không hiệu Khi tăng dần lượng enzym xúc tác 3÷5% hiệu suất phản ứng tăng đạt cực đại 3% (39,42%) Hiệu suất phản ứng 4%(37,29%) 5% (38,75%) cao thấp so với 3% Nguyên nhân giải thích hàm lượng nước sử dụng khơng đủ để hịa tan enzym, làm lượng enzym dung dịch cao tiếp xúc với metanol dễ bị hoạt tính, làm giảm hiệu suất phản ứng Nên chọn lượng enzym 3% lượng enzym tối ưu để thực phản ứng transeste hóa So với enzym Lipozyme TL100L[19], để đạt hiệu suất chuyển hóa khoảng 39% lượng enzym lipozyme cần dùng 6% enzym Callera Trans cần khoảng 3% Như việc sử dụng enzym Callera Trans có hiệu kinh tế cao Tuy nhiên cần tiến hành biện pháp nhằm cao hiệu suất phản ứng để hiệu sử dụng tốt Một số nghiên cứu gần cho biết tiến hành phản ứng với xúc tác enzym để hiệu suất phản ứng cao cần cố định enzym chất mang thích hợp Vì dạng tự bề mặt tiếp xúc enzym chất chưa tốt đồng thời dạng tự enzym dễ dàng bị hoạt tính tiếp xúc trực tiếp với metanol SVTH: Võ Thị Tú Nhi 43 Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm 4.3.4 Thời gian phản ứng Thời gian phản ứng yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Để hiệu suất phản ứng transeste hóa cao cần thực thời gian dài Tuy nhiên thời gian thí nghiệm có giới hạn nên đề tài tiến hành khảo sát phản ứng đến 36 Kết khảo sát ghi nhận hình 4.12 4.13 Hiệu suất chuyển hóa (%) 40 39 38 37 36 24 28 32 36 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa metyl este Hình 12 Sắc ký mỏng sản phẩm metyl este thời gian phản ứng khác Căn vào hình 4.12 4.13 nhận thấy kéo dài thời gian phản ứng hiệu suất phản ứng từ 24 (37,03%), 28 (38,09%), 32 (38,62%) đến 36 (39,42%) tăng SVTH: Võ Thị Tú Nhi 44 Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS Phan Thị Bích Trâm dần Ở thời gian 32 36 hiệu suất phản ứng cao sản phẩm thu nhận so với 24 28 Tuy nhiên, ta nhận thấy hiệu suất chuyển hóa phản ứng 36 (có thể xem điều kiện tối ưu) lại nhỏ so với hiệu suất phản ứng khảo sát 40oC (43,4%) Nguyên nhân hoạt tính enzym giảm so với lần khảo sát nhiệt độ 40oC Có thể q trình bảo quản enzym chưa tốt làm giảm hoạt tính enzym nên hiệu suất phản ứng giảm Ngồi ra, cịn cịn q trình làm tinh chế làm hao hụt sản phẩm Theo nghiên cứu Funda Yagiz cộng sử dụng enzym lipase tự từ chủng Thermomyces lanuginousus để thực phản ứng transeste hóa nguồn dầu ăn khoảng thời gian từ 22 đến 105 khối lượng metyl este tăng theo thời gian phản ứng Hiệu suất chuyển hóa thấp (