Thử nghiệm sử dụng phân trùn quế (Perionyx excavatus) làm môi trường cơ bản trong nuôi cấy In Vitro lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC & MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Hồng Thị Hằng Nguyễn Huỳnh Trâm Anh ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC & MƠI TRƯỜNG BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Hằng Nguyễn Huỳnh Trâm Anh Giáo viên hướng dẫn: ThS Đoàn Thị Tuyết Lê KS Đỗ Tấn Phát ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2017 i LỜI CẢM ƠN Đề tài tốt nghiệp thực Phịng thí nghiệm Khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Mơi trường, Trường Đại học Lạc Hồng hướng dẫn ThS Đoàn Thị Tuyết Lê KS Đỗ Tấn Phát, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng Trong suốt q trình thực để hồn thành báo cáo nghiên cứu này, lực cố gắng thân, chúng em nhận giúp đỡ lớn nhiều cá nhân tập thể Trước tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Đồn Thị Tuyết Lê thầy Đỗ Tấn Phát tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ chúng em suốt trình thực hoàn thành đề tài Cảm ơn thầy tạo điều kiện cho chúng em có hội học hỏi thêm kiến thức Chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Mơi Trường truyền thụ kiến thức cho chúng em suốt trình học tập tạo điều kiện cho chúng em thực đề tài Và cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè chia sẻ, giúp đỡ động viên chúng em vượt qua khó khăn học tập Chúng em xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu phân Trùn Quế 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Sự phân bố Trùn Quế 1.1.3 Đặc tính Trùn Quế 1.1.4 Lợi ích Trùn Quế 1.1.5 Lợi ích phân Trùn Quế 1.2 Giới thiệu lan Thạch hộc tía 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật học lan Thạch hộc tía 1.2.3 Sự phân bố lan Thạch hộc tía 1.2.4 Cơng dụng lan Thạch hộc tía 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh quan thực vật 1.3.1 Vai trò sinh lý nguyên tố khoáng thiết yếu 1.3.2 Các chất điều hòa sinh trưởng 12 1.3.3 Dịch hữu 13 1.3.4 Trạng thái môi trường 13 1.4 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Thời gian địa điểm thực 17 2.2 Vật liệu 17 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 17 iii 2.2.2 Hóa chất 17 2.2.3 Thiết bị dụng cụ nuôi cấy 18 2.2.4 Môi trường nuôi cấy 18 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Nội dung thí nghiệm 19 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 19 CHƯƠNG 3: 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng phân trùn quế lên thay đổi khối lượng tươi lan Thạch hộc tía 25 3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng BA, NAA lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 27 3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 29 3.4 tía Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng hàm lượng NAA lên rễ lan Thạch hộc 31 3.5 tía Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên rễ lan Thạch hộc 34 3.6 Xác định quy trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC VIẾT TẮT 2,4 – D : 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid BA : – benzyladenine CNSHTV : Công nghệ sinh học thực vật CNTBTV : Công nghệ tế bào thực vật IAA : β - indol acetic acid IBA : Indole – – butyric acid MS : Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA : α – naphthaleneacetic acid PLB : Thể giống protocorm (Protocorm – like body) SD : Sắn Dây TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam T.Q : Trùn Quế VW : Môi trường Vacxin and Went v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân tích hóa học phân trùn quế Bảng 2.1 Hàm lượng dinh dưỡng khoáng phân trùn quế Củ Chi 20 Bảng 2.2 Hàm lượng phân trùn quế sử dụng làm môi trường 21 Bảng 2.3 Nồng độ BA, NAA lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 22 Bảng 2.4 Hàm lượng sắn dây lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 23 Bảng 2.5 Hàm lượng sắn dây lên tạo rễ lan Thạch hộc tía 24 Bảng 3.1 Sự thay đổi hàm lượng đặc điểm protocorm môi trường bổ sung hàm lượng phân trùn quế khác 25 Bảng 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng NAA lên rễ lan Thạch hộc tía 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên rễ lan Thạch hộc tía 34 vi DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng hàm lượng phân trùn quế lên thay đổi khối lượng tươi protocorm lan Thạch hộc tía 26 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 28 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 31 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng NAA lên rễ lan Thạch hộc tía 32 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên rễ lan Thạch hộc tía 34 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Thiết bị dùng thí nghiệm 18 Hình 3.1 Ảnh hưởng hàm lượng phân trùn quế lên thay đổi khối lượng tươi protocorm lan Thạch hộc tía 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên nhân chồi lan Thạch hộc tía 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng NAA lên rễ lan Thạch hộc tía 33 Hình 3.5 Kết khảo sát hàm lượng sắn dây lên rễ lan Thạch hộc tía môi trường chứa phân trùn quế 35 LỜI MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật sử dụng nhằm sản xuất thành phần dược liệu quan trọng, để tạo hợp chất mong muốn người ta sử dụng loại môi trường nhân tạo nhằm bổ sung chất dinh dưỡng thiết yếu cho điều kiện sống khác giúp cho sinh trưởng phát triển, ngồi điều khiển q trình sống mà thu nhanh sản phẩm có giá trị khác Từ lâu đời người nông dân biết tạo phân bón cho từ phân thải động vật ủ hoai mục đem bón cho hoa màu giúp cho trồng xanh tốt tăng suất cải tạo đất sau mùa vụ Cây nuôi cấy mô giống ni điều kiện tự nhiên, sử dụng loại phân bón hữu giàu dinh dưỡng thay cho hợp chất dinh dưỡng vô để sinh trưởng phát triển điều kiện nhân tạo Phân trùn quế loại phân hữu thiên nhiên giàu dinh dưỡng người dân sử dụng làm phân bón cho trồng nhiều năm trở lại đây, phân trùn quế có chứa đầy đủ thành phần dinh dưỡng khoáng thiết yếu mà trồng sử dụng q trình sinh trưởng phát triển đem lại suất cao Chính lý mà đề tài “THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” thực nhằm thay hợp chất vô mà trước sử dụng rộng rãi nghiên cứu sản xuất với mong muốn giảm hàm lượng hóa chất mức tối đa q trình ni cấy thu trực tiếp hợp chất có giá trị dược liệu Mục tiêu: - Khảo sát nồng độ phân trùn quế phù hợp làm môi trường nuôi cấy in vitro lan Thạch hộc tía - Xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía sử dụng mơi trường phân trùn quế Mục đích: Hướng tới sử dụng nguồn dinh dưỡng hữu nuôi cấy in vitro tế bào huyền phù nhằm mục đích tách chiết hợp chất thứ cấp có giá trị dược liệu Contrast Sig - 10 Difference +/- Limits 0.266667 0.39111 - 20 * 0.6 0.39111 - 30 * 0.566667 0.39111 - 40 * 0.433333 0.39111 - 50 0.2 0.39111 10 - 20 0.333333 0.39111 10 - 30 0.3 0.39111 10 - 40 0.166667 0.39111 10 - 50 -0.0666667 0.39111 20 - 30 -0.0333333 0.39111 20 - 40 -0.166667 0.39111 -0.4 0.39111 30 - 40 -0.133333 0.39111 30 - 50 -0.366667 0.39111 40 - 50 -0.233333 0.39111 20 - 50 * * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for So choi Ham luong san Count Average Standard Coeff of deviation variation Minimum Maximum Range Stnd skewness day 10 20 8.0 2.0 25.0% 6.0 10.0 4.0 0.0 4.66667 1.1547 24.7436% 4.0 6.0 2.0 1.22474 3.33333 0.57735 17.3205% 3.0 4.0 1.0 1.22474 30 3.66667 1.1547 31.4918% 3.0 5.0 2.0 1.22474 40 3.33333 1.1547 34.641% 2.0 4.0 2.0 -1.22474 50 5.66667 2.08167 36.7353% 4.0 8.0 4.0 0.914531 Total 18 4.77778 2.10198 43.9948% 2.0 10.0 8.0 2.0521 Ham luong san day Stnd kurtosis 10 20 30 40 50 Total 0.833704 ANOVA Table for So choi by Ham luong san day Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 49.7778 9.95556 4.72 0.0130 Within groups 25.3333 12 2.11111 Total (Corr.) 75.1111 17 Table of Means for So choi by Ham luong san day with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Ham luong san day Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 8.0 0.83887 6.70759 9.29241 10 4.66667 0.83887 3.37426 5.95908 20 3.33333 0.83887 2.04092 4.62574 30 3.66667 0.83887 2.37426 4.95908 40 3.33333 0.83887 2.04092 4.62574 50 5.66667 0.83887 4.37426 6.95908 Total 18 4.77778 Multiple Range Tests for So choi by Ham luong san day Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 40 3.33333 X 20 3.33333 X 30 3.66667 X 10 4.66667 X 50 5.66667 XX 8.0 Homogeneous Groups X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 * 3.33333 2.58482 - 20 * 4.66667 2.58482 - 30 * 4.33333 2.58482 - 40 * 4.66667 2.58482 2.33333 2.58482 - 50 10 - 20 1.33333 2.58482 10 - 30 1.0 2.58482 10 - 40 1.33333 2.58482 10 - 50 -1.0 2.58482 20 - 30 -0.333333 2.58482 20 - 40 0.0 2.58482 20 - 50 -2.33333 2.58482 30 - 40 0.333333 2.58482 30 - 50 -2.0 2.58482 40 - 50 -2.33333 2.58482 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 4: Ảnh hưởng hàm lượng NAA lên rễ lan Thạch hộc tía Summary Statistics for Chieu dai re Nong Count Average NAA 0.2 0.5 4.0 0.7 3 Total 12 Standard Coeff of deviation variation 4.83333 0.629153 13.017% Minimum Maximum Range Stnd skewness 4.25 5.5 1.25 0.41407 0.661438 16.5359% 3.25 4.5 1.25 -1.03086 4.75 0.661438 13.925% 4.25 5.5 1.25 6.5 0.901388 13.8675% 5.5 7.25 1.75 5.02083 1.13547 22.6152% 3.25 7.25 4.0 1.03086 0.814636 0.985112 Nong NAA Stnd kurtosis 0.2 0.5 0.7 Total 0.153372 ANOVA Table for Chieu dai re by Nong NAA Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 10.0156 3.33854 Within groups 4.16667 0.520833 Total (Corr.) 14.1823 11 F-Ratio 6.41 P-Value 0.0160 Table of Means for Chieu dai re by Nong NAA with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Nong NAA Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 0.2 4.83333 0.416667 4.15392 5.51275 0.5 4.0 0.416667 3.32059 4.67941 0.7 4.75 0.416667 4.07059 5.42941 6.5 0.416667 5.82059 7.17941 Total 12 5.02083 Multiple Range Tests for Chieu dai re by Nong NAA Method: 95.0 percent LSD Nong NAA Count Mean Homogeneous Groups 0.5 4.0 X 0.7 4.75 X 0.2 4.83333 X 6.5 Contrast Sig X Difference +/- Limits 0.2 - 0.5 0.833333 1.35883 0.2 - 0.7 0.0833333 1.35883 -1.66667 1.35883 -0.75 1.35883 0.2 - * 0.5 - 0.7 0.5 - * -2.5 1.35883 0.7 - * -1.75 1.35883 * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for So re Nong Count Average NAA 0.2 0.5 0.7 4.0 Standard Coeff of deviation variation skewness 5.0 2.0 0.0 3.66667 0.57735 15.7459% 3.0 4.0 1.0 -1.22474 4.66667 0.57735 12.3718% 4.0 5.0 1.0 -1.22474 5.66667 0.57735 10.1885% 5.0 6.0 1.0 -1.22474 Total 12 3.0 6.0 3.0 0.0 1.0 Nong NAA Stnd kurtosis 0.2 0.5 0.7 Total -0.539972 25.0% Stnd 3.0 4.5 1.0 Minimum Maximum Range 22.2222% ANOVA Table for So re by Nong NAA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 7.0 2.33333 4.67 0.0362 Within groups 4.0 0.5 Total (Corr.) 11.0 11 Table of Means for So re by Nong NAA with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Nong NAA Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 0.2 4.0 0.408248 3.33431 4.66569 0.5 3.66667 0.408248 3.00098 4.33235 0.7 4.66667 0.408248 4.00098 5.33235 5.66667 0.408248 5.00098 6.33235 Total 12 4.5 Multiple Range Tests for So re by Nong NAA Method: 95.0 percent LSD Nong NAA Count 0.5 0.2 0.7 4.66667 XX 5.66667 X Contrast 3.66667 X 4.0 X Difference +/- Limits 0.2 - 0.5 0.333333 1.33138 0.2 - 0.7 -0.666667 1.33138 -1.66667 1.33138 -1.0 1.33138 -2.0 1.33138 -1.0 1.33138 0.2 - Sig Mean Homogeneous Groups * 0.5 - 0.7 0.5 - 0.7 - * * denotes a statistically significant difference Phụ lục 5: Ảnh hưởng hàm lượng sắn dây lên rễ lan Thạch hộc tía Summary Statistics for Chieu dai re Ham luong san Count Average Standard Coeff of deviation variation Minimum Maximum Range Stnd skewness day 7.33333 0.288675 3.93648% 7.0 7.5 0.5 -1.22474 10 3.91667 0.721688 18.4261% 3.5 4.75 1.25 1.22474 20 2.29129 28.6411% 6.0 10.5 4.5 0.6613 30 2.91667 0.520416 17.8429% 2.5 3.5 1.0 0.914531 40 5.66667 2.12623 37.5216% 3.5 7.75 4.25 -0.12452 50 7.83333 2.92973 37.4008% 4.5 10.0 5.5 -1.06618 Total 18 5.94444 2.51694 42.341% 2.5 10.5 8.0 0.514094 8.0 Ham luong san day Stnd kurtosis 10 20 30 40 50 Total -0.936321 ANOVA Table for Chieu dai re by Ham luong san day Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 69.2361 13.8472 4.32 0.0176 Within groups 38.4583 12 3.20486 Total (Corr.) 107.694 17 Table of Means for Chieu dai re by Ham luong san day with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Ham luong san day Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 7.33333 1.03358 5.74094 8.92572 10 3.91667 1.03358 2.32428 5.50906 20 8.0 1.03358 6.40761 9.59239 30 2.91667 1.03358 1.32428 4.50906 40 5.66667 1.03358 4.07428 7.25906 50 7.83333 1.03358 6.24094 9.42572 Total 18 5.94444 Multiple Range Tests for Chieu dai re by Ham luong san day Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 30 2.91667 X 10 3.91667 X 40 5.66667 XX 7.33333 X 50 7.83333 X 20 8.0 X Contrast Sig - 10 * Difference +/- Limits 3.41667 3.18478 -0.666667 3.18478 4.41667 3.18478 - 40 1.66667 3.18478 - 50 -0.5 3.18478 -4.08333 3.18478 10 - 30 1.0 3.18478 10 - 40 -1.75 3.18478 - 20 - 30 10 - 20 * * 10 - 50 * -3.91667 3.18478 20 - 30 * 5.08333 3.18478 20 - 40 2.33333 3.18478 20 - 50 0.166667 3.18478 30 - 40 -2.75 3.18478 -4.91667 3.18478 -2.16667 3.18478 30 - 50 40 - 50 * Homogeneous Groups * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for So re Ham luong san Count Average Standard Coeff of deviation variation Minimum Maximum Range Stnd skewness day 10 20 4.33333 1.1547 26.6469% 3.0 5.0 2.0 -1.22474 33.3333% 2.0 4.0 2.0 0.0 5.33333 1.52753 28.6411% 4.0 7.0 3.0 0.6613 30 2.66667 0.57735 21.6506% 2.0 3.0 1.0 -1.22474 40 5.66667 1.1547 20.3771% 5.0 7.0 2.0 1.22474 50 5.33333 0.57735 10.8253% 5.0 6.0 1.0 1.22474 Total 18 4.38889 1.50054 34.1896% 2.0 7.0 5.0 0.111407 3.0 1.0 Ham luong san day Stnd kurtosis 10 20 30 40 50 Total -0.540479 ANOVA Table for So re by Ham luong san day Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 24.9444 4.98889 4.49 0.0154 Within groups 13.3333 12 1.11111 Total (Corr.) 38.2778 17 Table of Means for So re by Ham luong san day with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Ham luong san day Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 4.33333 0.608581 3.39572 5.27095 10 3.0 0.608581 2.06239 3.93761 20 5.33333 0.608581 4.39572 6.27095 30 2.66667 0.608581 1.72905 3.60428 40 5.66667 0.608581 4.72905 6.60428 50 5.33333 0.608581 4.39572 6.27095 Total 18 4.38889 Multiple Range Tests for So re by Ham luong san day Method: 95.0 percent LSD Homogeneous Level Count Mean 30 2.66667 X 10 3.0 X 4.33333 XX 20 5.33333 X 50 5.33333 X 40 5.66667 X Contrast Sig Groups Difference +/- Limits - 10 1.33333 1.87523 - 20 -1.0 1.87523 - 30 1.66667 1.87523 - 40 -1.33333 1.87523 - 50 -1.0 1.87523 -2.33333 1.87523 0.333333 1.87523 10 - 20 * 10 - 30 10 - 40 * -2.66667 1.87523 10 - 50 * -2.33333 1.87523 20 - 30 * 2.66667 1.87523 20 - 40 -0.333333 1.87523 20 - 50 0.0 1.87523 30 - 40 * -3.0 1.87523 30 - 50 * -2.66667 1.87523 0.333333 1.87523 40 - 50 * denotes a statistically significant difference ... TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)? ?? thực nhằm thay hợp chất vô mà trước sử dụng rộng rãi nghiên... tươi protocorm lan Thạch hộc tía; a1 5%/l phân trùn quế, b1 10%/l phân trùn quế, c1 20%/l phân trùn quế, d1 30%/l phân trùn quế, e1 40%/l phân trùn quế, f1 50%/l phân trùn quế 3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh... trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía mơi trường phân trùn quế: Môi trường phân trùn quế thích hợp ni cấy in vitro lan Thạch hộc tía 5%/l T.Q + 20g/l glucose + 8.0g/l agar Mơi trường thích