Phương pháp xác định trình tự axit nucleic bằng phương pháp của sanger

Phương pháp xác định trình tự axit nucleic bằng phương pháp của sanger

Họ và tên: Đỗ Thị Minh Phương Lớp : K33C_Khoa SinhTrường : Đại học sư phạm Hà Nội----------------------------------------***--------------------------------------------- BÀI TIỂU LUẬN MÔN CÔNG NGHỆ GEN1. Nguyên lý: *) Phương pháp này còn có tên gọi khác là dideoxynucleotid do Frederick Sanger đề xuất năm 1977. *) Nguyên lý: + Dựa vào hoạt động của enzyme ADN polymerase và dideoxynucleotid (ddNTP) trong quá trình tổng hợp ADN. Dideoxy là các nucleotid mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C số 2 và 3 trên phân tử đường pentose. + Khi ADN polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại.Cụ thể là: Enzyme ADN polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodiester ở chuỗi polynucleotid đang hình thành với các nucleotid kế tiếp), khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các đoạn ADN chênh lệch nhau 1 nucleotid. Ví dụ : . Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp ADN thì quá trình tổng hợp chỗi polipeptid sẽ dừng lại ở vị trí C. . Nếu thêm ddGTP vào hỗn hợp thì khi gặp ddGTP chuỗi polynucleotit sẽ dừng lại ở vị trí G + Điện di các đoạn ADN này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêng biệt (ddATP, ddCTP, ddTTP) sẽ được 4 bản điện di khác nhau. Các băng ADN xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP. Dựa vào đó để đọc trình tự ADN.2. Các bước tiến h ành: - Cắt ADN bằng enzyme cắt giới hạn, tách các đoạn ADN đã cắt thành sợi đơn và nhân dòng (clothing) chúng (lượng ADN > µg) bằng vectơ mạch đơn: phage M13 để tạo đủ ADN làm nguyên liệu nghiên cứu. - Bổ sung mồi có đánh dấu phóng xạ P32, Taq polymerase, bổ sung đủ các loại dNTPcho vào dung dịch đệm thích hợp để thực hiện phản ứng tổng hợp ADN, sau đó chia làm 4 lô. - Bổ sung mỗi lô 1 loại ddNTP với tỷ lệ 1% (ống A thêm 1% ddATP, ống T thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP và ống G thêm 1% ddGTP). Với tỷ lệ này thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được gắn ngẫu nhiên. Trường hợp không đánh dấu bằng P32 ở mồi có thể đánh dấu P32, S35 ở ddNTP. - Chạy điện di để tách các đoạn ADN đã được tổng hợp trong mỗi lô phản ứng. Điện di riêng rẽ kết quả của 4 phản ứng trên cùng 1 bản gel. Tức là điện di các nhóm phản ứng bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện biến tính để được các băng của các đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau. - Thu kết quả bằng phương pháp tự ghi, chụp ảnh, làm phim phóng xạ tự ghi cho bản gel điện di và đọc trình tự của nucleotid trên điện di đồ lần lượt trên cả 4 mẫu từ cực âm của bản gel lên cực dương theo nguyên tắc: Đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa hơn so với điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ. Kết quả điện di phản ứng dideoxy với ddNTP -----------------------------------***----------------------------------- . các băng của các đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau. - Thu kết quả bằng phương pháp tự ghi, chụp ảnh, làm phim phóng xạ tự ghi cho. ADN xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP. Dựa vào đó để đọc trình tự ADN.2. Các bước tiến h ành: - Cắt ADN bằng