BÁO CÁO NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Người hướng dẫn PGS.TS Trần Quốc Dung Học viên thực Nguyễn Thị Hoài Phương MỞ ĐẦU LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NI CẤY TBĐV THUẬN LỢI VÀ KHĨ KHĂN CỦA NCTBĐV MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TBĐV PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY TBĐV KẾT LUẬN MỞ ĐẦU Tế bào động vật tách từ mơ nuôi cấy loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên thể, chúng sinh trưởng cách tăng số lượng kích thước tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật tạo hội để nghiên cứu tế bào ung thư, phân loại khối u ác tính, mơ hình thực nghiệm để khảo sát tác động hóa chất, xác định tương hợp mô cấy ghép nghiên u tế bào đặc biệt tương tác chúng Vấn đề ni cấy tế bào nói chung ni cấy tế bào động vật nói riêng ngày dư luận giới quan tâm hết mức nhiều phương diện khác nhau, lợi ích lẫn tác hại vơ to lớn mà người ta chưa lường hết Nhằm bổ sung cho kiến thức kỹ thuật nuôi cấy tế bào xem xét thành tựu mà kỹ thuật đem lại LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY TBĐV Năm Tác giả Sự kiện 1885 Roux Duy trì tế bào phôi gà môi trường nuôi cấy nước muối 1897 Loeb Chứng minh sống tế bào phân lập từ máu mô liên kết huyết huyết tương 1907 Harrisone Năm 1907, nuôi cấy tế bào thân kinh phôi ếch dịch bạch huyết kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop) 1911 Lewis and Lewwis Phương tiện lỏng bao gồm nước biển, huyết thanh, chiết xuất phôi, muối pepton 1916 Rous and Jones Protein enzyme trypsin cho tế bào ni cấy kết dính 1923 Carrel and Baker Bình T thiết kế đặc biệt nuôi cấy tế bào 1948 Earle Các nguyên bào sợi tạo từ tế bào đơn 1949 Enders Vi rút bệnh bại liệt lớn lên tế bào phôi người nuôi cấy 1952 Gey Dòng tế bào liên tục từ ung thư cổ tử cung người gọi tế bào hela (helen lane) 1955 Eagle Yêu cầu chất dinh dưỡng 1975 Kohlar and Milstein Tế bào lai có khả giải phóng kháng thể đơn dịng III THUẬN LỢI VÀ KHĨ KHĂN CỦA NCTBĐV IV MƠI TRƯỜNG NI CẤY TBĐV Môi trường nuôi cấy giúp tế bào tồn tăng số lượng qua lần phân chia 4.1 VAI TRỊ CỦA MƠI TRƯỜNG • Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết (nước, axit amin, vitamin, khoáng chất, glucose, dung dịch đệm carbohydrate, huyết ) cho tế bào ổn định phát triển 4.2 MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THƯỜNG DÙNG MÔI TRƯỜNG Basal medium Eagle (BME) Dulbecco’s (DMEM) Modified ỨNG DỤNG Nuôi cấy tế bào với huyết Eagle’s media Nuôi cấy tế bào nhiễm vius, phát triển với huyết thanh, tăng trưởng nồng độ cao Ham’s F12 nutrient mixture (F12) Nuôi cấy tế bào CHO, mật độ thấp, protein huyết thấp F12 – DMEM (1:1) Nuôi cấy kiểu tế bào, phát triển có khơng có huyết RPMI 1640 Nuôi cấy tế bào leukemia người tế bào khác Neurobasal medium Nuôi tế bào thần kinh CNS 4.3 THÀNH PHẦN CỦA MƠI TRƯỜNG • Muối vơ Tạo, cân áp suất Điều hịa điện màng nhờ ion Ca2+ K+ • Hệ đệm Điều hịa pH mơi trường ni cấy • Cacbonhydrate Sử dụng nhiều glucose galactose Giúp phát triển nhiều kiểu tế bào Sự khác trypsin ấm trypsin lạnh Trypsin ấm Trypsin lạnh - Thời gian ngăn - Cho suất cao nhờ cải thiện sống tế bào sau nuôi cấy - Năng suất thấp 24 - Địi hỏi phải ly tâm - Khơng cần thiết khuấy ly tâm sau ngâm - Ủ 4oC, thực qua đêm - Đối tượng quan phôi thai Tách phương pháp khác NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP Mảnh mô gắn liền huyết tương bạch huyết trộn lẫn với huyết khác nguồn gốc dịch chiết từ phôi đặt lên lamen lõm Nguyên sinh chất đông lại giữ mô chỗ mảnh mơ nghiên cứu kính hiểm vi thích hợp Dịch chiết phơi huyết với nguyên sinh chất cung cấp chất dinh dưỡng nhân tố sinh trưởng kích thích phân tán tế bào từ mảnh mô Mô Cắt nhỏ 0,5 -1mm dao mổ Chuyển mảnh mô vào bình ni cấy pipet Ủ qua đêm lớp mỏng môi trường nuôi cấy Sau 24 -48h cho thêm vào mơi trường vào đến mức bình thường Sau tuần thấy sựu di cư tỏa tròn tb từ mảnh mô nuôi cấy Khuấy trộn lên xuống để lắng -3 lần Nuôi cấy thứ cấp • Ni cấy thứ cấp tiến hành sau tế bào tạo dịng từ ni cấy sơ cấp, chứa kiểu tế bào đơn, tăng sinh lên tục nhiều hệ • Tế bào động vật sau tách khỏi mơ chuyển vào bình ni cấy (bình Roux) ủ 36,5oC 24h thay môi trường tiếp tục ủ Kỹ thuật nuôi cấy tế bào khơng huyết Mục đích • Tạo thích nghi tế bào với mơi trường khơng huyết khơng bổ sung hormone • Sử dụng huyết làm giảm hay loại bỏ hoàn tồn lớp hormone khơng cần thiết • Bổ sung thường xuyên vào môi trường không huyết nhân tố tăng trưởng, bám dính vào nhân tố phù hợp khác Môi trường huyết Môi trường không huyết Cung cấp hormone nhân tố tăng trưởng cần Bổ sung hormone, nhân tố tăng trưởng thiết cho chức TB Cung cấp nhân tố bám dính (VD: fibronectin, Phủ đĩa với nhân tố bám dính hay vitronectin…) polylysine Hoạt động hệ đệm pH Sử dụng hệ đệm hữu Gần, bất hoạt hay tách chất độc VD: Sử dụng nước tinh sạch, chuẩn bị môi trường hợp chất hữu gắn kim loại… tươi, bổ sung albumin Chứa protein bám làm ổn định và/hay giúp Bổ sung protein bám transferring vận chuyển hormone, chất dinh dưỡng eruloplasm… vào TB Cung cấp chất dinh dưỡng Chứa chất ức chế protease Sử dụng môi trường phức tạp Sử dụng chất ức chế trypsin cầy chuyền thêm chất ức chế protease thích hợp Chứa nhân tố biệt hóa Bổ sung hay khơng điều hịa phát triển TB biệt hóa Chứa nhân tố gây lão hóa TB Khơng có tác dụng lên già yếu TB, TB chuột bình thường phát triển liên tục Thích hợp cho phát triển nhiều kiểu TB kể Có thể chọn lọc kiểu TB quan tâm TB fibroblast VI ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY TBĐV Trong sản xuất hợp chất sinh học Trong y học công nghiệp Sử dụng tế bào nuôi cấy để phân tích NST xác định rối loạn di truyền sau trẻ (sàng lọc trước sinh) Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy: Nuôi cấy tế bào sừng môi trường không huyết phương pháp hiệu quả, tốn so với nhiều phương pháp điều trị bỏng Bệnh nhân bỏng có thêm hội điều trị kỹ thuật tiếp tục nghiên cứu, ứng dụng rộng vào thực tế (Ảnh:Hồng Hải) KẾT LUẬN Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đời hoàn thiện muộn lĩnh vực khác công nghệ sinh học nói chung cơng nghệ tế bào nói riêng Điều bắt nguồn từ lý tính tồn tế bào động vật khó biểu tế bào trưởng thành, biểu rõ tế bào gốc phôi Mặc dù đời muộn kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mở nhiều hướng ứng dụng quan trọng đời sống người: Nhân nguồn gen quý hiếm, tạo động vật chuyển gen phục vụ chăn ni, thử nghiệm loại hóa chất trị bệnh trước đưa vào sử dụng, sản xuất loại vaccine đặc biệt, giúp người nhiều vấn đề điều trị bệnh nan y, thay quan, phận thể bị tổn thương chí tạo người hồn chỉnh phương pháp nhân vơ tính Tuy nhiên, vấn đề gặp phải nhiều trở ngại đặc biệt đạo đức sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Quốc Dung (chủ biên), Quyên Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thủy, giáo trình cơng nghệ tế bào động vật, NXB Đại học Huế Nguyễn Hồng Lộc (2006), giáo trình cơng nghệ tế bào, NXB Đại học Huế Rajeev Nema, Sarita Khare (2012), An animal cell culture: Advance technology for modern research, Advances in Bioscience and Biotechnology, p.p 219-226 Kiran N.Birje, M.Sc.II, Basic Techniques of mammalia cell culture, XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN THẦY VÀ ANH CHỊ ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE! ... ni cấy Khuấy trộn lên xuống để lắng -3 lần Nuôi cấy thứ cấp • Ni cấy thứ cấp tiến hành sau tế bào tạo dịng từ ni cấy sơ cấp, chứa kiểu tế bào đơn, tăng sinh lên tục nhiều hệ • Tế bào động vật. .. trypsin cho tế bào ni cấy kết dính 1923 Carrel and Baker Bình T thiết kế đặc biệt nuôi cấy tế bào 1948 Earle Các nguyên bào sợi tạo từ tế bào đơn 1949 Enders Vi rút bệnh bại liệt lớn lên tế bào phôi... PHƯƠNG PHÁP NI CẤY NI CẤY SƠ CẤP Là việc ni cấy tế bào đơn tách từ mảnh mô Trong q trình ni, tế bào phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào NUÔI CẤY MẢNH MƠ SƠ CẤP Là việc ni cấy mảnh mơ in vitro