(NB) Giáo trình Vi sinh vật thực phẩm cung cấp cho người học các kiến thức: Hình thái, cấu tạo và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật; Sự phân giải của hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của Vi sinh vật và ứng dụng trong công nghiệp; Một số vi sinh vật thường gặp; Vi sinh vật trong bảo quản và chế biến thịt, cá, tôm, mực, động vật nhuyễn thể;...
ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU TRƯỜNG CAO ĐẲNG KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TÀI LIỆU MƠ ĐUN/MƠN HỌC VI SINH THỰC PHẨM (Lưu hành nội bộ) Bà Rịa – Vũng Tàu, năm 2018 PHẦN I – LÝ THUYẾT Bài 1: Hình thái, cấu tạo và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật Hình thái, cấu tạo của vi sinh vật Vi sinh vật là những sinh vật vơ cùng nhỏ bé mà mắt thường khơng thể nhìn thấy được mà phải quan sát bằng kính hiển vi Vi sinh vật gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam; nấm men, nấm mốc, tảo, ngun sinh động vật 1.1 Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Vi khuẩn (bacteria) là nhóm vi sinh vật có nhiều hình dạng, có nhân ngun thủy và sinh sản bằng cách phân đơi Các nhóm vi khuẩn Kích thước Cầu khuẩn Đường kính 0,5 – 1 micromet Trực khuẩn 0,51 x 14 micromet Xoắn khuẩn (0,53)x(540) µm Hình dạng Hình trịn, ovan, Gồm 6 nhóm: Đơn cầu khuẩn: Micrococcus Song cầu khuẩn Diplococcus Tứ cầu khuẩn: Tetracoccus Bát cầu khuẩn: Sarcina Tụ cầu khuẩn: Staphylococcus Liên cầu khuẩn: Streptococcus Hình que Gồm 5 nhóm: Bacillus: Gram (+), sinh bào tử Bacterium: Gram (), khơng sinh bào tử, thường có chu mao Pseudomonas: Gram (), khơng sinh bào tử, có 1 tiêm mao Corynebacterium: Gram (+), khơng sinh bào tử, có hình dạng thay đổi tùy loại Clostridium: Gram (+), sinh bào tử hình thoi hoặc hình dùi trống Là vi khuẩn có từ hai vịng xoắn trở lên, Gram (+) Phẩy khuẩn (0,53)x(510) µm Là vi khuẩn có hình dấu phẩy, dưới 2 vịng xoắn Cấu tạo của vi khuẩn: Gồm màng nhầy (màng tế bào) có vai trị duy trì áp suất thẩm thấu, khống chế sự vận chuyển, trao đổi ra vào của các chất dinh dưỡng và các sản phẩm trao đổi chất, sinh tổng hợp các chất, tiến hành phosphoryl hóa và phosphoryl quang hợp, Tế bào chất gồm tồn bộ phần nằm trong màng tế bào, là vùng dịch thể dạng keo khi tế bào non và có cấu trúc phức tạp khi tế bào già. Gồm cơ chất tương bào chứa enzim, các cơ quan con như mesosome, ribosome, khơng bào, hạt sắc tố, chất dự trữ Chất nhân Bào tử Tiên mao và nhung mao Hình 1: Cấu tạo của vi khuẩn 1.2 Hình thái, cấu tạo của nấm men Hình dạng:hình cầu, hình trứng, hình oval, Cấu tạo: gồm màng tế bào, tế bào chất: lưới nội chất, nhân, ribosome, ty thể, lysosome, golgi Hình 2: Hình dạng và cấu tạo của nấm men 1.3 Hình thái, cấu tạo của nấm mốc Hình sợi Sinh sản bằng bào tử, có các dạng: bào tử đính, bào nử nang, Hình 3: Hình thái của nấm mốc 2. Ảnh hưởng của yếu tố lý học đối với sự sinh trưởng , phát triển của vi sinh vật và ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm 2.1Ảnh hưởng của tác nhân vật lý Độ ẩm Hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến nước và tỷ lệ nước trong tế bào của chúng rất cao. Nấm men 7382%, nấm mốc 84 90%, vi khuẩn 7585%. Vì vậy thiếu nước tế bào có thể bị chết do hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào. Sự đề kháng của vi sinh vật với trạng thái khơ phụ thuộc vào: +Nguồn gốc vi sinh vật: vi sinh vật trong khơng khí chịu khơ tốt hơn vi sinh vật trong đất, nước. +Loại hình vi sinh vật: sự đề kháng với trạngthái khơ của nhóm xạ khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc. +Trạng thái tế bào:tế bào già, tế bào có nha bào đề kháng đè kháng tốt hơn tế bào khơ, tế bào khơng có nha bào. Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi khơ hoặc sấy khơ, ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loại sản phẩm (hoa quả khơ, cỏ khơ, ruốc thịt khơ, ). Nhiệt độ Hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các q trình sống của tế bào. Tế bào thu được nhiệt độ chủ yếu từ mơi trường bên ngồi, một phần cũng do cơ thể thải ra, do kết quả của hoạt động trao đổi chất. Như đã nói trên, hoạt động của vi sinh vật bị giới hạn trong mơi trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Vùng này của nước nằm từ 20 đến khoảng 1000 gọi là vùng sinh động học. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hơ hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể cịn là hậu quả của bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất (nói chung các acid nucleic ít mẫn cảm với nhiệt độ so với các enzyme) Nhiệt độ thấp: (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt các chất vận chuyển các chất hịa tan qua màng tế bào chất, do thay đổi cấu hình khơng gian của permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho q trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng. Vi khuẩn thường chịu đựng được nhiệt độ thấp. Ở nhiệt độ dưới điểm băng hoặc thấp hơn chúng khơng thể hiện hoạt động trao đổi chất rõ rệt. Nhiệt độ thấp có thể coi là yếu tố chế khuẩn nếu làm lạnh q nhanh. Trong trường hợp làm lạnh dần dần xuống dưới điểm băng, cấu trúc tế bào bị tổn hại do các tinh thể băng được tạo thành nhưng kích thước nhỏ, do tế bào khơng bị phân hủy. Nếu làm lạnh trong chân khơng, các tinh thể băng sẽ thăng hoa, đó là phương pháp đơng khơ vi sinh vật Nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao trên 65oC sẽ gây tác hại cho vi sinh vật và ở nhiệt độ 100oC hoặc hơn vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt gần hết trong một thời gian nhất định. Đó là do nhiệt độ cao đã làm biến tính protein tế bào, enzyme bất hoạt, mang tế bào bị phá hủy và có thể tế bào bị đốt cháy hồn tồn. Tác dụng của nhiệt độ cao đối với vi sinh vật cịn có quan hệ với các nhân tố khác như thời gian tác động, sức chịu nhiệt của vi sinh vật , sức chịu nhiệt phụ thuộc vào bản chất tế bào đó là tính di truyền, tuổi và có hay khơng có nha bào và sau cùng là sự tồn tại của chúng trong mơi trường có độ pH, thẩm áp và hợp chất hữu cơ khác nhau. Đây chính là cơ sở của việc khử trùng nhiêt độ cao có hiệu quả. Giới hạn giữa nhiệt độ cực tiểu và nhiệt độ cực đại là vùng nhiệt sinh trưởng của vi sinh vật. Giới hạn này rất khác nhau giữa các lồi vi khuẩn: tương đối rộng ở các vi khuẩn hoại sinh nhưng rất hẹp ở các vi khuẩn gây bệnh. Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt có thể chia vi khuẩn thành một số nhóm. + Vi khuẩn ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ dưới 20oC thường gặp trong nước biển, các hồ sâu và suối nước lạnh, chẳng hạn vi khuẩn phát quang, vi khuẩn sắt, hoạt tính trao đổi chất ở các vi khuẩn này thấp. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, nhiều vi khuẩn ưa lạnh dễ dàng thích ứng với nhiệt độ cao hơn. + Vi khuẩn ưa ấm: chiếm đa số, cần nhiệt độ trong khoảng 20 400C. Ngồi các dạng hoại sinh ta cịn gặp các dạng ký sinh gây bệnh cho người và động vật, chúng sinh trưởng tốt nhất ở 37 oC (tương ứng với nhiệt độ cơ thể người và động vật). + Vi khuẩn ưa nóng: giới hạn nhiệt độ sinh trưởng là 3070oC, thích hợp 5560oC gồm các vi sinh vật sinh trưởng trong đất, phân rác, suối nước nóng. Các vi khuẩn ưa nóng gồm chủ yếu là các xạ khuẩn, các vi khuẩn sinh bào tử. Thường gặp chúng trong suối nước nống, trong phân ủ. Các giới hạn nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại được trình bày trong bảng sau. Các lồi Bacillus sống trong đất, thường có nhiệt độ sinh trưởng khá rộng (15 – 40 oC). Vi khuẩn E. coli có nhiệt độ sinh trưởng 10 47,5oC. Vi khuẩn gây bệnh lậu gonococcus phát triển ở nhiệt độ 36 – 40oC. Năm 1983 J. A. Baross đã phát hiện có một lồi vi khuẩn ưa nhiệt, sinh trưởng thích hợp ở 25 – 30oC. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu và áp lực thủy tĩnh cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào vi khuẩn Màng tế bào vi khuẩn là màng bán thấm và việc điều chỉnh thẩm áp qua các hệ thống permease đều có liên quan đến màng này. Trong mơi trường ưu trương tế bào mất khả năng hút nước và các chất hịa tan, tế bào chịu trạng thái khơ sinh lý, bị co ngun sinh chất và có thể chết nếu kéo dài. Trong thực tế người ta áp dụng hiện tượng này để bảo quản cá bằng muối, muối dưa, bảo quản trái cây. Ngược lại khi đưa vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm nhập vào tế bào, áp lực bên trong tế bào tăng lên. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn trong mơi trường chứa ít hơn 20% muối. Nồng độ muối cao hơn có hại cho tế bào, nhưng cũng có loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong mơi trường chứa 30% muối, ta gọi chúng là vi khuẩn ưa muối, nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm này. Chúng có thể phát triển tốt trong mơi trường có nồng độ đường cao gọi là vi khuẩn ưa đường. Sóng siêu âm Sóng âm thanh đặc biệt là trong vùng siêu âm có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn Với tần số 8.8008.900Hz xử lý trong 4060 phút sẽ giảm 99% vi khuẩn. Các tế bào sinh dưỡng bị chết nhanh chóng, tế bào non mẫn cảm hơn nhiều so với tế bào già. Mẫn cảm nhất là tác dụng của sóng siêu âm lên các tế bào hình sợi, ít mẫn cảm nhất là các tế bào hình cầu. Nhưng sóng siêu âm hầu như khơng có tác dụng với các bào tử và các tế bào vi khuẩn kháng acid. Do tác dụng của siêu âm mà độ nhớt của mơi trường tăng lên, xuất hiện các chất nâng cao sức căng bề mặt và trong ngun sinh chất hình thành bọt khí nhỏ. Kết quả là tế bào bị hủy hoại. Hiện nay người ta ứng dụng siêu âm để thu nhận các chế phẩm vô bào hoặc để tách các enzyme nội bào, phân lập một số thành phần của tế bào, riboxom, thành tế bào và màng tế bào chất. Sức căng bề mặt Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể, vi khuẩn chịu ảnh hưởng của sức căng bề mặt của mơi trường. Đa số các mơi trường dịch thể dùng trong phịng thí nghiệm có sức căng bề mặt trong khoảng 5,7 0,63 mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ của sức căng bề mặt có thể làm ngừng sinh trưởng và làm chết tế bào. Khi sức căng bề mặt thấp, các thành phần tế bào bị tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ thành tế bào bị tổn thương. Các chất nâng cao sức căng bề mặt, hầu hết là các muối vơ cơ, các chất làm giảm sức căng bề mặt hầu hết là các acid béo, anchol, các chất này được gọi là các chất có hoạt tính bề mặt. Tác dụng của chúng thể hiện trong việc làm thay đổi các đặc tính của bề mặt tế bào vi khuẩn, trước hết là nâng cao tính thấm của tế bào. Trong thực tế người ta ứng dụng hiện tượng này trong ni cấy vi khuẩn kháng acid. Khác với các vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng acid, có bề mặt kỵ nước và giảm sức căng bề mặt của mơi trường kích thích sinh trưởng của chúng. Sức căng bề mặt cịn ngăn cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khỏi cạnh tranh sinh trưởng. Tia bức xạ Ánh sáng có thể gây ra những biến đổi hóa học và tổn thương sinh học, nếu tế bào hấp thu. Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng hay tùy thuộc vào chiều dài bước sóng ánh sáng. Các tia bức xạ gây nên những biến đổi hóa học của các nguyên tử và phân tử có chiều dài sóng khoảng 10000 A0 . Thuộc loại sau: ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia Gamma và tia vũ trụ, các tia sáng này có frnăng lượng rất lớn. Khi được vật chất hấp phụ chúng có thể làm bắn ra các electron từ vật chất đó. Vì vậy các tia này được gọi là tia bức xạ ion hóa Những bức xạ với chiều dài bước sóng lớn hơn có năng lượng q nhỏ, khơng đủ gây nên những biến đổi hóa học và tác dụng biểu hiện chủ yếu là nhiệt như tia hồng ngoại. Ánh sáng mặt trời: Là nguồn tia sáng chiếu tự nhiên và có tác dụng phá hủy tế bào vi khuẩn (ngoại lệ vi khuẩn quang hợp sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn năng lượng). Tác dụng này bị yếu đi nếu vi khuẩn chứa sắc tố hay vỏ nhầy. Ánh sáng mặt trời cũng có thể gián tiếp tác động lên tế bào làm biến đổi mơi trường. Chẳng hạn, các tụ cầu khuẩn Staphylococcus khơng sinh trưởng được trong mơi trường thạch bị chiếu tia sáng mặt trời vài giờ. Ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời lên tế bào vi khuẩn được tăng cường khi xử lý tế bào bằng một số thuốc nhuộm (metylen, ). Người ta gọi hiện tượng này là có tác dụng quang động học ánh sáng. Tia tử ngoại (tia cực tím UV) : So với các bức xạ ion thì tia tử ngoại có năng lượng nhỏ hơn. Khi bị vật chất hấp phụ, tia tử ngoại khơng gây nên hiện tượng ion hóa nhưng kích thích các phân tử, nghĩa là chuyển điện tử đến một mức cao hơn. Tác dụng mạnh nhất của tia tử ngoại là là vùng có chiều dài bước sóng khoảng 254260 nm nghĩa là vùng hấp thụ cực đại của acid nucleic và nucleoprotein. Dưới ảnh hưởng của tia tử ngoại, vi khuẩn bị chết hoặc bị đột biến theo loại vi khuẩn và liều lượng chiếu, bào tử của mốc có sức đề kháng cao. Điều đáng chú ý là những hư hại do tia tử ngoại gây ra cho tế bào phần nào có tính đảo ngược. Nếu sau khi chiếu tia tử ngoại, ta lại cho vi khuẩn chịu tác dụng của ánh sáng ban ngày, thì nhiều vi khuẩn có khả năng sống sót và tiếp tục phân chia Tia sáng mặt trời tuy có chứa một phần tia tử ngoại nhưng phần lớn những tia này bị khí quyển (mây, ozon, ) giữ lại. Vì vậy ánh nắng có tác dụng diệt khuẩn nhỏ hơn so với tia tử ngoại dùng trong phịng thí nghiệm. Do lực xun sâu của tia tử ngoại kém, chỉ xun qua lớp nước trong và thủy tinh mỏng nên thường được sử dụng trong khử trùng khơng khí, như buồng cấy vi sinh vật, phịng mổ 2.1.1 Ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm Dưới tác động của các yếu tố lý học, tế bào vi sinh vật bị ức chế một phần hoặc hồn tồn. Trên cơ sở đó, người ta áp dụng các phương pháp vật lý để bảo quản thực phẩm khỏi tác hại của vi sinh vật Thanh trùng, tiệt trùng sản phẩm: sử dụng nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật Khử trùng dụng cụ, buồng cấy bằng tia UV Bảo quản rau quả bằng cách ướp đường, ướp muối… 2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm 2.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố hóa học đối với sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Độ pH Độ pH có quan hệ rất lớn đối với sự sinh trưởng của VSV Giới hạn pH của sự sinh trưởng: là khoảng pH từ cực tiểu đến cực đại mà vsv có khả năng sinh trưởng. Trong khoảng pH này có pH thích hợp nhất, ở đó vsv có sự sinh trưởng và phát triển cao nhất. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến q trình trao đổi chất của tế bào vì pH cần cho hoạt động của nhiều enzyme, nồng độ ion H cịn ảnh hưởng trực tiếp đến độ hịa tan của một số muối khống như K, Na, Mg… do đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vsv Đa số vsv thích ứng ở pH từ 4,5 đến 9,0, tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà thích ứng khác Ví dụ: Rhizobium , pH thích hợp ở 6,5 đến 7,5 Saccharomyces, pH thích hợp ở 4,0 đến 6,0 Điện thế oxi hóa khử Trong hoạt động sống của vsv chịu ảnh hưởng rất lớn của điện thế oxi hóa khử trong mơi trường, thường thì vsv yếm khí chịu được ở rH2 thấp từ 012 vơn, đối với vsv hảo khí từ 1030 vơn. Tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà chịu được rH2 khác nhau 2.2.1.1 Các chất sát trùng, ức chế, diệt khuẩn Chất sát trùng là chỉ những chất có thể giết chết vsv gây bệnh hoặc khơng gây bệnh nhưng khơng giết chết được nha bào Chất ức chế là những chất chỉ làm ngừng q trình sinh trưởng, phát triển, vsv khơng bị giết chết mà ở trạng thái tiềm tàng Chất diệt khuẩn là chỉ các chất có thể giết chết tồn bộ vi khuẩn kể cả nha bào. Ví dụ: HgCl, AgNO3, CuSO4… Một chất có thể vừa là chất sát trùng, ức chế hay diệt khuẩn… tùy thuộc vào nồng độ, thời gian, loại vsv tác động và các yếu tố khác 2.2.1.2 Các chất hóa trị liệu Các chất hóa trị liệu gồm các chất có thể tổng hợp được bằng phương pháp hóa học, có tác dụng độc đối với vsv nhưng hầu như khơng gây hại cho động vật Các chất hóa trị liệu có hoạt tính cao nên đã tranh chỗ trong phản ứng sinh tổng hợp của tế bào, vì vậy đã hình thành nên các hợp chất khơng cần thiết cho cơ thể làm cho các phản ứng sinh hóa của tế bào bị kìm hãm, gây ức chế q trình sinh trưởng, phát triển của tế bào vi khuẩn. Ví dụ: sunfolamit Các chất kháng sinh Kháng sinh là chất do vsv sinh ra, ngay ở nồng độ thấp, kháng sinh cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vsv một cách đặc hiệu, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ở ngưỡng phân tử Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên vsv: + Ức chế sinh tổng hợp hoặc phá hủy vách tế bào, nên vi khuẩn sinh ra khơng có vách tế bào, do đó bị tiêu diệt + Gây rối loạn chức năng màng ngun sinh, đặc biệt là chức năng thẩm thấu, chọn lọc, do đó làm ngừng q trình trao đổi chất + Làm ngừng q trình tổng hợp protein + Gây ức chế sự tổng hợp axit nucleic, ngăn cản sự sao chép AND, ngăn cản ính tổng hợp ARN polimeraza, tức là ức chế sinh tổng hợp những chất cần thiết cho tế bào Tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà khả năng chịu được các loại thuốc và liều lượng kháng sinh khác nhau 2.2.2 Ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm Căn cứ vào tác động của các chất hóa học lên tế bào vi sinh vật mà có các cách bảo quản chế biến thực phẩm khác nhau Ứng dụng giảm pH để bảo quản rau quả trong các sản phẩm rau quả dầm giấm, rau quả muối chua Sử dụng một số chất bảo quản có bản chất là chất ức chế vi sinh vật… Bài 2: Sự phân giải của hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của Vi sinh vật và ứng dụng trong cơng nghiệp 1 Sự phân giải của các hợp chất hữu cơ có Nitơ Nitrogen cycle chu trình nitơ, sự tuần hồn của nitơ giữa các sinh vật và mơi trường. Nitơ dạng khí trong khí quyển chỉ được sử dụng trực tiếp bởi một số vi sinh vật (clostridium) và một số tảo lam (nostoc). Chúng biến đổi nitơ thành dạng amon, nitrit và nitrat, những chất này sau đó được giải phóng vào đất bởi các q trình bài tiết và phân giải. Có một cách khác để niư tơ khí quyền được cố định là nhờ các tia lửa điện của sấm sét. Phần lớn thực vật chỉ có thể sử dụng nitơ dưới dạng nitrat, trừ một số thực vật cộng sinh với vi khuẩn nốt s ần Rhizobium hoặc các sinh vật khác tạo nốt sẵn của rễ. Khi thực vật và động vật chất thì nitơ hữu cơ trong chúng biến đổi trở lại thành dạng nitrat trong q trình gọi là nitrat hố. Một phần nitrat này được thực vật hấp thụ, cịn một phần bị mất do q trình khử nitrit và q tình rửa trơi. Sự tăng cường sử dụng phân bón trong nơng nghiệp (nitrat amon) hiện nay trở thành một nhân tố quan trọng trong chu trình nitơ x.nitrogen fixation 1.1 Vai trị của vi sinh vật trong vịng tuần hồn Nitơ Trong các mơi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân tử ở dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động, thực vật và con người. Trong cơ thể sinh vật, nitơ tồn tại chủ yếu dưới dạng các hợp chất đạm hữu cơ như protein, axit amin. Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại ở trong đất. Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các axit amin. Các axit amin lại được một nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amơn hố. Q trình này cịn gọi là sự khống hố chất hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khống. Dạng NH4+ sẽ được chuyển hố thành dạng NO3 nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hố. Các hợp chất nitrat lại được chuyển hố thành dạng nitơ phân tử, q trình này gọi là sự phản nitrat hố được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn phản nitrat. Khí nitơ sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hố thành dạng nitơ hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ. Như vậy, vịng tuần hồn nitơ được khép kín. Trong hầu hết các khâu chuyển hố của vịng tuần hồn đều có sự tham gia của các nhóm vi sinh vật khác nhau. Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó ngừng lại, tồn bộ sự chuyển hố của vịng tuần hồn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng 1.2 Q trình amơn hố Trong thiên nhiên tồn tại nhiều dạng hợp chất nitơ hữu cơ như protein, axit amin, axit nucleic, urê Các hợp chất này đi vào đất từ nguồn xác động, thực vật, các loại phân chuồng, phân xanh, rác rưởi. Thực vật khơng thể đồng hố được dạng nitơ hữu cơ phức tạp như trên, nó chỉ có thể sử dụng được sau q trình amơn hố. Qua q trình amơn hố, các dạng nitơ hữu cơ được chuyển hố thành dạng NH4+ hoặc NH3 1.3 Sự amơn hố urê Urê có trong thành phần nước tiểu của người và động vật, chiếm khoảng 2,2% nước tiểu. Urê chứa tới 46,6% nitơ, vì thế nó là một nguồn dinh dưỡng đạm tốt với cây trồng. Tuy nhiên, thực vật khơng thể đồng hố trực tiếp Urê mà phải qua q trình amơn hố. Q trình amiin hố Urê chia ra làm 2 giai đoạn, giai đoạn đầu dưới tác dụng của enzym ureaza tiết ra bởi các vi sinh vật Urê sẽ bị thuỷ phân tạo thành muối cacbonat amoni, giai đoạn 2 cacbonat amoni chuyển hố thành NH3, CO2 và H2O: Trong nước tiểu cịn có axit uric, tồn tại trong đất một thời gian axit uric sẽ bị phân giải thành urê và axit tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH3 Nhóm vi sinh vật phân giải Urê và axit uric cịn có khả năng amơn hố cyanamid canxi là một loại phân bón hố học. Chất này sau khi đi vào đất cũng bị chuyển hố thành Urê rồi sau đó qua q trình amơn hố được chuyển thành NH3: Nhiều lồi vi khuẩn có khả năng amơn hố Urê, chúng đều tiết ra enzym ureaza. Trong đó có một số lồi có hoạt tính phân giải cao Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris Một số lồi vi khuẩn có khả năng amơn hố Urê. Đa số vi sinh vật phân giải Urê thuộc nhóm háo khí hoặc kỵ khí khơng bắt buộc, chúng ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm. Bởi vậy khi sử dụng Urê làm phân bón người ta thường kết hợp với bón vơi hoặc tro, đồng thời xới xáo làm thống đất 1.4 Sự amơn hố protein Khác với lên men, cơ chất của q trình thối rữa là protein. Protein là một trong những thành phần quan trọng của xác động vật, thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng 15,0 17,6% nitơ (tính theo chất khơ). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể các sinh vật sống trên mặt đất là vào khoảng 700 tỉ tấn thì tổng lượng nitơ ít ra cũng tới 10 25 tỉ tấn. Trong lớp đất sâu 30 cm bao quanh Trái Đất người ta cịn thấy thường xun có khoảng 3 7,5 tỉ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nơng nghiệp và đối với vịng tuần hồn vật chất trong tự nhiên. Người ta cịn gọi là q trình phân giải này là q trình amơn hố Muốn phân giải protein, cũng giống như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzym phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hố protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polipeptit và các oligopeptit). Các chất này hoặc tiếp xúc được phân huỷ thành axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hố thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng trong q trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác Những vi sinh vật khơng có khả năng sinh ra các enzym phân giải protein ngoại bào rõ ràng là khơng có khả năng đồng hố được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thuỷ phân của protein (polipeptit, oligopeptit, axit amin) + Một số axit amin bị deamin hố bởi VSV nhờ enzym deaminaza, 1 số phản ứng, một trong những sản phẩm cuối cùng là amơn, ví dụ: Đối với các axit amin có vịng như Triptophan, khi phân giải sẽ tạo thành các hợp chất có mùi thối như Indo vàScaton. Khi phân giải các axit amin chứa S như Metionin, Xistin, vi sinh vật giải phóng ra H2S, chất này độc đối với cây trồng. Một số hợp chất amin sinh ra trong q trình amơn hố có tác dụng độc đối với người và động vật. Ví dụ như histamin, acmatin đó chính là ngun nhân bị nhiễm độc khi ăn thịt cá thiu thối hoặc thịt hộp để q lâu (ơ nhiễm thực phẩm) Tỷ lệ C : N trong đất rất quan trọng đối với nhóm vi sinh vật phân huỷ protein. Nếu như tỷ lệ này q cao, trong đất q ít đạm vi sinh vật sẽ tranh chấp thức ăn đạm đối với cây trồng, chúng phân huỷ được bao nhiêu là hấp thụ hết vào tế bào Nếu tỷ lệ C : N q thấp, đạm dư thừa, q trình phâ huỷ sẽ chậm lại, cây trồng khơng có đạm khống mà hấp thụ. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã rút ra tỷ lệ C:N bằng 20 là thích hợp nhất cho q trình amơn hố protein, có lợi nhất đối với cây trồng Nhiều vi sinh vật có khả năng amơn hố protein. Trong nhóm vi khuẩn có Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, B. subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes Xạ khuẩn có Streptomyces rimosus, Stretomyces griseus Vi nấm có Aspergillus oryzae, A flavour, A. niger, Penicilium camemberti v.v 10 hơi, khí hydro, khí cacbonic, rượu etylic. Các vi khuẩn này tạo ra các este và axit làm cho bánh mì có mùi thơm đặc biệt Một số vi sinh vật khác: trong bột cịn có thể có một số nấm men tạo màng lẫn vào như Candida, Torulopsis. Những nấm men này có sẵn trong bột hoặc lẫn vào nấm men ướt hoặc men ép. Những nấm men này có áp lực nở thấp, khi lên men chúng tạo ra sản phẩm phụ làm cho bánh mì có vị cay. Đây là những nấm men tạp làm giảm chất lượng bột nhào và bánh mì Đơi khi cịn thấy Escherichia aerogenes, một dạng của trực khuẩn đường ruột phát triển trong bột nhào, ngồi ra cịn có thể gặp trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khơ. Các vi khuẩn có trong bột nhào làm xấu bánh mì, các bào tử của chúng trong ruột bánh khơng bị chết khi nướng, gặp điều kiện thuận lợi chúng nẩy mầm và phát triển làm hỏng bánh mì b. Các chất bổ sung trong bột nhào và ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của vi sinh vật Trong khi làm bột nhào người ta thường thêm một số nhất như muối, đường, chất béo. Những chất này đếu có ảnh hưởng đến sự hoạt động của nấm men bánh mì và vi khuẩn lactis Muối ăn: nồng độ muối ăn trên 0,8% kiềm hãm hoạt lực tạo khí của nấm men, làm giảm hoạt lực tạo axit của vi khuẩn lactic Đường: khi thêm trên 5% đường sẽ làm tăng hoạt lực của nấm men và vi khuẩn lactic, khí tao thành nhiều hơn, nhưng khi thêm đường trên 10% thì hoạt lực của nấm men và vi khuẩn lactic bị giảm. Khi thêm trên 20% đường thì hoạt lực của nấm men và vi khuẩn bị ức chế hồn tồn Chất béo: lượng chất béo cho vào bột nhào dưới 5% khơng ảnh hưởng đến hoạt lực của nấn men. Khi nồng độ cao hơn 10% thì khả năng tạo khí của nấm men và hoạt lực của vi khuẩn bị giảm. Điều này có thể giải thích như sau khi các chất béo bao phủ tế bào nấm men và vi khuẩn lactic làm trở ngại cho q trình trao đổi chất c. Hệ vi sinh vật bánh mì Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, men bánh mì và tạp nhiễm. Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tao ra rượu và khí cacbonic làm nở bột nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào từ chịu nhiệt cịn tồn tại Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngồi tới 180÷200oC, các vi sinh vật ngồi vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng ở giữa khơng q 95÷98oC. các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết nhưng bào tử của chúng vẫn cịn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi các bào tử của trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khơ phát triển làm hỏng bánh mì Trong q trình vận chuyển và bảo quản cịn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an tồn d. Hư hỏng bánh do vi sinh vật Do bánh mì thành phẩm cịn một số bào tử của các trực khuẩn khơng bị tiêu diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong q trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là ngun nhân gây hư hỏng bánh mì Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus : bệnh này do trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khơ gây ra. Bệnh này cịn gọi là hỏng nhớt bánh mì. Trong bột mì có chất lượng kém có nhiễm các bào tử của hai loại trực khuẩn này. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu. Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5÷5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát triển 26 Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này khơng nguy hiểm đối với người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngồi do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và xếp q chặt Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong bột mì từ những hạt lúa mì những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm này chiụ nhiệt cao và khơng bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên bánh mì khơng thấy dấu hiệu hư rỏ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu 27 Bài 6: Vi sinh vật trong bảo quản và chế biến rau quả 1. Đặc điểm của rau quả Là thành phần thức ăn khơng thể thiếu trong khẩu phần ăn, cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, hợp chất hữu cơ, đường, tinh bột, vitamin và muối khống. Sản phẩm tươi hay qua chế biến có nhiều dạng: lá, thân, củ, quả, hạt. Mỗi loại rau có đặc điểm sinh lý khác nhau. Nước chiếm phần lớn trong rau quả từ 85 ÷ 90%. Trong dịch tế bào có đường, axit hữu cơ, vitamin, khống chất sử dụng dễ dàng. pH trong quả nhỏ hơn 4,5, rau từ 4,5÷5 Rau quả sau khi hái vẫn cịn sống, cịn q trình trao đổi chất và hơ hấp sẽ tác động xấu đến q trình bảo quản như héo, mềm , dập làm cho vi sinh vật dễ xâm nhập Quả và rau tươi có khả năng miễn dịch trong thời gian nhất định do mơ và thành tế bào cịn ngun lớp bảo vệ. Có tinh dầu, tanin ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật 2. Hệ vi sinh vật của rau quả a. Nguồn lây nhiễm Do hạt giống hay q trình chăm bón phân bón hữu cơ hay do vi sinh vật trong đất, trong khơng khí, nước. Do q trình thu hái, vận chuyển và chế biến vi sinh vật xâm nhiễm vào rau quả Thành phần và số lượng vi sinh vật nhiễm vào rau quả phụ thuộc vào từng loại, điều kiện địa lý và thu hái, tình trạng rau quả b. Hệ vi sinh vật của rau qủa Thường gặp vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Hoa quả tươi lành lặn bên trong coi như vơ trùng Các hệ vi sinh vật xâm nhiễm vào rau quả làm hư hỏng, hư hỏng quả do nấm, hư hỏng rau do vi khuẩn. Hệ vi sinh vật rau quả gồm hai loại: Vi sinh vật hoại sinh: liên quan đến điều kiện trồng, thu hoạch rau qủa. Gồm vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm: vi khuẩn lactis, vi khuẩn axetic, vi khuẩn gây thối rữa. Ngồi ra cịn có nấm men, nấm mốc dạng bào tử. Vi sinh vật hoại sinh từ 10 3 ÷ 106 tế bào trên 1 cm2 khơng gây hư hại rau quả lành lặn trong điều kiện thu hái, vận chuyển tốt Vi sinh vật gây bệnh: xuất hiện trên rau quả trong điều kiện nhất định như: chăm bón, thu hái, vận chuyển, giống…Đây là vi sinh vật khơng tìm thấy trực tiếp trên rau quả nhưng làm giảm sức đề kháng rau quả và tấn cơng cây mẹ tạo điều kiện cho vi sinh vật khác tấn cơng rau quả sau thu hoạch c. Sự hư hỏng của rau quả Nấm mốc là ngun nhân đầu tiên gây hư hỏng rau quả, do pH của rau quả nhỏ hơn 4,5 tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển nhanh cho đến khi pH tăng lên vi khuẩn khác sẽ tấn cơng rau quả. Nấm mốc tồn tại dạng sợi và phát triển nhanh do rau quả có nhiều cenlulose, hemicenlulose, pectin. Vi sinh vật thường bắt đầu từ rau quả bị dập nát sau đó lan sang rau quả khác và làm hư hỏng rau quả. Nếu độ dập nát rau quả càng cao thì vi sinh vật xâm nhiễm và phát triển càng nhiều và phong phú. Chúng tiêu thụ nhiều chất khơ và dịch tế bào do nấm mốc xâm hại phá huỷ thành tế bào chảy ra Sự hư hỏng do vi khuẩn: Do nấm men phá vỡ thành tế bào làm cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển mạnh làm pH giảm nên vi khuẩn gây thối chậm phát triển. Cuối cùng làm cho rau quả có vị chua và giảm chất lượng cảm quan d. Bảo quản rau qủa + Bảo quản tươi Sư hư hỏng thường do một số quả q chín vì vậy cần loại những quả đó ra. Rau quả khơng thể bảo quản ở nhiệt độ thường mà phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh và cho thêm hố chất bảo quản. 28 Các hố chất bảo quản thường dùng là: khí SO2, axit benzoic, muối benzoat… những chất này tốt cho bảo quản và khơng độc hại Ngồi ra cịn dùng một số hợp chất hữu cơ như: nizin, axit sorbic, muối sorbat… Nizin là chất sinh ra từ kháng sinh hoặc độc tố của vi khuẩn lactic vì vậy chúng tiêu diệt được vi khuẩn gây thối và khơng độc hại đối với con người + Sấy khơ Người ta thường sấy khơ đến độ ẩm khoảng 15 đến 20% đối với rau và 8 đến 10% đối với quả Ngày nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm sấy khơ từ rau quả + Chế biến Rau quả qua chế biến thành nhiều sản phẩm phù hợp khẩu vị, tạo ra sự phong phú đa dạng thức ăn và giúp bảo quản lâu hơn. Phương pháp thường dùng là ngâm đường để chiết suất dịch bào sau đó đem ra sử dụng. Tuy nhiên trong dịch bào thường có vi khuẩn lên men nên sản phẩm thường có mùi rượu + Muối chua Phương pháp này giúp ta giữ rau quả lâu hơn, khoảng 1 đến 2 tháng. Bản chất của q trình này là q trình lên men lactic + Đóng hộp Phương pháp này bảo quản rau quả được khá lâu, khoảng 6 tháng. Trước hết tiêt trùng rau quả bằng nhiệt độ cao, sau đó đóng hộp và thanh trùng 3. Hệ vi sinh vật một số sản phẩm rau quả a. Đồ hộp Bị lây nhiểm do các ngun nhân sau đây: Do ngun liệu: q trình rửa, ngâm, muối, thanh trùng sẽ diệt được khoảng 90% lượng vi sinh vật, tuy nhiên cịn 10% vi sinh vật sẽ phát triển nhanh và gây hư hại đồ hộp Do khâu chuẩn bị đóng hộp: lượng vi sinh vật trong khơng khí do ruồi giấm mang đến, do vi sinh vật nhiễm từ cơng nhân Ngun nhân gây nhiễn đặc biệt quan trọng đối với đồ hộp gia nhiệt khơng cao do đựng trong các dụng cụ bằng nhựa Ngồi ra cịn có ngun nhân do tiệt trùng hoặc thanh trùng khơng kỹ vì vậy lượng vi sinh vật cịn lại sẽ ảnh hưởng đến q trình bảo quản. Hay do yếu tố chủ quan của con người, ở những giai đoạn trước đã tiệt trùng kỹ nên những giai đoạn sau khơng thanh trùng vì vậy vi sinh vật mới xâm nhập sẽ phát triển và gây hư hại cho sản phẩm đồ hộp Nhóm vi sinh vật đặc trưng là những vi khuẩn ưa nóng, chịu axit và có bào tử: Baccilus sporogenes, Baccilus subtilus, Clostridium botulinum… Sau khi đóng hộp vẫn cịn hiện tượng hư hỏng là do vi khuẩn lactisc, vi khuẩn axetic dùng đường có trong quả lên men tạo thành rượu, axit axetic, axit lactic tạo thành mùi rượu hay vị chua. Hay do vi khuẩn thuỷ phân thành khí H2S làm đồ hộp phồng lên. Ngồi ra vỏ đồ hộp thường làm bằng vỏ thiếc vì vậy trong mơi trường axit hộp sẽ bị gỉ làm ảnh hưởng đến chất lượng rau quả b. Muối chua Khi muối chua pH giảm nên mơi trường có tính axit cao vì vậy sẽ ức chế các vi khuẩn gây thối rữa. Tuy nhiên trong mơi trường axit nấm mốc và nấm men vẫn phát triển và gây hư hỏng sản phẩm. Khi nấm mốc phát triển làm giảm độ pH môi trường tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối rữa phát triển và làm hư hỏng sản phẩm muối chua 29 PHẦN II – THỰC HÀNH Bài thực hành số 1: Tiệt trùng môi trường làm việc và dụng cụ 1.Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc Khi làm việc với vi sinh vật, để tránh bị lây nhiễm những vi sinh vật không mong muốn ở môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo cho mơi trường và bề mặt làm việc được vơ khuẩn Làm sạch mơi trường làm việc Tiệt trùng bề mặt làm việc bằng cồn 70% hoặc propanol 70%. Lưu ý: Khi lau cồn, lưu ý khơng được bật đèn cồn vì có thể gây hỏa hoạn Tủ cấy vơ trùng: tiệt trùng khơng khí bằng đèn UV, quạt lọc gió 2.Tiệt trùng dụng cụ làm việc Có 2 phương pháp để tiệt trùng dụng cụ làm việc + Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khơ: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 150 160oC trong 2,5 đến 3 giờ Dùng cho dụng cụ thủy tinh khơng chứa mơi trường ni cấy (có thể có nắp bơng), pipet, hộp petri, que trang, phễu thủy tinh, đũa thủy tinh, … + Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Hấp trong nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 121oC trong 2030 phút Dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, dụng cụ có nắp bằng cao su, giấy nhơm, màng; dụng cụ bằng nhựa chịu nhiệt; ống bóp cao su; ống nghiệm hay bình thủy tinh có chứa mơi trường ni cấy; đầu pipetman; ống nghiệm chứa nước để pha lỗng… 2.1 Dụng cụ thủy tinh hoặc kim loại Trước khi tiệt trùng dụng cụ thủy tinh cần được làm sạch và sấy khơ Ống nghiệm thủy tinh: cần được đậy bằng nút bơng khơng thấm nước, sau đó gói kín phần đầu ống nghiệm có nút bơng bằng giấy Bình tam giác: cần được đậy kín bằng nút bơng và gói phần có nút bơng bằng giấy Hộp petri cần được gói kín trong giấy Pipet thủy tinh cần được gắn một nút bơng nhỏ ở phần cuối, sau đó bọc kín trong giấy Que trang, đũa thủy tinh nếu cần cũng phải được gói kín vào giấy 2.2 Dụng cụ bằng nhựa chịu nhiệt Ống nghiệm có nắp nhựa chịu nhiệt, nắp bằng cao su hay đầu micropipette được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm 2.3 Mơi trường ni cấy vi sinh vật Mơi trường ni cấy vi sinh vật thường được tiệt trùng trong nồi hấp tiệt trùng autoclave ở 121oC trong 2030 phút Đối với những thành phần của mơi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao thì cần dùng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng 30 Bài thực hành số 2: Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh vật 1.Ngun lý Mơi trường ni cấy cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Mơi trường ni cấy cần được tiệt trùng trước khi sử dụng ni cấy vi sinh vật Phân loại mơi trường ni cấy: Theo cấu trúc: + Mơi trường lỏng: thường để nhân giống, lên men hay nghiên cứu đặc tính của vi sinh vật; mơi trường lỏng khơng chứa các chất làm đặc như agar, gelatin… + Mơi trường rắn (đặc): có thêm một hàm lượng nhỏ agar hoặc gelatin vào mơi trường lỏng để làm đặc mơi trường. Mơi trường rắn thường dùng để phân lập vi sinh vật, quan sát hình thái khuẩn lạc,… + Mơi trường bán rắn: có cấu trúc dạng dẻo, hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn với mơi trường rắn. Sử dụng để xác định khả năng chuyển động của một số vi khuẩn Theo thành phần: + Mơi trường tổng hợp: có thành phần hóa học xác định được một cách chính xác + Mơi trường tự nhiên:gồm những chất chưa xác định rõ thành phần, khơng có cơng thức hóa học rõ rang. VD: peptone, cao thịt, cao nấm men,… + Mơi trường hịa tan chuẩn bị sẵn: hịa tan vào nước một hàm lượng nhất định là có đủ tất cả các thành phần dinh dưỡng cần thiết 2. Phương pháp chuẩn bị mơi trường ni cấy 2.1 Chuẩn bị mơi trường lỏng Cân chính xác từng thành phần dinh dưỡng của mơi trường ni cấy theo hàm lượng đã định Hịa tan từng thành phần trong một lượng nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau và làm đầy lên thể tích nhất định bằng nước Kiểm tra pH bằng máy đo pH hoặc quỳ tím, dùng NaOH hoặc HCl để điều chỉnh nếu pH khơng đúng với u cầu Phân phối mơi trường vào ống nghiệm hoặc bình ni cấy, đóng nắp bằng nút bơng khơng thấm nước Tiệt trùng Để nguội và bảo quản trong tủ lạnh 31 Hình 2. Các loại mơi trường ni cấy vi sinh vật 2.2 Chuẩn bị mơi trường rắn và bán rắn Nấu chảy agar trong thể tích nước dùng để pha mơi trường Cân và hịa tan các thành phần khác của mơi trường trong ½ lượng nước cịn lại Trộn lẫn và làm đầy lên thể tích cần thiết, sau đó phân phối ngay vào ống nghiệm hoặc bình ni cấy khi dung dịch cịn nóng. Nếu để nguội, agar sẽ đặc lại và khơng thể rót vào ống nghiệm được nữa Đóng nắp ống nghiệm và tiệt trùng giống với mơi trường lỏng Đối với thạch nghiêng: đặt nghiêng khi mơi trường cịn nóng cho tới khi nguội Bảo quản mơi trường đã đơng đặc trong tủ lạnh ở vị trí lật ngược Bài thực hành số 3: Quan sát tế bào vi sinh vật Quan sát tế bào vi khuẩn 1.1 Làm tiêu bản cố định Rửa sạch phiến kính bằng xà phịng và lau khơ Vẽ hai vịng trịn khơng dính nhau lên mặt dưới của phiến kính Nhỏ một giọt nước vơ khuẩn lên một vịng trịn Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau đó lấy một phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên que cấy Trộn đều vi sinh vật trên que cấy vào giọt nước và dàn mỏng giọt nước trên phiến kính Cố định vi sinh vật lên phiến kính bằng cách hơ phiến kính nhanh vài lần qua ngọn lửa đèn cồn. Chú ý khơng hơ phiến kính q sát đèn cồn sẽ làm biến dạng vi sinh vật Nhỏ vài giọt xanh methylene lên tiêu bản, để trong 1 phút Nghiêng phiến kính và rửa bằng nước cất cho đến khi hết màu thừa Để phiến kính khơ tự nhiên trong khơng khí hoặc thấm khơ phiến kính bằng giấy thấm Quan sát hình thái vi khuẩn dưới vật kính dầu Sau khi quan sát xong, lau sạch vật kính dầu 1.2 Làm tiêu bản giọt ép Nhỏ một giọt mơi trường lỏng có chứa vi khuẩn muốn quan sát lên phiến kính sạch Lấy lá kính đậy lên phiến kính sao cho khơng tạo thành bọt khí giữa lá kính và phiến kính Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu 32 Hình 3. Cấu tạo kính hiển vi Quan sát tế bào nấm men Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong cơng nghiệp, hầu hết nấm men là đơn bào, khơng chuyển động. Hình dạng của nấm men thường có hình cầu, hình trứng, hình bầu dục… kích thước 610 micromet 2.1Quan sát nấm men sống và chết Dựa trên nguyên tắc: Tế bào chết dễ bắt màu, thuốc nhuộm đi qua tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng tế bào sống Cho vài giọt canh trường nấm men Saccharomyces cerevisiae và một giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên phiến kính Nhẹ nhàng trộn đều, đậy lá kính lại để yên trong 23 phút Quan sát dưới kính hiển vi quang học Tế bào chết bắt màu xanh cịn tế bào sống khơng màu 2.2 Quan sát nấm men nảy chồi Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kính Trộn đều Đậy lá kính lại và đặt lên kính hiển vi để quan sát Tế bào nấm men được xem là đang nảy chồi khi có những tế bào con bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ Quan sát tế bào nấm sợi Nấm sợi có tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty. Sợi nấm có thể có hoặc khơng có vách ngăn Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên hộp petri Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm Lấy miếng băng dính ra và áp sát vào phiến kính Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi 33 Bài thực hành số 4: Xác định khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của vi sinh vật Xác định khả năng lên men lactic của vi khuẩn lactic Tiến hành: Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch, cắt khúc, để ráo Pha nước muối 3 3.5%, thêm đường Xếp vào lọ và ém chặt Lên men ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 23 ngày Xác định đặc trưng của quá trình + Làm tiêu bản giọt ép từ nước dưa cải chua để quan sát hình dạng, sự sắp xếp tế bào của vi khuẩn lên men lactic + Định lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ Cho vào ống nghiệm 10ml nước dưa, 20 ml nước cất, 12 giọt phenolphthalein Lắc thật kỹ để trộn đều các chất Khối lượng acid lactic (trong 10ml dịch lên men) được tính bằng: M = V NaOH 0.1N x 0.009 (g) (1 ml dung dịch NaOH tương đương với 0,009g acid lactic) 2. Xác định khả năng lên men rượu của nấm men 34 Làm mơi trường lên men từ nước ép trái cây : nho, dâu, dứa, mơ v.v hoặc từ nước mạch nha Điều chỉnh độ pH = 4 6 Thanh trùng dịch ép trái cây theo phương pháp Tyndal hoặc khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 0,75 atm trong 20 phút o Để mơi trường nguội tới 30 C thì cấy men giống vào với tỉ lệ 2 5% thể tích dịch lên men. Đậy nút bình lên men o Đặt bình có dịch lên men vào tủ ấm ở 28 30 C, sau 12 ngày lấy ra Xác định các đối tượng vi sinh vật tham gia: Làm tiêu bản giọt ép, giọt treo hay nhuộm đơn để thấy được hình dạng tế bào nấm men Yêu cầu : quan sát tiêu bản ở vật kính (x40) trên kính hiển vi. Chú ý nhận biết các dấu hiệu đặc trưng về hình thái của mỗi lồi Xác định chất lượng men giống trước khi cho lên men: Xác định tỉ lệ tế bào nảy chồi trong dịch men giống bằng phương pháp đếm số lượng tế bào nảy chồi trên khung đếm Goriaep Xác định tỉ lệ tế bào sống và chết bằng tiêu bản nhuộm sống nấm men (để phân biệt 2 loại tế bào này) Xác định số lượng tế bào/1ml dịch men giống bằng phương pháp đếm số lượng tế bào trên khung đêm Goriaep Xác định tốc độ q trình lên men thơng qua lượng CO tạo thành : 2 * Ngun tắc : Dựa vào phương trình tổng qt của q trình lên men : C H O → 12 6 2C H OH + CO + 27kcal 2 Lượng đường phân giải trong quá trình lên men càng nhiều thì lượng CO tạo ra càng lớn 2 Tốc độ q trình lên men chính là lượng CO bay ra từ 1 thể tích mơi trường nhất 2 định trong 1 khoảng thời gian xác định 3.Xác định khả năng phân giải protein của vi sinh vật 3.1 Thực hiện q trình amơn hố prơtit Cho vào bình tam giác có thể tích 100 150ml 3 5g thịt + 20 30ml nước cất + Một cục đất nhỏ đã nghiền ra để cung cấp nguồn vi sinh vật Đun nóng bình tam giác ở nhiệt độ 80 90 C để diệt các tế bào sinh dưỡng và giữ lại những tế bào mang bào tử Để bình vào tủ ấm ở nhiệt độ 27 28 C trong 7 ngày Kẹp một miếng giấy quỳ đỏ trên miệng ống nghiệm để xác nhận NH được giải phóng ra trong q trình phân giải prơtit 3.2 Xác định các đặc trưng của q trình 35 a. Xác định thành phần lồi vi sinh vật tham gia: Làm tiêu bản từ dịch phân giải prơtit sau 2 4 ngày Nhuộm Gram hay nhuộm đơn vết bơi Quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu (x 100) trên kính hiển vi b. Các phản ứng định tính một số sản phẩm chủ yếu của q trình phân giải prơtit * Ngun tắc: Dựa trên những phản ứng màu, phản ứng kết tủa đặc trưng của các sản phẩm trong q trình phân giải prơtit với các hố chất khác nhau để xác nhận sự có mặt của chúng trong các q trình này * Cách tiến hành: Xác định sự có mặt của prơtit trong q trình amơn hố prơtit bằng phản ứng màu: + Cho vào ống nghiệm: 5ml dung dịch lên men thối 1ml dung dịch NaOH 30% 0,5ml dung dịch CuSO 1% 4 + Đun nhẹ ống nghiệm cho tới sơi Kết quả: Dung dịch có màu xanh tím nếu trong đó có prơtit. Dung dịch có màu hơi đỏ nếu trong đó có peptơn 36 Bài thực hành số 5: Các kĩ thuật phân lập và ni cấy vi sinh vật Kĩ thuật phân lập vi sinh vật Trong tự nhiên, phần lớn vi sinh vật tồn tại lẫn với nhau trong một tập hợp bao gồm nhiều vi sinh vật khác nhau. Để có thể nghiên cứu tính chất hoặc ứng dụng của vi sinh vật, thường phải phân lập chúng ra thành những vi sinh vật riêng rẽ Các phương pháp dùng để phân lập vi sinh vật là phương pháp đổ đĩa, phương pháp dàn đều và phương pháp cấy ria 1.1 Phương pháp đồ đĩa Ngun lý: một lượng nhỏ vi sinh vật đã pha lỗng được trộn đều với mơi trường agar nóng chảy và được đổ vào hộp petri đã vơ khuẩn. Sau thời gian ni cấy thích hợp, vi sinh vật sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc sẽ chỉ bao gồm một loại vi sinh vật thuần chùng Nấu chảy 3 ống nghiệm có chứa 19 ml mơi trường dinh dưỡng đặc, đặt vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 4550 oC Hút 1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc kĩ trên vortex, ta có độ pha lỗng 1/20 Hút 1ml dung dịch ở độ pha lỗng 1/20 sang ống nghiệm thứ 2, lắc kĩ, ta có độ pha lỗng 1/400 Hút 1ml dung dịch ở độ pha lỗng 1/400 sang ống nghiệm thứ 3, lắc kĩ, ta có độ pha lỗng 1/8000 Đổ 3 ống nghiệm vào 3 hộp petri đã vơ khuẩn, để nguội và ni cấy ở vị trí lật ngược ở nhiệt độ thích hợp Sau thời gian ni cấy, tách riêng từng khuẩn lạc riêng rẽ 1.2 Phương pháp dàn đều Ngun lý: một lượng nhỏ vi sinh vật đã được pha lỗng trước được dàn đều lên trên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp Đổ mơi trường agar nóng chảy vào hộp petri vơ khuẩn và để cho đặc lại Hút 0,1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập ở các độ pha lỗng khác nhau bằng pipetman vào đĩa petri và dàn đều khắp bề mặt hộp bằng que trang vơ khuẩn Lật ngược hộp có chứa vi sinh vật, để vào tủ ấm ở 35oC trong 48 h Sau đó tách rời các khuẩn lạc mọc trên bề mặt mơi trường đặc 1.3 Phương pháp cấy ria Ngun lý: que cấy được sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập trên khắp bề mặt mơi trường đặc trong hộp petri. Sau mỗi lần cấy ria, vi sinh vật sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy vạch những đường song song ở một phần của hộp Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần khác của hộp Lặp lại bước trên Lật ngược hộp petri có chứa vi sinh vật vào tủ ấm ở 35oC trong 48h. Sau đó tách rời các khuẩn lạc mọc trên bề mặt mơi trường đặc Kĩ thuật ni cấy 37 Ni cấy trong mơi trường lỏng: Vi sinh vật có thể phát triển tốt trong một lớp mỏng mơi trường lỏng ( 10% thể tích bình tam giác) ở điều kiện ni cấy tĩnh. Với lớp chất lỏng dày hơn (30% thể tích) thì cần thêm khơng khí bằng cách lắc hay sục khí Ni cấy trong mơi trường đặc Ni cấy vi sinh vật trong ống thạch nghiêng hoặc thạch đĩa Ni cấy vi sinh vật vi hiếu khí Vi sinh vật vi hiếu khí là nhóm vi sinh vật phát triển tốt nhất trong mơi trường có hàm lượng khí CO2 lớn và hàm lượng khí O2 nhỏ hơn so với trong khí quyển. Để ni cấy nhóm vi sinh vật này người ta sử dụng bình kín có đốt nến để loại trừ O2 và tăng khí CO2 Ni cấy vi sinh vật kị khí Sử dụng mơi trường có tính khử, q trình ni cấy thực hiện trong tủ ni cấy kị khí, trong đó khơng khí được hút hết ra ngồi bằng bơm chân khơng, sau đó được thay bằng CO2 hoặc N2 38 Bài thực hành số 6: Kiểm tra vi sinh vật trong mẫu thực phẩm 1.Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một chỉ tiêu cơ bản của thực phẩm, qua đó người ta có thể đánh giá khái qt về tình trạng vệ sinh của thực phẩm cũng như dự đốn thời gian bảo quản của thực phẩm. Tùy thuộc vào loại thực phẩm mà giá trị tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép trong sản phẩm khác nhau, cao nhất là 5.10 4 khuẩn lạc/g sản phẩm 1.1 Ngun tắc Sử dụng mơi trường thạch tryptone glucose (cịn gọi là Plate Count Agar PCA) để ni cấy vi sinh vật trong mẫu thực phẩm trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30oC 35oC trong 4872 giờ 1.2 Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ cấy, bể điều nhiệt Dụng cụ: Ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri, que cấy gạt, pipet, cân, 1.3 Mơi trường Sử dụng mơi trường thạch tryptone glucose 1.4 Cách thực hiện Chuẩn bị mẫu Mẫu ở dạng rắn cần xay trong bình xay vơ khuẩn, sử dụng nước peptone hoặc nước cất để pha lỗng mẫu Cấy mẫu Mỗi mẫu cần được ni cấy ít nhất với ba độ pha lỗng khác nhau sử dụng hai hộp petri cho mỗi độ pha lỗng. Sử dụng phương pháp hộp đổ hoặc phương pháp cấy gạt để gieo cấy. Ni cấy Ni cấy ở nhiệt độ 30oC trong 4872 giờ. Sau thời gian ni cấy, đếm số khuẩn lạc rồi tính tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml mẫu 1.5 Cách tính kết quả Tiến hành đếm khuẩn lạc trên các hộp petri Chọn tất cả các hộp petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả Cơng thức tính: Trong đó: N là số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu C1, C2 là số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha lỗng đã chọn d là hệ số pha lỗng mẫu 39 40 ... giá trị dinh dưỡng của các loại? ?thực? ?phẩm? ?như tempeh, natto… được lên men từ đậu nành 2 ? ?Vi? ?sinh? ?vật? ?có hại 2.1 Gây hư hỏng? ?thực? ?phẩm: Hệ? ?vi? ?sinh? ?vật? ?thực? ?phẩm? ?được phát? ?sinh? ?từ nhiều nguồn khác nhau: Thực? ?phẩm? ?bị nhiễm? ?vi? ?sinh? ?vật? ?từ... nước muối làm cho các tế bào? ?vi? ?sinh? ?vật? ?bị co ngun? ?sinh. Ở trạng thái này q? ?trình? ?trao đổi chất của chúng khơng? ?thực? ?hiện được và hoạt động sống của tế bào? ?vi? ?sinh? ?vật? ?bị dừng lại, tế bào? ?vi? ?sinh? ?vật? ?bị chết hay chuyển sang dạng sống tiềm? ?sinh. .. 36 Bài? ?thực? ?hành số 5: Các kĩ? ?thuật? ?phân lập và ni cấy? ?vi? ?sinh? ?vật Kĩ? ?thuật? ?phân lập? ?vi? ?sinh? ?vật Trong tự nhiên, phần lớn? ?vi? ?sinh? ?vật? ?tồn tại lẫn với nhau trong một tập hợp bao gồm nhiều vi? ?sinh? ?vật? ?khác nhau. Để có thể nghiên cứu tính chất hoặc ứng dụng của? ?vi? ?sinh? ?vật,