Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngMỤC LỤCA. MỞ ĐẦU B. NỘI DUNG . 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp . 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens . 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus . 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) . 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) . 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học . 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) . 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen 4.1. Lợi ích . 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen . 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen 6.1. Chuyển gen kháng sâu . 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ . 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh . 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật . 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc . 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) . C. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Thủy Hồng1 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngA. MỞ ĐẦUMột trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau.Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống.Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế Thủy Hồng2 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngbào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau:- Tăng sản lượng- Giảm chi phí sản xuất- Tăng lợi nhuận nông nghiệp- Cải thiện môi trườngNhững cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như:- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột- Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây- Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng- Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầuTuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm:- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dạiThủy Hồng3 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh tháiNhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.Thủy Hồng4 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngB. NỘI DUNG1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển genKhi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen- Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome- Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vàoThủy Hồng5 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng- Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem).2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) . Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật. Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện genomic ADN)- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp- Biến nạp vào E. coli- Tách chiết ADN plasmid- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc- Tái sinh cây biến nạpThủy Hồng6 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác .)Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh.Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vậtCó hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens* Nguyên lý chungSử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định.Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sauThủy Hồng7 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngHình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo Thủy Hồng8 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngvệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciensCụ thể như sau:Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA và vùng Vir.T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải.Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.Thủy Hồng9Bộ gen của vi khuẩnTi plasmid Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngĐể thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng gắn gen cần biến nạp.* Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể.- Vector liên hợp (Cointegrated vector)Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng cho chuyển gen vào thực vật.- Vector nhị thể (Binary vector)Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù T-ADN nằm trên phân tử ADN khác.* Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc biệt là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống Thủy Hồng10 [...]... 23 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình 6 Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và đối chứng Hình 7 Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối chứng (PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng) 6.4 Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật Các nhà khoa học đã tìm cách giải trình tự các gen mã hóa cho protein động vật, thiết kế lại, sau đó chuyển các gen này vào thực vật, biến thực vật. .. ứng dụng kỹ thuật RNAi Đây là một trong hàng loạt ứng dụng của RNAi trong nghiên cứu y sinh và là công cụ rất hữu ích cho việc tìm hiểu và khám phá các chức năng bí ẩn của các gen trong thời đại nghiên cứu hậu genome (post- genomic era) Thủy Hồng 30 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng C KẾT LUẬN Công nghệ tạo cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và tạo ra hàng trăm giống cây trồng chuyển gen. .. có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào Thủy Hồng 11 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng làm vector chuyển gen là caulimovirus... gen vào cây trồng hiện nay không còn là vấn đề phải tranh cãi mà nó trở thành kỹ thuật thông dụng để tạo ra giống cây trồng mới, phục vụ trực tiếp cho trồng trọt Những mốc quan trọng trong sự phát triển kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là: Thủy Hồng 20 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển ADN ngoại lai vào cây nhờ Agrobacterium Năm 1983: Tạo marker chọn lọc như... cây chuyển gen phổ biến là: Mỹ 42,8 triệu ha; Acgentina 13,9 triệu ha; Canada 4,4 triệu ha; Braxin 3 triệu ha; Trung Quốc 2,8 triệu ha; Nam Phi 0,4 triệu ha Thủy Hồng 21 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Các cây chuyển gen chính là đậu tương (chiếm 61%), ngô (23%), bông (11%), đu đủ (21%) Các gen chính được chuyển là gen kháng thuốc trừ cỏ, gen kháng sâu 6 Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển. .. chuyển gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) còn là vấn đề tranh cãi, thậm chí còn gặp phải sự phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại Các sản phẩm chuyển gen phải được dán nhãn để những người Thủy Hồng 31 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng tiêu dùng lựa chọn Nhiều nước chưa cho phép nhập khẩu các sản phẩm chuyển gen cũng như cây trồng chuyển. .. sử dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó ghép nối với hệ gen của thực vật 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1 Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) Hình 3 Súng bắn gen * Nguyên lý Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực. .. độ pH thấp thì rất hạn chế Vì vậy, các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác Thủy Hồng 29 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình 11 Quy trình hình thành bông hồng xanh với sự hỗ trợ của kỹ thuật RNAi Nguồn hình từ CSIRO (http://www.csiro.au/files/files/p29z.pdf)... sử dụng các quy trình đánh giá tương tự để xét xem sự tương tác giữa cây chuyển gen và môi trường Bao gồm những thông tin về vau trò của gen được đưa vào, ảnh hưởng của nó đối với vây nhận gen, đồng thời cả những cây hỏi cụ thể về ảnh hưởng không mong muốn như: ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong môi trường đó Thủy Hồng 18 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Cây chuyển. .. protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen Nuôi cấy invitro để tái sinh cây Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài 3.2.5 Chuyển gen bằng phương pháp hóa học Thủy Hồng 15 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG) Khi . Thủy Hồng1 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngA. MỞ ĐẦUMột trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây,. Hồng4 Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngB. NỘI DUNG1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển genKhi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển