Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương sống đã được mô tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận. Nấm dược liệu ở Việt Nam có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dược liệu quý như Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)…6, 31, 32. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dược liệu (polysaccarit, polysaccaritprotein..) dùng để điều trị bệnh . Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dược liệu 11, chúng hầu hết là các glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con người 14, 16. Ngoài những hợp chất có khối lượng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lượng nhỏ như triterpenoit, flavonoit,…được phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã được ghi nhận có khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm 12. Nấm dược liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhưng chưa được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học 2, 3, 4, 6, 8, 9.Hợp chất thiên nhiên đang tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong chương trình tìm kiếm thuốc mới của ngành công nghiệp dược và những ngành nghiên cứu khác. Một lý do quan trọng trong việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên như nguồn của các hợp chất dẫn đường là phong phú và rất đa dạng cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ thiên nhiên. Hơn nữa, các hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được dùng như chất dẫn đường hoặc phân tử hiên đại (mẫu) trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng. Trong đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25%. Theo các nghiên cứu gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khoảng 80% dân số thế giới lựa chọn các bài thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ.Chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của các loài nấm dược liệu rất cần thiết, giúp cho chúng ta hiểu hơn về giá trị dược học cũng như kinh tế và tầm quan trọng của nguồn nấm dược liệu ở nước ta. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn đề tài Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất triterpenoit và steroit từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) ở Nghệ An nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện đại.
1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN VĂN A TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRITERPENOIT VÀ STEROIT TỪ QUẢ THỂ NẤM VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS) Ở NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Hóa học TP Vinh, năm 2019 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên quốc gia có đa dạng sinh học cao so với quốc gia khác giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao 3000 lồi động vật có xương sống mơ tả Số loài nấm lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 lồi có 2500 lồi nấm định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu với 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% ghi nhận Nấm dược liệu Việt Nam có khoảng 700 lồi có nhiều loài dược liệu quý Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)…[6, 31, 32] Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật cho thấy nấm lớn nguồn tài nguyên vơ tận ẩn chứa hợp chất có tác dụng dược liệu (polysaccarit, polysaccaritprotein ) dùng để điều trị bệnh Ở Việt Nam có 651 lồi thuộc 182 chi có chứa hợp chất polysaccarit có tác dụng dược liệu [11], chúng hầu hết glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, hợp chất có khả chống ung thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch thể người [14, 16] Ngồi hợp chất có khối lượng lớn, hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lượng nhỏ triterpenoit, flavonoit,…được phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất ghi nhận có khả kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm [12] Nấm dược liệu Việt Nam phong phú, nhiều loài thuốc quý y học cổ truyền, nguồn tài nguyên vô quý giá cho khoa học thực tiễn chưa nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chủ yếu nghiên cứu đa dạng sinh học [2, 3, 4, 6, 8, 9] Hợp chất thiên nhiên tiếp tục đóng vai trị quan trọng chương trình tìm kiếm thuốc ngành cơng nghiệp dược ngành nghiên cứu khác Một lý quan trọng việc sử dụng sản phẩm thiên nhiên nguồn hợp chất dẫn đường phong phú đa dạng cấu trúc hợp chất phân lập từ thiên nhiên Hơn nữa, hợp chất có hoạt tính sinh học tìm thấy từ thiên nhiên dùng trực tiếp y học, nhiều hợp chất khác dùng chất dẫn đường phân tử hiên đại (mẫu) lĩnh vực tổng hợp bán tổng hợp thuốc Ngày nay, hợp chất thiên nhiên dẫn xuất chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng Trong hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25% Theo nghiên cứu gần Tổ chức Y tế giới (WHO) khoảng 80% dân số giới lựa chọn thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ Chúng tơi nhận thấy việc nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học lồi nấm dược liệu cần thiết, giúp cho hiểu giá trị dược học kinh tế tầm quan trọng nguồn nấm dược liệu nước ta Chính mà chúng tơi chọn đề tài "Tách xác định cấu trúc số hợp chất triterpenoit steroit từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Nghệ An" nhằm nghiên cứu hợp chất thiên nhiên cách sử dụng kỹ thuật đại nhằm phân tích, phân lập xác định cấu trúc đại Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận văn thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) thu hái vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp chất từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất từ dịch chiết hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Chương TỔNG QUAN 1.1 Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn 1.1.1 Giới thiệu nấm lớn Trong hàng ngàn năm qua, nấm người biết đến, sử dụng nhóm sinh vật quan trọng phong phú lĩnh vực dược học, thực phẩm Hiện nay, giới nấm chủ yếu gồm bốn ngành rộng, Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, chi thuộc giới nấm tìm thấy đóng vai trị nguồn đa dạng sinh học rộng bao gồm mặt đất nước, góp phần đặc biệt quan trọng hình thành hệ sinh thái học hành tinh Số loài nấm lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 lồi có 2500 loài nấm định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu với 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% ghi nhận [7, 31, 32] Theo thống kê Trịnh Tam Kiệt, số loài nấm lớn Việt Nam khoảng 22.000 lồi khoảng 1.000 lồi nấm mục gỗ, 700 lồi có giá trị làm thuốc Từ xa xưa, người phương Đông biết dùng nhiều loài nấm để làm thuốc bổ, tăng cường thể lực, phòng chống bệnh tật lồi nấm sau: Đơng trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis), phục linh, vân chi, linh chi, nấm hương… Những loài nấm sử dụng rộng rãi, với nhiều thuốc dân gian khác nhằm điều trị nhiều loại bệnh Trong phương thuốc này, hai loài nấm C sinesis, G lucidum xếp vào loại thuốc quan trọng [7, 31, 35] Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy lớp nấm nang, nấm sinh sản vơ tính nấm đảm lồi nấm có khả sản sinh sản phẩm chuyển hóa bậc hai có hoạt tính sinh học, quen thuộc từ loài nấm thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Phoma, Alternaria, Acremonium Stachybotrys, Ganoderma, Lactarius Aureobasidium Số lượng nghiên cứu đầu tư công nghệ phân lập, phân loại nấm ngày nhiều, ngày đại Do đó, từ năm 1990 đến nay, nhiều mẫu nấm lớn giới tìm thấy, đặc biệt nấm ký sinh côn trùng nấm biển ý nguồn nguyên liệu mới, đa dạng có hiệu tốt nhằm cung cấp cho ngành dược liệu Nấm lớn dược liệu có số lượng lớn, có đa dạng sinh học phong phú [15] 1.1.2 Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn Trong lịch sử nghiên cứu thành phần hoá học nấm lớn, hợp chất chuyển hoá bậc hai phân lập từ nấm lớn axit mycophenolic từ P glaucoma Đến năm 1929, nhà bác học Alexander Fleming công bố hợp chất penicillin phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum, có khả kháng khuẩn hiệu sử dụng rộng rãi chiến tranh giới lần thứ II Đây phát vĩ đại, cho thấy đường mới, quan trọng mở đường cho việc tìm loại thuốc y học đại Năm 1940, chất chuyển hoá bậc hai từ nấm lớn thật sự ý đặc biệt Từ đến nay, nhà khoa học phân lập khoảng 8.600 hợp chất chuyển hố bậc hai có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ lồi nấm lớn 1.1.2.1 Kháng khuẩn kháng nấm Qua nghiên cứu nhà khoa học thời gian gần có 75% lồi nấm lớn giới thể khả kháng khuẩn Những hoạt tính khơng liên quan đến hợp chất chuyển hố có khối lượng nhỏ mà cịn liên quan đến hợp chất có khối lượng lớn polysaccarit… Nấm lớn, đặc biệt họ Polyporaceae, Ganodermaceae có lịch sử lâu dài việc sử dụng làm thuốc, chẳng hạn Fomes fomentarius sử dụng làm thuốc cầm máu, băng bó vết thương kỷ 18, 19 [8] Cho đến nay, nhiều nghiên cứu công bố cho thấy khả kháng khuẩn, kháng nấm hợp chất phân lập từ loài nấm lớn, chẳng hạn từ Ganoderma lucidum, G resinoceum, G pfeifferi thể khả kháng khuẩn dòng Baccillus subtilis Hợp chất ganomycin A (1) ganomycin B (2) phân lập từ nấm Ganoderma pfeifferi có khả kháng nhiều dịng vi khuẩn dịng Gram (+): B subtilis, S aureus, Micrococcus flavus OH HO R COOH (1) Ganomycin A (R=OH) (2) Ganomycin B (R=H) Hợp chất isocoumarin có tên oospolacton (3) phân lập từ thể nấm Gleophyllum sepiarium thể khả kháng chủng nấm Alternaria với giá trị MIC 12,5-25 µg/mL OH O O (3) Oospolacton Nhóm hợp chất khác có khả kháng nấm hợp chất polyketit chẳng hạn axit merulinic A, B C (4-6) phân lập từ thể nấm Merulius tremellosus Phlebia radiata [28] (4) Axit merulinic A (R1=OH, R2=H) (5) Axit merulinic B (R1=H, R2=OH) (6) Axit merulinic C (R1=H, R2=H) Hợp chất axit mirulinic thể khả kháng nấm với giá trị MIC khoảng 0,4-10 µg/mL, chống lại chủng nấm Arthrobacter citreus, B subtilis, Corynobacterium insidiosum, Micrococcus roseus Sarcina lutea Hợp chất thể khả kháng chủng nấm Micrococcus phlei, hợp chất khơng có khả Ngồi ra, hợp chất cịn có khả kháng chủng nấm S aureus Proteus vulgaris Nấm Merulius tremellosus không sản sinh hợp chất tạo hợp chất secquiterpenoit merulidial (7), có khả kháng nấm cao hợp chất [28] Hoạt tính sinh học hợp chất phân tử có mặt hai nhóm andehit OH H OHC CHO (7) Merulidial Khả kháng khuẩn hợp chất secquiterpen phải kể đến desoxyhypnophilin (8), hypnophilin (9), 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-5-ol (10) 6,7epoxy-4(15)-hirsuten-1,5-diol (11) với kiểu khung hirsutan phân lập từ thể nấm Lentinus crinitus [10] H O O H R (8) Desoxyhypnophilin (R=H) (10) 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-5-ol (R=H) (9) Hypnophilin (R=OH) (11) 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-1,5-diol (R=OH) Trong đó, hợp chất thể khả kháng chủng khuẩn Gram (+) Bacillus cereus chủng Aspergillus niger, Aspergillus flavus Mucor rouxii Khả kháng khuẩn hợp chất hệ thống khơng bảo hồ phân tử tạo nên Sự thay nhóm cacbonyl hợp chất nhóm hidroxyl làm cho hợp chất 10 khả kháng khuẩn Hợp chất phân lập từ thể nấm Pleurotellus hypnophilus với pleurotellol (12), axit pleurotellic (13) H O O H R (12) Pleurotellol (R=CH2OH) (13) Axit pleurotellic (R=COOH) Ngoài khả kháng khuẩn, kháng nấm hợp chất 12 cịn có khả kìm hãm phát triển thực vật Hai hợp chất hirsutan khác axit hirsutic (14) axit complicatic (15) phân lập từ Stereum compliatum, hợp chất (15) thể khả kháng khuẩn dòng S aureus H O O COOH H (14) Axit hirsutic (15) Axit complicatic Khả kháng nấm hợp chất secquiterpen β-D-xylosit có tên aleurodiscal (16) phân lập từ thể nấm Aleurodiscus mirabilis Hợp chất (16) có khả chống lại số chủng nấm ký sinh, đặc biệt Mucor miehei (16) Aleurodiscal Một số hợp chất steroit phân lập từ Ganoderma applanatum như: 5α-ergost7-en-3β-ol (17), 5α-ergost-7,22-dien-3β-ol (18), 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3βol (19), chất lanostanoit (20) có khả chống lại chủng khuẩn Gram (+) H H HO H H HO (17) 5α-ergost-7-en-3β-ol (18) 5α-ergost-7,22-dien-3β-ol COOH HO O OH O O O H O HO O HO (19) 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3β-ol (20) Lanostanoit Một số hợp chất triterpen với kiểu khung lanostan có tên axit polyporenic C (21), axit 3α-axetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic (22), axit pinicolic A (23), axit trametenolic B (24) axit fomitopsic (25) phân lập từ Fomitopsis pinicola, hợp chất có khả kháng khuẩn dòng B subtilis thể thử TLC với nồng khối lượng từ 0,01-1 µg lại khả thử agar với nồng độ lên tới 50 µg/mL HOOC OH H O (21) Axit polyporenic C (22) Axit 3α-axetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic HOOC H O (23) Axit pinicolic A (24) Axit trametenolic B Các chi Agaricus, Favolaschia Filoboletus chứa hợp chất strobilurin A (26), E (27), F1 (28), 9-methoxystrobilurin A (29), oudemansin A (30), hợp chất thơm thể khả kháng nấm với giá trị MIC 0,1-1 µg/mL 10 HOOC OH O H3COOC H O (25) Axit fomitopsic R2 R1 O O H3COOC OCH3 O O (26) Strobilurin A (R1=H, R2=H) H3COOC OCH3 (27) Strobilurin E (28) Strobilurin F1 (R1=OH, R2=H) (29) 9-methoxystrobilurin A (R1=H, R2=OCH3) OCH3 H3COOC OCH3 (30) Oudemansin A Những hợp chất strobilurin oudemansin cịn có khả ngăn cản phát triển nấm gây bệnh nồng độ thấp Những hợp chất có khả cơng vào trung tâm oxi hoá ubiquinol vi khuẩn xenluloze (BC1) Vì khả đặc biệt đó, chúng trở thành hợp chất dẫn đường để tổng hợp nên dẫn xuất có hoạt tính mạnh sử dụng diệt nấm nơng nghiệp [20] Ngồi hợp chất có cấu trúc phức tạp khối lượng lớn có khả kháng nấm kháng khuẩn hợp chất có cấu trúc hợp chất thơm đơn giản có hoạt tính đó, chẳng hạn anisandehit (31), (4-metoxyphenyl)-1,2-propanediol (32) phân lập từ Pleurotus pulmonarius Bjerkandera adusta, hợp chất thể khả kháng nấm yếu [22] 41 22 CH2 33,7 1,75-1,46 (2H, m) 23 CH2 30,1 2,50 (1H, dd, J=13,5; 8,0 Hz) 1,23-1,20 (1H, m) 24 C 156,8 25 CH 33,9 2,22-2,15 (1H, m) 26 CH3 22,0 0,98 (3H, d, J=3Hz) 27 CH3 21,8 1,00 (3H, d, J=3 Hz) 28 C 182,8 29 CH3 10,7 1,13 (3H, s) 30 CH2 106,4 4,63 (2H, dd, J=23,6; 4,6 Hz) 31 C 171,1 32 CH3 22,2 2,01 (3H, s) H (Đo 400 MHz CDCl3), C ( Đo 100 MHz CDCl3) Từ liệu loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC với cấu trúc lập thể xác định phổ NOESY, xác định cấu trúc chất A, hợp chất đặt tên tramecubin B 32 30 CH3 21 31 O H3C CH3 10 27 14 15 HO H3C 29 25 CH3 16 23 17 13 CH3 CH3 24 20 12 19 26 22 O 11 CH2 COOH 28 Tramecubin B (A) 42 3.1.2.2 Hợp chất B Là chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 258-2600C Phổ khối lượng EI-MS hợp chất B cho pic ion m/z 455 [M]+ tương ứng với công thức phân tử C30H48O3 Phổ 1H-NMR hợp chất B có xuất tín hiệu proton metyl 1,06 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 1,60 (H-26), 1,65 (H-27), 1,06 (3H, s, H-28), 0,99 (3H, s, H-29), 1,23 (3H, s, H-30) Nhưng tín hiệu phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu proton olefinic 5,32 (1H, t, H-24) Phổ 13C-NMR, DEPT hợp chất B cho thấy tín hiệu 30 cacbon cacbon metin, 10 cacbon metilen, cacbon metyl, cacbon olefinic, cacbonyl cacbon bậc Các tín hiệu phổ cho thấy cấu trúc hợp chất B bao gồm hệ thống bốn vòng, có liên kết đơi vị trí C-8 (C 135,0 ppm) C-9 (C 134,3 ppm) Hợp chất B có xuất tín hiệu hai cacbon olefinic C-24 (C 124,9 ppm) C-25 (C 134,6 ppm) cacbonyl C-21(C 178,7 ppm) Ngoài ra, phổ HMBC cho thấy tương tác proton cacbon phân tử B (Hình 3.9) Kết hợp phổ 1H-NMR, 13 C-NMR DEPT, HSQC, HMBC cho thấy hợp chất B dẫn xuất lanosterol 21 23 18 17 12 CH3 CH3 27 11 16 CH3 25 20 CH3 19 26 24 22 HOOC 14 15 10 CH3 28 HO H3C 30 CH3 29 Hình 3.9: Tương quan HMBC (H C) hợp chất B 43 Bảng 3.2: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất B STT DEPT C (ppm) C* (ppm) H (ppm) [13] CH2 36,1 36,1 1,80 (1H, dt, J=9,5; 4,0 Hz) 1,85-1,44 (1H, m) CH2 28,7 28,7 1,81 (2H, dt, J=9,5; 4,0 Hz) CH 78,0 78,0 3,40 (1H, t, J=9,5 Hz) C 39,5 39,5 CH 50,9 50,9 1,15 (1H, t) CH2 18,7 18,7 1,78-1,68 (2H, m) CH2 26,8 26,8 2,06 (2H, t, J=5,5; 3,5 Hz) C 135,0 135,2 C 134,3 134,3 10 C 37,4 37,4 11 CH2 21,2 21,3 1,97-1,92 (2H, m) 12 CH2 29,4 29,4 1,97-1,92 (2H, m) 13 C 44,9 44,9 14 C 49,9 49,9 15 CH2 30,9 30,9 1,78-1,65 (1H, m) 1,26 (1H, td) 16 CH2 27,5 27,5 2,46-2,35 (2H, m) 17 CH 47,7 47,8 2,46-2,35 (1H, m) 18 CH3 16,4 16,4 1,06 (3H, s) 19 CH3 19,4 19,4 1,00 (3H, s) 20 CH 49,0 49,1 2,61 (1H, td, J=9,5; 4,0 Hz) 21 C=O 178,7 178,7 22 CH2 33,3 32,4 1,97-1,92 (1H, m) 1,78-1,68(1H, m) 44 23 CH2 26,7 26,8 2,46-2,35 (1H, m) 2,29-2,25 (1H, m) 24 CH 124,9 124,9 5,32 (1H, t) 25 C 131,7 131,7 26 CH2 17,7 17,8 1,60 (3H, s) 27 CH3 25,8 25,8 1,65 (3H, s) 28 CH3 16,4 16,4 1,06 (3H, s) 29 CH3 28,6 28,7 0,99 (3H, s) 30 CH3 24,5 24,5 1,23 (3H, s) H (Đo 400 MHz pyridine), H* (Đo 200 MHz pyridine) C ( Đo 100 MHz pyridine), C*( Đo 50 MHz pyridine) Từ số liệu phổ so sánh với tài liệu [13], xác định cấu trúc hợp chất B phù hợp với cấu trúc Axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic (axit trametenolic hay axit trametenolic B) Hợp chất trước phân lập từ nấm Fomitopsis pinicola thể khả kháng khuẩn dòng B subtilis nồng độ thấp [13], gây độc dòng tế bào bệnh bạch cầu chuột P388 [17] 21 20 CH3 12 19 11 10 H3 C 30 27 14 25 23 16 CH3 CH3 13 CH3 HO 17 26 24 22 HOOC 15 CH3 28 H CH3 29 Axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic (B) 45 Hình 3.10 Phổ ESI-MS hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Hình 3.11 Phổ 1H-NMR hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 46 Hình 3.12 Phổ 1H-NMR hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Hình 3.13 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 47 Hình 3.14 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 48 Hình 3.15 Phổ COSY hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Hình 3.16 Phổ HSQC hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 49 Hình 3.17 Phổ HSQC hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Hình 3.18 Phổ HMBC hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 50 Hình 3.19 Phổ HMBC hợp chất axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic 51 KẾT LUẬN Tách xác định cấu trúc số hợp chất triterpenoit steroit từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Nghệ An, thu số kết sau: Bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi chọn lọc cất thu hồi dung môi thu cao tương ứng cao DQH (80g), cao DQE (380 g) Phân lập hợp chất từ cao metanol phương pháp sắc ký kết tinh phân đoạn thu chất A (chất mới) B Đã tiến hành sử dụng phương pháp phổ đại: phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC COSY) để xác định cấu trúc hợp chất tách Các kết phổ cho phép khẳng định chất A đặt tên tramecubin B, chất B Axit 3β-hydroxylanosta-8,24dien-21-oic 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Anh (2003), Nghiên cứu thành phần loài nấm lớn Thừa Thiên Huế, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Lê Bá Dũng (2003), Nấm lớn Tây Nguyên, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Lệ Hằng, Trịnh Tam Kiệt (2008), Định loại loài nấm lớn Thành phố Vinh thị xã Cửa Lò, Nghệ An, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 4, tr 43-46 Trịnh Tam Kiệt (1978), Đặc điểm khu hệ nấm lớn sống gỗ tre Việt Nam, Tạp chí Lâm nghiệp, 10, tr 20-25 Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dược liệu Việt Nam, Tạp chí Di truyền học ứng dụng - Chuyên san Công nghệ Sinh học, 4, tr 39-42 Trịnh Tam Kiệt (2012), Nấm lớn Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Trương Bích Ngân, Phạm Văn Cường, Doel D Soejarto, Đồn Thị Mai Hương, Nguyễn Văn Hùng (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học mộc hương dài (Xylosma longifolium Clos), Tạp chí Hố học, 47(4A) tr 405-408 Lê Xn Thám (2005), Nấm Linh chi Ganodermataceae tài nguyên dược liệu quý Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Nghĩa Thìn, Mai Văn Phơ (2003), Đa dạng sinh học hệ nấm thực vật Vườn Quốc gia Bạch Mã, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh 10 Abate D., Abraham W R (1994), Antimicrobial metabolites from Lentinus crinitus, J Antibiot., 47, pp 1348-1350 11 Adam H K., Bryce T A., Campbell I M., McCorkindale N J (1967), Metabolites of the Polyporaceae II Carboxyacetylquercinic acid - a novel 53 triterpene conjugate from Daedalea quercina, Tetrahedron Letter, 16, pp 14611465 12 Anke T., Giannetti B M., Steglich W Z (1982), Antibiotics from basidiomycetes XV 1-Hydroxy-2-nonyn-4-one, an antifungal and cytotoxic metabolite from Ischnoderma benzoinum (Wahl.), Z Naturforsch, 37C, pp 1-4 13 Anne C K., Marc P M., Kurt H (1996), Antimicrobial steroids from the fungus Fomitopsis pinicola, Phytochemistry, 41(4), pp 1041-1046 14 Atsumi S., Umazawa K., Iinuma H., Naganawa H., Nakamura H., Iitaka Y., Takeuchi T (1990), Production, isolation and structure determination of a novel beta-glucosidase inhibitor, cyclophellitol from Phellinus sp., J Antibiot., 43, pp 49-53 15 Berdy J (2005), Bioactive microbial metabolites: a personal view, J Antibiot., 58, pp 1-26 16 Brandt C R., Piraino F (2000), Mushroom antivirals, Rec Res Dev Antimicrob Agents Chemother., 4, pp 11-26 17 Caroline G., Emmanuelle R L., Adriana C C., Paul H N (2002), Immunoblotting and sequential lysis protocols for the analysis of tyrosine phosphorylationdependent signaling, J Immunol Methods, 271(1-2) pp 185-201 18 Chen C H., Yang S W., Shen Y C (1995), New steroidal acids from Antrodia cinnamomea-A fungus parasite of Cinnamomum micranthum, J Nat Prod., 58 (11) pp 1655-1661 19 Chiang Y.M., Liu H.K., Lo J.M., Chien S.C., Chan Y.F., Lee T.H., Su J.K., Kuo Y.H (2003), Cytotoxic constituents of the leaves of Calocedrus formosana, J Chin Chem Soc., 50, pp 161-166 20 Clough J M (1993), Basidiomycetes as a source for new bioactive natural products, Nat Prod Rep., 10, pp 565-574 21 Colins R A., Ng T B (1997), Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type infection, 54 Life Sci., 60, pp 383-387 22 Dejong E., Field J., Spinnier H E., Wijnberg J B P A., Bebont J A M (1994), Significant biogenesis of chlorinated aromatics by fungi in natural environments, Appl Environ Microbiol., 60, pp 264-270 23 EI-Mekkawy S., Meselhy M R., Nakamura N., Tezuka Y., Hattori M., Kakiuchi N., Shimotohno K., Kawahata T., Otake T (1998), Anti-HIV-1 and anti-HIV-1protease substances from Ganoderma lucidum, Phytochemistry, 49, pp 16511657 24 Eo S K., Kim Y S., Oh K W., Lee C K., Lee Y N., Han S S (2001), Mode of antiviral activity of water soluble components isolated from Elfvingia applanat on vesicular stomatitis virus, Arch Pharm Res., 24, pp 74-78 25 Erkel G., Anke T., Sterner O (1996), Inhibition of NF-κB activation by panepoxydone, Biochem Biophys Res Commun., 226, pp 214-221 26 Francisco L., Jose Q., Augusto R., Francisco E., Jaime B (2004), Lanostanoid triterpenes from Laetiporus sulphureus and apoptosis induction on HL-60 human myeloid leukemia cells, J Nat Prod., 67, pp 2008-2011 27 Gao J J., Min B S., Ahn E M., Nakamura N., Lee H K., Hattori M (2002), New triterpene aldehides, lucialdehides A- C, from Ganoderma lucidum and their cytoxicity against murine and human tumor cells, Chem Pharm Bull., 50, pp 837-840 28 Giannetti B M., Steglich W., Quack W., Anke T., Oberwinkler F (1978), Antibiotika as Basidiomyceten, IV Merulinsauren A, B and C, neue antibiotika aus Merulius tremellosus Fr und Phlebia radiate Fr., Z Naturforsch 33C, pp 807-816 29 Hansen M B., Nielsen S E., Berg K (1989), Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell-growth cell kill, J Immunol Methods, 119, pp 203-210 30 Hashimoto T., Asakawa Y (1998), Biologically active substances of Japanese 55 in-edible mushrooms, Heterocycles, 47, pp 1067-1110 31 Hawksworth D L (2001), The magnitude of fungal diversity: the 1.5 milion species estimate revisited, Mycol Res., 105, pp 1422-1432 32 Hawksworth D L (2004), Fungal diversity and its implication for genetic resource collections, Stud Mycol., 50, pp 9-18 33 Hirose K., Hakozaki M., Kakuchi J., Matsunaga K., Yoshikumi C., Takahashi M., Tochikura T S., Yamamoto N (1987), A biological response modifier, PSK, inhibits reverse transcriptase in vitro, Biochem Biophys Res Commun., 149, pp 562-567 34 Hirotani M., O’Reilly J., Donnelly D M X., Polonsky J (1977), FomannoxinA toxic metabolite of Fomes annosus, Tetrahedron Lett., 18(7) pp 651-652 35 Hu D.B., Zhang S., He J.B., Dong Z.J., Li Z.H., Feng T., Liu J.K (2015), Brasilane sesquiterpenoids and alkane derivatives from cultures of the basidiomycete Coltricia sideroides, Fitoterapia, 104, pp 50-54 36 Hwang T L., Wang C C., Kuo Y H., Huang H C., Wu Y C., Kuo L M., Wu Y H (2010), The hederagenin saponin SMG-1 is a natural FMLP receptor inhibitor that suppresses human neutrophil activation, Biochem Pharm., 80(8) pp 1190-1200 37 Ichimura T., Watanabe O., Maruyama S (1998), Inhibition of HIV-1 protease by water-soluble lignin-like substance from an edible mushroom Fuscoporia obligua, Biosci Biotechnol Biochem., 62, pp 575-577 38 Inkyum K., Chin Y W., Lim S W., Kim Y C., Kim J (2004), Norisoprenoids and hepatoprotective flavone glycosides from the aerial parts of Beta vulgaris var cicla, Arch Pharm Res., 27(6) pp 600-603 39 Ishizuka M., Takeuchi T., Umezawa H (1981), Studies of the mechanism of action of diketocoriolin B to enhance antibody formation, J Antibiot., 34, pp 95-102 ... tầm quan trọng nguồn nấm dược liệu nước ta Chính mà chọn đề tài "Tách xác định cấu trúc số hợp chất triterpenoit steroit từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Nghệ An" nhằm nghiên cứu hợp chất. .. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 3.1.1 Mẫu nấm Mẫu nghiên cứu nấm vân chi (Trametes cubensis) thu hái Kỳ Sơn, Nghệ An vào tháng 08/2012 Mẫu định danh PGS TS Ngô Anh,... hợp chất từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất từ dịch chi? ??t hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 4 Chương TỔNG QUAN 1.1