Một phương pháp xác định hàm lượng vết Protein trong vật liệu Chitin/Chitosan

Những tạp chất này, đặc biệt là protein và muối vô cơ nằm đan xen nhau trong mạch cao phân tử chitin/chitosan, nên khi áp dụng các phương pháp xác định vết protein thông thường cho hợp chất thấp phân tử sẽ có độ chính xác không cao. Mặt khác, trong cấu tạo hoá học của đại phân tử chitin/chitosan đã có chứa nitơ ở các nhóm chức (NHCOCH3, NH2), vì vậy không thể dùng phản ứng Kjeldahl đơn thuần để xác định vết protein được. Do đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng vết protein trong chitin/chitosan để góp phần xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho vật liệu này.

MỘT PHƯƠNG PHÁP XÁC ÐỊNH HÀM LƯỢNG VẾT PROTEIN TRONG VẬT LIỆU CHITIN/CHITOSAN Nguyễn Thị Ngọc Tú Viện Hoá học Trung tâm Khoa học Tự nhiên CNQG I - ĐẶT VẤN ĐỀ Chitin/chitosan polysacarit có nhiều ứng dụng y học, dùng làm vật liệu y sinh độc tính thẩp, hồ hợp sinh học tự phân huỷ sinh học [1], [2], có khả kháng khuẩn, kháng nấm tăng sinh tế bào [3] Chitin/chitosan sản xuất từ vỏ loài thủy hải sản (vỏ tôm, vỏ cua, mai mực, mai sam ) Trong qúa trình sản xuất chitin/chitosan cần phải loại bỏ protein, muối vô cơ, chất mầu tạp chất khác Ðộ tinh khiết chitin/chitosan phụ thuộc nhiều vào hàm lượng protein cịn sót ngun tố vi lượng sản phẩm [4] Những tạp chất này, đặc biệt protein muối vô nằm đan xen mạch cao phân tử chitin/chitosan, nên áp dụng phương pháp xác định vết protein thông thường cho hợp chất thấp phân tử có độ xác khơng cao Mặt khác, cấu tạo hố học đại phân tử chitin/chitosan có chứa nitơ nhóm chức (NHCOCH3, NH2), khơng thể dùng phản ứng Kjeldahl đơn để xác định vết protein Do đó, chúng tơi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng vết protein chitin/chitosan để góp phần xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho vật liệu II - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu - Chitin, chitosan kỹ thuật, chitosan tinh chế: phòng Nghiên cứu Polyme Dược phẩm Viện Hoá học sản xuất - Dung dịch NaOH 10% 1,25% - Dung dịch HCl 10N - Dung dịch CuSO4 6% Phương pháp nghiên cứu Phương pháp đề xuất: Cân xác khoảng 4g chitin/chitosan (A) sấy khô đến khối lượng không đổi Thêm vào A lượng 196 ml dung dịch NaOH 10% (B) Tách chiết protein TRONG A cách hồi lưu B nhiệt độ 1000C Việc tách chiết vết protein lặp lại lần, tổng cộng dùng 392 ml NaOH 10% Sau lọc loại bỏ chitin/chitosan, gộp dịch lọc, thu dung dịch C Dịch lọc C trung hoà HCl 10N đến pH = (D), cất loại bỏ nước ỏ 600C điều kiện chân không, thu bột màu vàng mà chứa vết protein cịn sót lại A (E) Chất E làm khô Silicagen bình hút ẩm chân khơng đến khối lượng khơng đổi (F) Xác định vết protein F cách phân tích hàm lượng Nitơ tồn phần theo phương pháp Kjeldahl [5] Lặp lại thí nghiệm lần để lấy giá trị trung bình kết nghiên cứu Phương pháp đối chứng: Chọn phương pháp xác định polypeptid acid amin chitin/chitosan thông thường [6] phương pháp đối chứng: cân xác 10g chitin/chitosan (A) nghiền mịn Cho A vào cốc thuỷ tinh với 50 ml nước cất (B) Ðun sôi B 10 phút, lọc loại bỏ A, giữ lại dịch lọc (C) Cho vào dịch lọc C lượng 25 ml dung dịch CuSO4 6% (D) Thêm từ từ 25 ml NaOH 1,25% vào D, khuấy Vết protein kết tủa Loại bỏ nước 600C điều kiện chân không, thu chất bột màu xanh (E) Xác định vết protein E theo phương pháp Kjeldahl [5] Lặp lại thí nghiệm lần để lấy giá trị trung bình kết nghiên cứu III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết xác định hàm lượng vết protein vật liệu chitin/chitosan theo hai phương pháp với mẫu khác thể bảng Bảng Hàm lượng vết protein vật liệu chitin/chitosan (phương pháp 1: đề xuất ; phương pháp : chứng) Kết nghiên cứu cho thấy Phương pháp Số mẫu Tên mẫu Phương pháp Chitin KT 0,51 0,32 Chitin KT 0,56 0,34 CHITIN KT 0,55 0,36 Chitosan KT 0,30 0,25 Chitosan KT 0,28 0,25 Chitosan KT 0,28 0,26 Chitosan tinh chế 0,05 Khơng có vết Chitosan tinh chế Không phát Không có vết thấy Chitosan tinh chế Khơng phát Khơng có vết thấy - Với mẫu, hàm lượng vết protein mẫu chitin/chitosan xác định theo phương pháp đề xuất cao so với phương pháp đối chứng - Mẫu chitosan tinh chế có hàm lượng vết protein thấp (khơng phát thấy vết protein phép thử) so với mẫu chitosan kỹ thuật mẫu chitin Do protein nằm đan xen mạch đại phân tử chitin/chitosan nên khó loại khó xác định theo phương pháp thơng thường Ở phương pháp đề xuất phải dùng NaOH 10% Ở nhiệt độ 1000C để tách chiết nhiều lần vết protein lại mạch chitin/chitosan Ở phương pháp đối chứng, sử dụng nước cất đun sôi, nên khả tách chiết vết protein chitin/chitosan khơng cao, khơng triệt để, kết hàm lượng vết protein thu có phần thấp IV - KẾT LUẬN Sử dụng phương pháp đề xuất để xác định vết protin chitin/chitosan cho kết sát thực mẫu chitin/chitosan giới mà chúng tơi thu thập được, có hàm lượng vết protein 0,5 - 0,8% Chúng lựa chọn phương pháp phương pháp xác định vết protein chitin/chitosan cho việc xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật vật liệu SUMMARY Protein trace present in chitin/chitosan product has been determined by our proposed method in which protein trace included in chitin/chitosan was extracted by refraction in 10% NaOH solution at 1000C for hours Chitin/chitosan precipitate was discarded Protein trace in the solution was restored by neutralizing with HCl 10N to get the yellow powder This powder was then analyzed for total nitrogen content by Kjeldahl method The control method was conducted at the same procedure excepted from the presence of 10% NaOH The results of different chitin/chitosan samples obtained from these two methods showed that amount of protein trace obtained from above proposed method was somewhat higher than that of the control one Besides, the purified chitosan sample gave the lower protein trace content than that of the technical chitosan sample as well as chitin one Protein trace bound between macromolecules of chitin/chitosan was separated in the proposed method by boiling water under alkaline condition whereas it was not completely separated in the control/ method because sodium hydroxide was absent Therefore, the proposed method has given more exact result" TÀI LIỆU THAM KHẢO K Rai, T Kinuman and T Fujita On the toxicity of chitosan Bull Tokai Regional Fisheries Res Lab 1968, 56-89 Sang-Mun Han Jong-Beom Son, Seung Jin Lee, Yong-Beom Kim, Byung-Kook Kwak Hyung-Jim Shim Application of chitin and chitosan to embolization of vascular systems International conference 8th ICCC - 4th APCCS September 21 - 23 2000 Yamaguchi Japan, p 160 Nguyễn Thị Ngọc Tú cộng Tuyển tập báo cáo khoa học, Viện Hoá học, 1995, tr 259 Tài liệu khoa học chitin/chitosan phịng Polyme Dược phẩm - Viên Hố học (1993 - 2002) Dược điển Viêt nam, xuất lần thứ II, tập 3, 1994, Nhà xuất y học Tạp chí dược học : Số 11 Năm 2002, trang 23 - 24 ... Kết xác định hàm lượng vết protein vật liệu chitin/chitosan theo hai phương pháp với mẫu khác thể bảng Bảng Hàm lượng vết protein vật liệu chitin/chitosan (phương pháp 1: đề xuất ; phương pháp. .. phương pháp đề xuất để xác định vết protin chitin/chitosan cho kết sát thực mẫu chitin/chitosan giới mà thu thập được, có hàm lượng vết protein 0,5 - 0,8% Chúng tơi lựa chọn phương pháp phương pháp. .. Không có vết Chitosan tinh chế Khơng phát Khơng có vết thấy Chitosan tinh chế Khơng phát Khơng có vết thấy - Với mẫu, hàm lượng vết protein mẫu chitin/chitosan xác định theo phương pháp đề xuất