Sự ra đời của kháng sinh peniciline vào thể kỷ 20 đã đánh dấu một kỷ nguyên mới của y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, từ đó đến nay đã có hàng trăm loại thuốc và kháng sinh tương tự đã được phát minh và đưa vào sử dụng. Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn tới tỉ lệ kháng kháng sinh gia tăng và trở thành một thách thức lớn trên toàn thế giới. Theo số liệu của Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), ước tính hàng năm có khoảng 25000 trường hợp tử vong do nhiễm khuẩn vi khuẩn đa kháng thuốc và gánh nặng kinh tế của đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro mỗi năm 35 Trước tình trạng này, nhiều cơ sở y tế đã đưa các nhóm kháng sinh phổ kháng khuẩn mạnh như carbapenem vào để chữa trị cho bệnh nhân có các triệu chứng kháng kháng sinh quá mạnh, trong đó meropenem được sử dụng nhiều nhất vì có phổ tác dụng rộng 47.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HÀ THU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội –Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HÀ THU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG Chun ngành: Hóa phân tích Mã số : 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI Hà Nội –Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai giao đề tài, truyền thụ cho em nhiều kiến thức tận tình hướng dẫn em suốt trình làm luận văn tốt nghiệp Em xin trận trọng cảm ơn anh chị bạn Phịng Thử nghiệm 1Cơng ty Cổ phần Chứng nhận Giám định Vinacert giúp đỡ tận tình tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy khoa Hóa học, đặc biệt thầy Bộ mơn Hóa Phân tích lịng tri ân sâu sắc Luận văn hồn thành với hỗ trợ phần từ đề tài 104.04-2017.12 Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia Hà Nội, tháng 09 năm 2019 Học viên cao học Nguyễn Thị Hà Thu MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.2 Đại cương nhóm kháng sinh carbapenem 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Cơ chế tác dụng 1.2.3 Phổ tác dụng carbapenem 1.2.4 Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem 1.3 Meropenem 1.3.1 Cấu trúc hóa học 1.3.2 Dược lý chế tác dụng 1.4 Các phương pháp xác định meropenem 1.4.1 Phương pháp sắc ký 1.4.2 Phương pháp điện hóa 11 1.4.3 Phương pháp điện di mao quản 11 1.5 Giới thiệu vật liệu vàng nano ứng dụng 15 1.5.1 Vật liệu vàng nano 15 1.5.2 Tính chất quang hạt nano vàng 16 1.5.3 Công nghệ sản xuất hạt nano vàng 20 1.5.4 Ứng dụng hạt nano vàng 23 CHƯƠNG II-THỰC NGHIỆM 28 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 28 2.1.1 Mục tiêu 28 2.1.2 Đối tượng 28 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 29 2.2.1 Hóa chất 29 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp chế tạo hạt nano vàng 30 2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử dụng hạt nano vàng 31 2.3.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM 32 2.3.4 Đánh giá độ tin cậy phương pháp 33 2.4 Quy trình thực nghiệm 34 2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng 34 2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện phân tích 35 2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 35 2.4.4 Định lượng meropenem mẫu thực tế 36 CHƯƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Khảo sát đặc trưng dung dịch nano vàng 39 3.1.1 Khảo sát hình thái bề mặt qua ảnh TEM 39 3.1.2 Khảo sát đặc tính hấp thụ cộng hưởng bề mặt phổ hấp thụ phân tử UVVIS 40 3.2 Khảo sát điều kiện xác định meropenem dung dịch nano vàng 41 3.2.1 Ảnh hưởng pH 42 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 43 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch nano vàng 44 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian 45 3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ meropenem 46 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích xác định meropenem dung dịch nano vàng 48 3.3.1 Xác định khoảng tuyến tính 48 3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn 49 3.3.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 50 3.3.4.Xác định độ độ lặp lại 51 3.4 Ứng dụng xác định meropenem mẫu thực tế 53 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 53 3.4.2.Đánh giá phương pháp phân tích mẫu thuốc 55 3.5 Ứng dụng xác định mẫu thực tế 56 KẾT LUẬN 60 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 67 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định meropenem Bảng 1.3 Kích cỡ hạt nano vàng sử dụng Bảng 1.4 Một số ứng dụng hạt nano vàng phân tích Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1 Ảnh hưởng pH đến tỉ lệ độ hấp thụ quang Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ muối đến tỉ lệ độ hấp thụ quang Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch AuNPs đến tỉ lệ độ hấp thụ quang Bảng 3.4 Nồng độ meropenem tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520 Bảng 3.5 Giới hạn phát số phương pháp xác định meropenem Bảng 3.6 Kết đánh giá độ độ lặp lại phương pháp Bảng 3.7 Kết đánh giá ảnh hưởng đường Na2CO3 đến tỉ lệ độ hấp thụ quang Bảng 3.8 Độ lặp lại mẫu thuốc ngày khác ngày Bảng 3.9 Kết đánh giá độ mẫu thuốc Bảng 3.10 Kết phân tích meropenem số mẫu dược phẩm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử kháng sinh nhóm carbapenem Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo cấu trúc phân tử meropenem Hình 1.3 Màu sắc keo vàng nano theo kích thước hạt Hình 1.4 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Hình 1.5 Hiện tượng SPR nano vàng dạng cầu Hình 1.6 Sự phân bố điện tích nano kích thước ánh sáng tới Hình 2.1 Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng Hình 2.2 Cơ chế phát triển mầm phương pháp Turkevick Hình 2.3 Cơ chế phương pháp xác định meropenem sử dụng nano vàng Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Hình 3.1 Dung dịch nano vàng điều kiện thường (màu đỏ) có mặt meropenem (màu xanh) Hình 3.2 Hình thái hạt nano vàng thơng qua ảnh TEM Hình 3.3 Phổ hấp thụ dung dịch nano vàng có mặt meropenem Hình 3.4 Ảnh hưởng pH Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch AuNPs Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ meropenem Hình 3.9 Biểu đồ phụ thuộc nồng độ meropenem độ hấp thụ quang Hình 3.10 Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính xác định meropenem Hình 3.11 Đường chuẩn xác định meropenem Hình 3.12 Phổ hấp thụ UV-Vis số mẫu thuốc chứa meropenem Hình 3.13 So sánh tương quan hai phương pháp HPLC-DAD UV-Vis DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu AuNPs Tiếng Việt Hiệp hội cộng đồng phân tích thức Hạt nano vàng Tiếng Anh Association of Official Analytical Communities Gold nano particles CZE Điện di mao quản vùng Capillary Electropherosis Zone DAD Detector mảng diot Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu Diode array detector AOAC EMA European Medicines Agency FDA Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ Food and Drug Administration HILIC Sắc ký lỏng tương tác thân nước Hydrophilic interaction liquid chromatography HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography HPLC-UV Sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò UV High Performance Liquid Chromatography- Ultraviolet LC Sắc ký lỏng Liquid Chromatography LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần Liquid Chromatography tandem mass spectrometry Limit of Detection Limit of Quantification SWV Giới hạn phát Giới hạn định lượng Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Von-ampe sóng vng TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua Transmission electron microscopy UHPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu Ultra Performance Liquid Chromatography LOD LOQ SPR Surface plasmon resonance Square wave voltammetry ĐẶT VẤN ĐỀ Sự đời kháng sinh peniciline vào thể kỷ 20 đánh dấu kỷ nguyên y học điều trị bệnh nhiễm khuẩn, từ đến có hàng trăm loại thuốc kháng sinh tương tự phát minh đưa vào sử dụng Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh dẫn tới tỉ lệ kháng kháng sinh gia tăng trở thành thách thức lớn toàn giới Theo số liệu Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), ước tính hàng năm có khoảng 25000 trường hợp tử vong nhiễm khuẩn vi khuẩn đa kháng thuốc gánh nặng kinh tế đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro năm [35] Trước tình trạng này, nhiều sở y tế đưa nhóm kháng sinh phổ kháng khuẩn mạnh carbapenem vào để chữa trị cho bệnh nhân có triệu chứng kháng kháng sinh mạnh, meropenem sử dụng nhiều có phổ tác dụng rộng [47] Meropenem hiệu điều trị loạt nhiễm trùng gây trực khuẩn Gram âm Gram dương, mầm bệnh hiếu khí mẫn cảm với thuốc Meropenem hoạt động cách liên kết với protein phá vỡ toàn vẹn thống thành tế bào vi khuẩn Meropenem tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch cho hiệu lâm sàng điều trị loạt bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng vi khuẩn viêm phổi, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng ổ bụng, viêm phổi…[21] Ngồi meropenem kháng sinh thuộc nhóm carbapenem chấp thuận sử dụng để điều trị viêm màng não gây nguy động kinh an tồn cho phụ nữ có thai [18] Được coi loại kháng sinh mạnh nay, việc định lượng meropenem dược phẩm dịch sinh học bệnh nhân nhằm đánh giá hiệu điều trị bệnh quan trọng Hiện phương pháp phổ biến để xác định hàm lượng meropenem phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC [21,18,19], phương pháp điện di mao quản [33,26] , phương pháp điện hóa[13] v.v có chung số nhược điểm thiết bị, hóa chất đắt tiền, vận hành phức tạp, việc phát triển phương pháp phân tích có độ nhạy độ xác cao lại đơn 10 meropenem in serum”, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 686(1): p 19-26 22 Gu Jiun-An, Lin Yu-Jen, Chia Yu-Ming, Lin Hsin-Yi, Huang Sheng-Tung (2013), "Colorimetric and bare-eye determination of fluoride using gold nanoparticle agglomeration probes", Microchimica Acta, 180(9-10), p 801-806 23 Herizchi, R.(2016), “Current methods for synthesis of gold nanoparticles”, Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology, 44(2): p 596-602 24 Huang, L.(2014), “Determination of meropenem in bacterial media by LC– MS/MS”, Journal of Chromatography B, 961: p 71-76 25 K.E.Gerrald (2008), AFHS-Drug Information, American Society of Health System Pharmacist 26 Kitahashi, T and I Furuta (2005), “Determination of meropenem by capillary electrophoresis using direct injection of serum”, Journal of chromatographic science, 43(8): p 430-433 27 Liu Yanlan, Ai Kelong, Cheng Xiaoli, Huo Lihua, Lu Lehui (2010),"Gold‐ Nanocluster‐Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water", Advanced Functional Materials, 20(6), p.951956 28 Martens-Lobenhoffer, J and S.M Bode-Böger (2017), “Quantification of meropenem in human plasma by HILIC–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 1046: p 13-17 29 Martin, M.N (2010), “Charged gold nanoparticles in non-polar solvents: 10-min synthesis and 2D self-assembly”, Langmuir, 26(10): p 7410-7417 30 Minakshi Das, K.H.S., Seong Soo A.An, Dong Kee Yi (2011), “Review on Gold nanoparticles and their application”, Toxicology and Environmental health science, p 193-205 31 Moon, Y.S., K.C Chung, and M.A Gill (1997), “Pharmacokinetics of meropenem in animals, healthy volunteers, and patients”, Clinical infectious 63 diseases, 1997 24(Supplement_2): p S249-S255 32 Morteza Akhond, Ghodratollah Absalan, Hamid Ershadifar (2015), “Highly sensitive colorimetric formulations based determination on induced of amoxicillin aggregation of in pharmaceutical gold nanoparticles”, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 143, p 223-229 33 Mrestani, Y., R Neubert, and F Nagel (1999), “Capillary zone electrophoresis determination of meropenem in biological media using a high sensitivity cell”, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 20(6): p 899-903 34 Niu Hongyun, Wang Saihua, Zhou Zhen, Ma Yurong, Ma Xunfeng, Cai Yaqi (2014), "Sensitive colorimetric visualization of perfluorinated compounds using poly (ethylene glycol) and perfluorinated thiols modified gold nanoparticles", Analytical chemistry, 86(9), p 4170-4177 35 Özkan (2001), “A rapid, sensitive high performance liquid chromatographic method for the determination of meropenem in pharmaceutical dosage form, human serum and urine”, Biomedical Chromatography, 15(4): p 263-266 36 Perrault, S.D and W.C Chan (2009), “Synthesis and surface modification of highly monodispersed, spherical gold nanoparticles of 50− 200 nm”, Journal of the American Chemical Society, 131(47): p 17042-17043 37 Rahme, K and J.D Holmes (2015), “Gold nanoparticles: synthesis, characterization, and bioconjugation”, CRC Press, Taylor & Francis 38 Roth.T, Fiedler.S, Mihai.S & Parsch.H (2017), “ Determination of meropenem levels in human serum by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection”, Biomedical Chromatography, 31(5) 39 Shankar, S.S.(2004), “Biological synthesis of triangular gold nanoprisms”, Nature materials, 2004 3(7): p 482 40 Shrivas Kamlesh, Shankar Ravi, Dewangan Khemchand (2015), "Gold nanoparticles as a localized surface plasmon resonance based chemical sensor for 64 on-site colorimetric detection of Arsenic in water samples", Sensors and Actuators B: Chemical, 220, p 1376-1383 41 Sun Jie-Fang, Liu Rui, Zhang Zhong-Mian, Liu Jing-Fu (2014), "Incorporation of the fluoride induced SiO bond cleavage and functionalized gold nanoparticle aggregation into one colorimetric probe for highly specific and sensitive detection of fluoride", Analytica Chimica Acta, 820, p 139-145 42 TAKEUCHI, Y., T INOUE, and M SUNAGAWA (1993), “Studies on the structures of meropenem (SM-7338) and it's primary metabolite”, The Journal of antibiotics, 46(5): p 827-832 43 Tan Zhi-Qiang, Liu Jing-Fu, Yin Yong-Guang, Shi Qian-Tao, Jing Chuan-Yong, Jiang Gui-Bin (2014), "Colorimetric Au nanoparticle probe for speciation test of arsenite and arsenate inspired by selective interaction between phosphonium ionic liquid and arsenite", ACS applied materials & interfaces, 6(22), p 19833- 19839 44 Verma, S and J.S Sekhon (2012), “Influence of aspect ratio and surrounding medium on localized surface plasmon resonance (LSPR) of gold nanorod”, Journal of Optics, 41(2): p 89-93 45 Verwaest, C and B.M.S Group (2000), “Meropenem versus imipenem/cilastatin as empirical monotherapy for serious bacterial infections in the intensive care unit”, Clinical microbiology and infection, 6(6): p 294-302 46 Wang, Z (2013), “Plasmon—resonant gold nanoparticles for cancer optical imaging”, Science China Physics, Mechanics and Astronomy, 56(3): p 506-513 47 World Health Organization (2018), Antimicrobial resistance and primary health care No.WHO/HIS/SDS/2018.57 48 Xue Mei, Wang Xu, Duan Lili, Gao Wen, Ji Lifei, Tang Bo (2012), "A new nanoprobe based on FRET between functional quantum dots and gold nanoparticles for fluoride anion and its applications for biological imaging", Biosensors and Bioelectronics, 36(1), p 168-173 49 Zhanel, G.G (2007), “Comparative review of the carbapenems”, Drugs, 67(7): p 65 1027-1052 50 Zhang Jia, Zhang Chuan‐Ling, Yu Shu‐Hong (2016), "Tuning Gold Nanoparticle Aggregation through the Inhibition of Acid Phosphatase Bioactivity: A Plasmonic Sensor for Light‐Up Visual Detection of Arsenate (AsV)", ChemPlusChem, 81(11), p 1147-1151 51 Zhang Yuanfu, Li Baoxin, Chen Xingling (2010), "Simple and sensitive detection of dopamine in the presence of high concentration of ascorbic acid using gold nanoparticles as colorimetric probes", Microchimica Acta, 168(1-2), p 107-113 66 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bài báo khoa học 67 Phụ lục 2: Phiếu kết phân tích đối chứng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương 68 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HÀ THU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG Chuyên... tiêu Mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình xác định meropenem phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng hạt nano vàng ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng kháng sinh meropenem mẫu... nhóm: phương pháp hóa học, phương pháp xạ phương pháp khử sinh học 1.5.3.1 Phương pháp Turkevich Phương pháp phát triển J.Turkevich đồng nghiệp vào năm 1951 Phương pháp phương pháp phổ biến coi phương