Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người đầu những năm 2000 tại miền Bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN LÊ KHÁNH HẰNG NGHIÊN CỨU CĂN NGUYÊN CỦA CÁC VỤ DỊCH CÚM NGƯỜI ĐẦU NHỮNG NĂM 2000 TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 62 42 40 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Quỳnh Mai PGS TS Kiều Hữu Ảnh Phản biện 1: GS.TS Phạm Văn Ty Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Trần Hiển Phản biện 3: PGS.TS Đinh Duy Kháng Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Vào hồi……ngày ……tháng ……năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư Viện Quốc gia - Thư Viện Đại học Quốc gia Hà Nội - Thư Viện Trường Đại học Khoa học Tự nhiên DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Huỳnh Phương Liên, Nguyễn Lê Khánh Hằng, Nghiêm Kim Hà, Nguyễn Cơng Đồn, Hiroshi Suzuki, Reiko Saito (2005), “Nghiên cứu chủng virút cúm virút gây viêm đường hơ hấp cấp Hà nội, 2001”, Tạp chí Y học Thực hành (505), 3, tr 23-26 Lê Quỳnh Mai, Nguyễn Lê Khánh Hằng, Đinh Tuấn Đức, Hoàng Vũ Mai Phương, Trần Thị Thu Hương, Trần Thị Nguyễn Hòa cs (2005), “Nghiên cứu quy trình chẩn đốn sớm nhiễm virút cúm A/H5N1”, Tạp chí Y học Dự phòng, XV, (76), tr 12 – 16 Q Mai Le, Maki Kiso, Kazuhiko Someya, Yuko T Sakai, T, Hien Nguyen, Khanh L.K Nguyen, N Dinh Pham, Ha H Nguyen, Shinya Yamada, Yukiko Muramoto, Taisuke Horimoto, Ayato Takada, Hideo Goto, Takashi Suzuki, Yasuo Suzuki and Yoshihiro Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus”, Nature, 437, pp 1108 Hang L.K Nguyen, Reiko Saito, Ha K Nghiem, Makoto Nishikawa, Yugo Shobugawa, Doan C Nguyen, Long T Hoang, Lien P Huynh, Hiroshi Suzuki (2007), “Epidemiology of Influenza in Hanoi, Vietnam, from 2001 to 2003”, Journal of Infection , 55, pp 58-63 Danjuan Li, Reiko Saito, Mai T Q Le, Hang L K Nguyen, Yaushi Suzuki, Yugo Shobugawa, Duc T Dinh, Phuong V.M Hoang, Huong T.T Tran, Ha K Nghiem, Long T Hoang, Lien P Huynh, Hien T Nguyen, Makoto Nishikawa, and Hiroshi Suzuki (2008), “Genetic Analyis of Influenza A/H3N2 and A/H1N1 Viruses circulating in Vietnam from 2001 to 2006” Journal of Clinical Microbiology, 46 ( 2), pp 399-405 ĐẶT VẤN ĐỀ Virút cúm (Influenza virus) tác nhân gây vụ dịch cúm hàng năm nước nhiệt đới cận nhiệt đới với tỷ lệ mắc tử vong cao Các vụ dịch cúm xảy thường thay đổi tính kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) Lịch sử ghi nhận vụ đại dịch cúm xảy kỷ XX đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 (A/H1N1), đại dịch cúm Châu Á năm 1957 (A/H2N2), đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 (A/H3N2)…là trao đổi vật liệu di truyền virút cúm người virút cúm gia cầm Dịch cúm gia cầm virút cúm A/H5N1 độc lực cao xuất Hàn Quốc tháng12/2003 lan rộng sang số nước Châu Á mối quan tâm lo ngại hàng đầu Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất Việt Nam Đến nay, dịch xuất 61 tỉnh/thành nước với số gia cầm tiêu hủy 50 triệu tổng số 300 triệu gia cầm mắc bệnh Tính đến tháng 5/2009, có 15 quốc gia vùng lãnh thổ xuất virút cúm A/H5N1 người với 436 trường hợp mắc 262 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 60% Việt Nam nước thứ hai giới xuất virút cúm A/H5N1 người (28/12/2003) Kể từ trường hợp mắc (5/2009) Việt Nam có 111 trường hợp xác định nhiễm cúm A/H5N1 với 56 ca tử vong, chiếm tỷ lệ 50,5% Dịch xảy tai 36/64 tỉnh/ thành phố Sự lưu hành đồng thời virút cúm theo mùa (A/H1N1, A/H3N2 B) virút cúm A/H5N1 Việt Nam số nước khác giới gây nên mối lo ngại khả xuất chủng virút cúm mới, có khả lây truyền dễ dàng từ người sang người Vì vậy, giám sát lưu hành chủng virút cúm mùa virút cúm A/H5N1 theo dõi đặc điểm di truyền học, biến đổi tính kháng nguyên cần thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nguyên vụ dịch cúm người đầu năm 2000 Miền Bắc Việt Nam ” Với mục tiêu: Xác định nguyên vụ dịch cúm giai đoạn 2001-2009 Tìm hiểu đặc điểm di truyền học, tính kháng nguyên chủng virút cúm mùa A/H1N1, A/H3N2, B virút cúm A/H5N1 lưu hành giai đoạn 2001-2009 Những đóng góp luận án Xác định nguyên vụ dịch cúm thời gian lưu hành virút cúm Miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2001-2009 Điều có ý nghĩa dự đốn thời điểm diễn vụ dịch chủ động cơng tác phòng chống dịch 2 Chứng minh tương đồng kháng nguyên virút cúm mùa A/H1N1 A/H3N2 lưu hành Miền Bắc Việt Nam với chủng virút cúm TCYTTG khuyến cáo cho sản xuất vắc xin khu vực Bắc Bán cầu theo năm Chứng minh không thay đổi gen định gắn bám virút cúm A/H5N1 với tế bào chuyển túc chủ từ loài chim sang người Điều giải thích cho việc virút cúm A/H5N1 không lan truyền rộng rãi quần thể người Chứng minh tiến hóa lan truyền virút cúm A/H5N1 dường khu vực mà lưu hành khơng phụ thuộc vào trao đổi tích hợp với virút cúm chim di cư mang đến Phát số đột biến, thay đổi axit amin số vị trí protein NA cụ thể vị trí H275Yvà I117V liên quan đến kháng giảm độ nhạy thuốc Điều có ý nghĩa quan trọng cơng tác điều trị dự phòng bệnh cúm Bố cục luận án: Luận án gồm 117 trang gồm: Đặt vấn đề trang Chương 1: Tổng quan 30 trang Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 22 trang Chương 3: Kết bàn luận 60 trang Kết luận trang Kiến nghị trang Luận án có 24 bảng 28 hình vẽ Trong 156 tài liệu tham khảo có 10 tài liệu tiếng Việt 146 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN 1.1 Virút cúm 1.1.1 Đặc điểm chung Virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm nhóm virút: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, virút Thogoto virút Isa Virút cúm A chia thành phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt HA (H1 –H16) NA (N1-N9).Virút cúm B không quan sát thay đổi kháng nguyên bề mặt Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò định việc gắn virút vào tế bào chủ, protein NA có chức phá vỡ liên kết virút tế bào chủ để giải phóng virút khỏi tế bào nhiễm Gemone virút cúm A, B gồm phân đoạn virút cúm C phân đoạn ARN sợi đơn âm, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho protein cấu trúc không cấu trúc: (7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP M1 protein không cấu trúc- nonstructureral protein: NS1, NS2 M2 virút cúm A NB virút cúm B - thấy tế bào nhiễm virút ) 1.1.2 Tính đa dạng vật liệu di truyền tiến hóa virút cúm A Virút cúm A có đối tượng gây nhiễm phong phú: gia cầm (gà, vịt, ngan ), thủy cầm, chim di cư, động vật có vú người nên vật liệu di truyền ARN virút ln chịu tác động vật chủ q trình thâm nhiễm, phiên mã, nhân lên, tích hợp, nảy chồi giải phóng hệ khỏi tế bào chủ Kết trình biến đổi vật liệu di truyền (đột biến mutation), có pha trộn phân đoạn gen virut cúm A khác đồng nhiễm tế bào (trao đổi tích hợp - reassortment) Hệ thay đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) thay đổi lớn kháng ngun (antigenic shift) Đó ngun nhân gây vụ dịch lẻ tẻ đại dịch cúm Những thay đổi vật liệu di truyền virút cúm A động lực cho tiến hóa 1.1.3 Sự tiến hóa virút cúm B Virút cúm B lưu hành người hải cẩu Khác với virút cúm A, tiến hóa virút cúm B xảy với tần suất thấp Đến nay, virút cúm B lưu hành giới chia thành dòng: dòng B/Victoria/2/87-like virus dòng B/Yamagata/16/88-like virus 1.2 Tình hình dịch cúm giới Trong kỷ XX ghi nhận đại dịch cúm người xảy ra: đại dịch cúm “Tây Ban Nha” (1918-1919), đại dịch cúm “Châu Á” (1957), đại dịch cúm “Hồng Kông” (1968) đại dịch cúm “Nga” (1977) Và đặc biệt, cuối kỷ XX đầu kỷ XXI xuất dịch cúm A/H5N1 lây truyền từ gia cầm sang người Dịch xuất tại Hồng Kơng vào tháng 5/1997 Tính đến nay, có 15 quốc gia vùng lãnh thổ xuất virút cúm A/H5N1 người với 436 trường hợp mắc 262 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 60% 1.3 Tình hình dịch cúm Việt Nam 1.3.1 Dịch cúm mùa Tại Việt Nam, hội chứng cúm (ILI) 26 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao bệnh truyền nhiễm gây dịch nước ta Tỷ lệ hội chứng cúm trung bình năm (2001-2005) 2040,4/100.000 dân, đứng đầu 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao Việt Nam Trong năm 2006-2007, tỷ lệ hội chứng cúm/bệnh nhân đến khám điểm giám sát bệnh viện 12,5% tỷ lệ bệnh nhân hội chứng cúm xét nghiệm dương tính với vi rút cúm kỹ thuật RT-PCR 18,4% 1.3.2 Dịch cúm A/H5N1 Trường hợp mắc cúm A/H5N1 người Việt Nam ngày 26 tháng 12 năm 2003 bệnh nhân Hà Nam Kể từ trường hợp mắc (5/2009) Việt Nam có 111 trường hợp xác định nhiễm cúm A/H5N1 với 56 ca tử vong Dịch xảy 36/64 tỉnh/ thành phố 1.4 Đặc điểm lâm sàng sinh bệnh học 1.4.1 Đặc điểm lâm sàng * Cúm mùa: sốt cao > 380C, ho đau họng * Cúm A/H5N1: sốt cao > 380C, ho khan khó thở, X-quang phổi có tổn thương viêm phổi khơng điển hình khơng có chẩn đốn khác 1.4.2 Sinh bệnh học Nhiễm trùng gây virút cúm viêm đường hô hấp Nhiễm trùng gây virút cúm A thường để lại những dấu hiệu sinh bệnh học đường hơ hấp Các chứng viêm quản, khí quản, phế quản cấp xuất với triệu chứng viêm long đường hô hấp phù nề Nhiễm trùng gây virút cúm A/H5N1 bao gồm triệu chứng máu khó đơng, thận hư, tan hạch bạch huyết tổn thương phổi 1.5 Dịch tễ học bệnh cúm 1.5.1 Phương thức thời gian lây truyền Virút cúm lây truyền từ người sang người theo đường hô hấp: q trình nói, ho, khạc, hắt hơi… Virút cúm A/H5N1 lây truyền từ động vật sang người qua đường tiếp xúc trực tiếp gia cầm nhiễm bệnh người ăn thịt gia cầm bị nhiễm bệnh 1.5.2 Nguồn bệnh ổ chứa Virút cúm A có hệ vật chủ rộng rãi Các loài gia cầm hoang dại, vịt loại thuỷ cầm ổ chứa, nơi ẩn náu 16 phân týp HA phân týp NA biết Một loài vật chủ tự nhiên khác virút cúm A động vật có vú người Virút cúm týp B lưu hành rộng rãi người 1.5.2 Tính cảm nhiễm đáp ứng miễn dịch Tính cảm nhiễm: Mọi cá thể nhiễm cúm mắc bệnh cúm Đáp ứng miễn dịch: Trong nhiễm trùng tiên phát, kháng thể đặc hiệu với hemagglutinin IgA, IgM IgG xuất dịch mũi, có vai trò quan trọng ngăn chặn nhiễm virút, hoạt động diễn bề mặt màng nhày máy hô hấp Trong nhiễm virút thứ phát, kháng thể IgG hạn chế nhân lên virút interferon giúp cho hồi phục có hiệu 1.6 Biện pháp dự phòng kiểm sốt bệnh cúm 1.6.1 Thuốc kháng virút * Amantadine Rimantadine (flumadine): ngăn cản xâm nhập virút cách ức chế hoạt động kênh ion M2, ngăn cản “cởi áo” virút Amantadine sử dụng để điều trị bệnh nhân nhiễm cúm A Sự kháng thuốc phản ứng phụ sau dùng thuốc kháng virút vấn đề đáng quan tâm * Oseltamivir (Tamiflu) Zanamivir (Relenza): Ngăn cản giải phóng virút khỏi tế bào nhiễm nhờ ức chế hoạt động enzyme neuraminidase (NA) Việc sử dụng thuốc kháng virút oseltamivir hay amantadine có hạn chế định 1.6.2 Vắc xin cúm Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 B) có nhiều loại khác nhau: vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV) vắc xin bất hoạt công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine) Hiện tại, vắc xin cúm mùa dùng phổ biến vắc xin bất hoạt, đa giá (thành phần vắc xin bao gồm virút cúm A/H1N1, A/H3N2 B) 1.6.2.1 Vắc xin cúm A/H5N1 Hiện nay, vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho người hãng Sanofi Pasteur – Pháp, Novartis - Thụy Sĩ, GlaxoSmithKline – Anh… cấp giấy phép lưu hành Tại Việt Nam, vắc xin cúm A/H5N1 sản xuất quy mô phòng thí nghiệm thử nghiệm lâm sàng 1.7 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 1.7.1 Phương pháp phát kháng nguyên - Thử nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest): kháng thể đơn dòng có que thử kết hợp với kháng nguyên nucleoprotein neuraminidase virút cúm - Phân lập định týp virút: Phân lập virút coi “tiêu chuẩn vàng” giám sát cúm Hiện nay, có hệ thống phân lập TCYTTG khuyến cáo phân lập trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi dòng tế bào thường trực thận chó ( Mardin- Darby canine kidney cells - MDCK) Virút sau phân lập xác định đặc tính kháng nguyên phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) - Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent assay - IFA) 1.7.2 Phương pháp phát vật liệu di truyền - Phương pháp RT-PCR: có khả xác định nhanh nhiễm virút thông qua xác định vật liệu di truyền virút khả phát đoạn ARN đặc hiệu virút cúm mẫu bệnh phẩm lâm sàng - Phương pháp Real time RT-PCR: ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán virút gây bệnh virút cúm A/H5N1, RSV… - Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược (RT-LAMP): khuếch đại ADN điều kiện đẳng nhiệt, thời gian tiến hành phản ứng ngắn - Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence): xác định đặc điểm di truyền học, xây dựng gia hệ sở so sánh gen HA, NA M virút cúm, từ xác định tần suất tiến hóa, đột biến số gen liên quan đến khả tăng độc lực virút, giảm độ nhạy thuốc kháng virút phát yếu tố tiềm tàng trao đổi tích hợp virút cúm A/H5N1 chủng virút cúm lưu hành 1.7.3 Phương pháp phát kháng thể - Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test - HI): xác định kháng thể kháng HA đặc hiệu virút cúm (antiheamagglutinin) kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3, A/H5, B…) - Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization test - MN): phát kháng thể kháng đặc hiệu virút cúm A/H5N1 kháng thể kháng phân týp virút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI khả phát - Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme linked – immusorbent assay - ELISA): sử dụng rộng rãi để phát kháng thể IgG IgM kháng virút cúm Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Định nghĩa ca bệnh * Bệnh nhân viêm đường hô hấp nghi nhiễm virút cúm mùa - Sốt cao 38oC - Đau đầu, đau mỏi người, ho khan, kèm theo viêm long đường hơ hấp * Bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi nhiễm virút cúm A/H5N1 - Sốt cao 380C - Biểu hơ hấp: chảy nước mũi, ho, khò khè, khó thở - XQ phổi có tổn thương - Bạch cầu 5000/mm3 - Có yếu tố dịch tễ liên quan (tiếp xúc với gia cầm ốm, ăn thịt gia cầm ốm…) 2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian địa điểm * Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi nhiễm virút cúm mùa: thu thập năm (2001- 2008) Hà Nội tỉnh Miền Bắc Việt Nam: 15.403 bệnh nhân * Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi nhiễm virút cúm A/H5N1: thu thập năm (6/2003-5/2009) số tỉnh Miền Bắc Việt Nam: 1.739 bệnh nhân 2 Vật liệu 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm: Dịch ngốy họng dịch nội khí quản 2.2.2 Tế bào: Tế bào thường trực thận chó (Mardin- Darby Canine Kidney cells): MDCK (CDC - Mỹ) 2.2.3 Sinh phẩm - Sinh phẩm sử dụng cho phản ứng RT-PCR, Realtime RT-PCR, phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide: Qiagen, Invitrogen ABI 2.3 Phương pháp 2.3.1 Phân lập virút: tế bào MDCK theo thường quy Viện VSDTTƯ 2.3.2 Định týp virút phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI): Phản ứng tiến hành theo thường quy Viện VSDTTƯ 2.3.3 Phương pháp RT-PCR 2.3.4 Phương pháp Real-time RT-PCR 2.3.5 Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence) 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu nghiên cứu nhập, xử lý tính tốn phần mềm Access Sử dụng phương pháp Tukey’s test để đánh giá khác biệt thống kê phương pháp phân lập virút phương pháp RT-PCR Sử dụng phần mềm DNAStar MEGA để xây dựng gia hệ phương pháp Neighbor Joining, TreeExplorer 2.3.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu: Các thông tin cá nhân đối tượng nghiên cứu bảo mật theo điều khoản Hội đồng Y đức Kết nghiên cứu thu phục vụ cho mục đích khoa học bảo vệ sức khỏe cộng đồng, không sử dụng với mục đích khác Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Các vụ dịch cúm xảy Hà Nội Miền Bắc Việt Nam, 2001-2009 3.1.1 Giám sát lưu hành virút cúm mùa Hà Nội, 2001-2005 Từ năm 2001 đến 2005, phòng thí nghiệm Virút Hơ hấp, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương hợp tác với Trường Đại học Niigata, Nhật Bản tiến hành giám sát chủ động lưu hành virút cúm điểm Hà Nội: phòng khám nhi Bệnh viện Nhi Trung Ương, Bệnh viện Bạch Mai phòng khám Nhi tư nhân thuộc quận Thanh Xuân Hai Bà Trưng Phương pháp: phân lập virút tế bào MDCK theo thường quy Viện VSDTTƯ Bảng 3.1 Kết phân lập virút cúm mùa Hà Nội, 2001-2005 Năm Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ (%) phân lập dương tính 2001 2182 74 3,4 2002 1462 13 1,0 2003 1064 32 3,0 2004 1091 32 2,9 2005 1264 39 3,1 Tổng số 7063 190 2,7 10 14 12 10 H1 H3 B T4 /0 T7 /0 T1 0/ 01 T1 /0 T4 /0 T7 /0 T1 0/ 02 T1 /0 T4 /0 T7 /0 T1 0/ 03 T1 /0 T4 /0 T7 /0 T1 0/ 04 T1 /0 T4 /0 T7 /0 T1 0/ 05 T1 /0 Tỷ lệ (+)/số bệnh nhân HCC xét nghiệm Kết giám sát lưu hành virút cúm giai đoạn 2001-2005 Hà Nội cho thấy: virút cúm B virút đóng vai trò gây bệnh năm 2001.Virút cúm A/H3N2 đóng vai trò trội - xuất năm 2002, 2004 2005 năm 2003 virút cúm A/H1N1 (bảng 3.4) Tháng/năm Hình 3.7 Sự lưu hành phân týp virút cúm theo tháng Hà Nội, 2001 – 2005 Virút cúm lưu hành quanh năm với phân týp virút cúm khác (hình 3.7) Đây năm đầu triển khai hệ thống giám sát cúm, tiến hành giám sát phương pháp phân lập virút nên kết phần hạn chế Vì vậy, tháng lưu hành virút cúm lưu hành chủ yếu năm chưa rõ ràng 3.2.2 Căn nguyên vụ dịch cúm mùa Miền Bắc, 2006-2008 Bảng 3.6 Kết xác định lưu hành phân týp virút Miền Bắc Việt Nam 2006 – 2008 phương pháp RT-PCR Năm Cúm A/H1N1 Cúm A/H3N2 Cúm B Tổng số 2006 336 174 516 2007 482+2* 68 556 2008 283+2** 31+1* 227 544 Tổng số 623+2** 519+3* 469 1616 * : đồng nhiễm virút cúm A/H3N2 B **: đồng nhiễm virút cúm A/H1N1 B Virút cúm B xuất năm nghiên cứu, cao năm 2008 Virút cúm A/H1N1 virút cúm A/H3N2 xuất xen kẽ năm: virút cúm A/H1N1 xuất năm 2006 năm 2008, virút cúm A/H3N2 xuất năm 2007 Trong năm có lưu hành xen kẽ virút cúm A virút cúm B Trong đó, nguyên chủ yếu gây dịch năm 11 2006 năm 2008 virút cúm A/H1N1, năm 2007 virút cúm A/H3N2 (bảng 3.6) Tỷ lệ (+)/số bệnh nhân HCC xét nghiệm 60 50 40 A/H1 30 A/H3 B 20 10 T 01 /0 T0 3/ 06 T 05 /0 T 07 /0 T0 9/ 06 T 01 1/ 06 T0 1/ 07 T 03 /0 T0 5/ 07 T 07 /0 T 09 /0 T0 11 /0 T 01 /0 T0 3/ 08 T 05 /0 T0 7/ 08 T 09 /0 T1 1/ 20 08 Tháng/năm Hình 3.9 Sự lưu hành virút cúm mùa theo tháng Miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2008 Virút cúm lưu hành quanh năm (hình 3.9), thường tập trung vào thời điểm cuối mùa xuân (tháng 2-3) mùa hè ( tháng 7-8) Trong đó, virút cúm B nguyên chủ yếu gây vụ dịch vào cuối mùa xuân (2006 2008), virút cúm A/H1N1 A/H3N2 nguyên chủ yếu gây vụ dịch vào mùa hè 3.2.3 Đặc điểm di truyền học virút cúm mùa, 2001-2007 3.2.3.1 Đặc điểm di truyền học virút cúm mùa A/H1N1, 2001-2006 Cây gia hệ HA (35 chủng) NA (20 chủng) virút cúm A/H1N1 xây dựng dựa phương pháp Neigbour Joining (NJ), sử dụng chủng A/New Caledonia/20/99 (H1N1) làm gốc gia hệ Kết phân tích vật liệu di truyền cho thấy gen HA NA virút cúm mùa A/H1N1 chia thành nhóm: I, II, III IV (bảng 3.9) Bảng 3.9 Phân nhóm vật liệu di truyền gen HA NA virút cúm A/H1N1 theo năm, 2001-2006 Năm lưu hành Nhóm Gen HA Gen NA I 2001 – 2002 2001 2002 II 2001, 2002 2003 2002 2003 III 2005 2006 2005 2006 IV 2006 2006 * Đặc điểm di truyền học gen HA virút cúm A/H1N1: So sánh với chủng virút cúm A/H1N1 sử dụng thành phần vắc xin năm 2001-2006 Bắc 12 Bán cầu (A/New Caledonia/20/99), chủng phân lập Miền Bắc Việt Nam có gen HA thuộc nhóm I, II, III, có axit amin thay đổi so với chủng virút sử dụng vắc xin cúm mùa giai đoạn 2001 – 2006 Chủng virút cúm mùa A/H1N1 xuất vào tháng 5/2006 (A/Hanoi/BM344/06) có gen HA thuộc nhóm IV có 12 axit amin thay đổi Chủng virút có độ tương đồng cao (99%) so với chủng A/Solomon Island/3/06 sử dụng cho vắc xin cúm mùa 2007-2008 * Đặc điểm di truyền học gen NA virút cúm A/H1N1: Gen NA virút cúm mùa A/H1N1 giai đoạn 2001-2006 phân tách thành nhóm I, II, III IV Trong nhóm I bao gồm chủng virút lưu hành năm 2001 2002 có độ tương đồng cao với chủng virút A/New York/241/01 Các chủng virút lưu hành năm 2003 tạo thành nhóm độc lập - nhóm II, có độ tương đồng cao với chủng A/Hanoi/1863/01 Tại nhóm III - nhóm bao gồm chủng virút lưu hành năm 2005 2006, tập trung thành nhóm, có tách thành nhánh nhỏ theo năm lưu hành gen HA NA Tuy nhóm hình thành q trình thiết lập gia hệ nhóm I, II II có xuất phát điểm chung, có độ tương đồng cao gen HA NA nhóm IV phân tách rõ ràng kết thay đổi đặc tính kháng nguyên virút cúm A/H1N1 bắt đầu Như vậy, virút cúm mùa A/H1N1 lưu hành Hà nội từ năm 2001-2007 có kiểu hình gen HA NA tương đối ổn định, thay đổi, biến đổi từ chủng A/New Caledonia/20/99 (2001-2006) - A/Solomon Island/3/06 (2007-2008) Gen HA gen NA biến đổi độc lập theo trật tự liên tiếp (bảng 3.9) 3.2.3.2 Đặc điểm di truyền học virút cúm A/H3N2, 2001-2007 Cây gia hệ HA NA virút cúm A/H3N2 xây dựng dựa trênphương pháp Neigbour Joining (NJ), sử dụng chủng A/Moscow/10/99 (H3N2) làm gốc gia hệ Gen HA virút cúm mùa A/H3N2 chia thành nhóm: I, II, II IV; gen NA chia thành nhóm: I II (bảng 3.10) Bảng 3.10 Phân nhóm vật liệu di truyền gen HA NA virút A/H3N2 theo năm, 2001 - 2006 Năm lưu hành Nhóm Gen HA Gen NA I 2002 2002 – 2003 II 2003 2004-2005 IIIa, IIIb 2003-2004, 2005 IV 2005 * Đặc điểm di truyền học gen HA virút cúm A/H3N2: Hình ảnh gia hệ HA virút cúm A/H3N2 lưu hành Miền Bắc Việt Nam mô tả rõ 13 tiến hóa vật liệu di truyền phân týp Các nhóm virút cúm A/H3N2 hình thành giai đoạn có độ phân tách rõ rệt, liên quan chặt chẽ với năm lưu hành virút: nhóm I, II, III IV Đặc biệt, nhóm III chia thành nhóm phụ IIIa IIIb, nhóm có độ tương đồng cao, nhóm IIIb thể chiều hướng phân tách thành nhóm IV dường gốc nhóm IV Kết gợi ý tiến hóa virút cúm A/H3N2 Miền Bắc Việt Nam q trình tự tiến hóa cá thể virút, khơng phụ thuộc nhiều vào yếu tố bên ngồi (tích hợp gen virút cúm khác) Virút cúm A/H3N2 lưu hành Việt nam năm 2001-2006 thực tiến triển theo trình tự từ chủng A/Panama/2007/99 (2001-2002) đến A/Fujian/411/02 (2003-2004) A/Wincosin/67/05 (2005) Năm 2007, chúng tơi tiến hành phân tích virút cúm A/H3N2 lưu hành ba khu vực Miền Bắc, Miền Trung Miền Nam để tìm hiểu ảnh hưởng yếu tố địa lý Kết gia hệ gen HA cho thấy có tương đồng lớn virút cúm A/H3N2 lưu hành Miền Trung Miền Nam Trong virút cúm A/H3N2 lưu hành Miền Bắc tập trung vào nhóm riêng biệt khơng có đan xen với virút phân lập Miền Trung Miền Nam Như vậy, tiến hóa virút cúm A/H3N2 Việt Nam năm 2007 có khả chịu ảnh hưởng yếu tố địa lý nghiên cứu cần phải tiến hành tiếp tục vào năm * Đặc điểm di truyền học gen NA virút cúm A/H3N2: Gen NA virút cúm A/H3N2 lưu hành Việt nam giai đoạn 2001-2007 tập trung vào nhóm : - Nhóm I: gồm virút lưu hành năm 2002-2003 - Nhóm II : gồm virút lưu hành năm 2004-2005 * Đặc điểm di truyền học virút cúm mùa lưu hành Miền Bắc Việt Nam năm 2001-2007 - Tính đa dạng di truyền virút cúm A/H1N1 thấp virút cúm A/H3N2 Trong năm nghiên cứu, virút cúm A/H1N1 có lần thay đổi cấu trúc di truyền ( từ A/New Caledonia/20/99 sang A/Solomon Islands/3/06) cúm A/H3N2 thay đổi lần (A/Panama/2007/99 (2001-2002) A/Fujian/411/02 (2002- 2003) - A/Wincosin/67/05 (2006-2007) đến A/Brisbane/10/07 - Sự đa dạng di truyền gen HA phổ biến gen NA phân týp A/H1N1 A/H3N2 Miền Bắc Việt Nam - Tại vùng địa lý khác (Miền Bắc, Miền Trung Miền Nam), đa dạng di truyền virút cúm A/H3N2 quan sát 3.2.4 Đặc tính kháng nguyên virút cúm mùa, 2001-2008 Virút cúm A/H1N1 xuất vào năm 2003, 2006 2008 đặc tính kháng nguyên chủng virút cúm mùa A/H1N1 thay đổi năm (2001-2006), giống chủng A/New Caledonia/20/99 (bảng 3.13) Sau năm gián đoạn (2007) đến năm 2008, chủng virút cúm A/H1N1 xuất trở lại Miền 14 Bắc Việt Nam với đặc tính kháng nguyên mới, tương tự chủng A/Brisbane/59/07 Trong năm quan sát, đặc tính kháng nguyên chủng virút cúm mùa A/H3N2 lưu hành Miền Bắc Việt Nam nhiều lần thay đổi từ A/Panama/2007/99 (2001-2002) thành A/Fujian/411/02 (2003), đến A/Wincosin/67/05 (2005) A/Brisbane/10/07 (2007) Hệ thay đổi đặc tính kháng nguyên từ A/Panama/2007/99 (2001-2002) thành A/Fujian/411/02 (2003) vụ dịch lớn ghi nhận nước Châu Á, Mỹ, Nam Phi… năm 2003-2004 Kháng nguyên virút cúm B lưu hành giới chia thành dòng: dòng Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses) dòng Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) Đặc tính kháng nguyên virút cúm B lưu hành Việt Nam nghiên cứu xác định thuộc dòng Sự hiện dòng kháng nguyên Yamagata xác định Miền Bắc Việt Nam vào năm 2001 2005, dòng Victoria vào năm 2003, 2004, 2006-2008 Bảng 3.13 Đặc tính kháng nguyên virút cúm mùa Miền Bắc Việt Nam phương pháp HI, 2001-2008 Năm Đặc tính kháng nguyên Virút cúm A/H1N1 Virút cúm A/H3N2 2001 A/New Caledonia/20/99 A/Panama/2007/99 Virút cúm B B/Yamanashi/166/98 B/Johannesburg/5/99 (Yamagata lineage) 2002 A/New Caledonia/20/99 A/Panama/2007/99 2003 A/New Caledonia/20/99 A/Panama/2007/99 A/Fujian/411/02 2004 A/Panama/2007/99 2005 A/New Caledonia/20/99 A/Wincosin/67/05 2006 A/New Caledonia/20/99 2007 A/Brisbane/10/07 2008 A/Brisbane/59/07 A/Brisbane/10/07 B/HongKong/330/01 (Victoria lineage) B/Sichuan/379/99 (Victoria lineage) B/Shanghai/361/02 B/Frolida/0/04 (Yamagata lineage) B/Ohio/01/05 (Victoria lineage) B/Ohio/01/05 (Victoria lineage) B/Ohio/01/05 (Victoria lineage) Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy đặc tính kháng nguyên virút cúm mùa lưu hành Việt Nam nói chung Miền Bắc nói riêng tương tự với chủng sử dụng cho sản xuất vắc xin giai đoạn 2001- 2008 Điều 15 có nghĩa lớn việc phát triển sử dụng vắc xin cúm Việt Nam tương lai 3.3 CĂN NGUYÊN GÂY VIÊM PHỔI NẶNG DO VIRÚT CÚM A/H5N1 TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 6/2003-5/2009 3.3.1 Một số đặc điểm chung 3.3.1.1 Tuổi giới Trong số 83 trường hợp nhiễm virút cúm A/H5N1 Miền Bắc có 46 bệnh nhân nam (chiếm 55,4%) 37 bệnh nhân nữ (chiếm 44,6 %) Tuổi nhiễm virút cúm A/H5N1 xác định từ tháng đến 81 tuổi, tuổi trung bình 28 (clade 2), nhóm tuổi từ 21 - 30 tuổi chiếm tỷ lệ cao (26,5%) Đây đối tượng lứa tuổi lao động tần suất tiếp xúc trực tiếp với yếu tố nguy cao so với trẻ nhỏ (60 tuổi) 3.3.1.2 Tỷ lệ tử vong/ mắc Bảng 3.17 Số tử vong/ mắc bệnh nhân nhiễm virút cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, 6/2003 - 5/2009 Năm Số mắc Số tử vong Tỷ lệ % 2003 3 100 2004 11 72,7 2005 52 10 19,2 2007 62,5 2008 2009 83,3 3 100 (31/5/2009) Tổng số 83 34 41,0 Tính đến 31/5/2009, Miền Bắc có 83 trường hợp nhiễm, 34 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 41% (bảng 3.17) Năm 2003 năm 2009 có tỷ lệ tử vong cao (100%) Tỷ lệ tử vong phụ thuộc vào độc lực virút hệ thống miễn dịch thể Kết nghiên cứu vật liệu di truyền virút cúm A/H5N1 lưu hành Việt Nam cho thấy: virút lưu hành Việt Nam từ năm 6/2003-5/2009 có trình tự chuỗi axit amin vị trí phân tách HA1 HA2 RERRRKKRGL RERR*KKRGL RERRR*KRGL quy định độc lực chủng virút cúm gia cầm A/H5N1 cho dù tiến hóa virút từ clade sang clade 2.3 ghi nhận Một kết ghi nhận nghiên cứu không phát trường hợp nhiễm virút cúm A/H5N1 người năm 2006 Điều giải thích chiến dịch tiêm vắc xin bất hoạt H5N1 H5N2 cho gia cầm vào tháng 8/2005 Việt Nam có hiệu định 3.3.1.3 Sự phân bố trường hợp nhiễm virút cúm A/H5N1 theo tháng Các trường hợp nhiễm virút cúm A/H5N1 xuất tập trung nhiều vào mùa đông - xuân (tháng 12 đến tháng năm tiếp theo) Tại Miền Bắc, thời gian 16 nhiệt độ thấp (khoảng 12-18oC) độ ẩm tương đối cao, điều kiện thích hợp cho virút cúm gia cầm A/H5N1 phát triển So sánh với tình hình dịch cúm gia cầm thời điểm cho thấy tất đỉnh điểm cúm gia cầm giai đoạn trước sau Tết, thời điểm mật độ gia cầm tăng mạnh, khả khuyếch tán virút đàn gia cầm cao khả lây bệnh cho người ghi nhận 3.3.2 Phân lập virút cúm A/H5N1 phương pháp gây nhiễm tế bào MDCK (BSL 3) Bảng 3.19 Kết phân lập virút cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, 6/2003- 5/2009 Năm Số mẫu dương Số mẫu phân Số mẫu Tỷ lệ % tính RT-PCR lập virút dương tính 2003 3 100 2004 11 11 45,5 2005 52 15 33,3 2007 8 75,0 2008 2009 6 100 3 100 (31/5/2009) Tổng số 83 46 28 60,9 Trong năm (6/2003 – 5/2009), tổng số 46 mẫu phân lập có 28 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 60,9% (bảng 3.19) Năm 2003, 2008 2009 có tỷ lệ phân lập virút cúm A/H5N1 đạt 100% Kết phân lập phụ thuộc vào số yếu tố như: thời điểm lấy mẫu, loại bệnh phẩm, chất lượng bệnh phẩm, điều kiện bảo quản vận chuyển mẫu 3.3.3 Đặc tính tiến hóa virút cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, 6/2003 – 5/2009 Chúng tơi tiến hành phân tích 25 chủng virút cúm A/H5N1 phân lập từ năm 6/2003-5/2009 để đánh giá đặc tính tiến hóa virút: • Phân tích trình tự chuỗi nucleotide, xây dựng gia hệ HA vàNA • Xác định thay đổi axit amin liên quan đến độc lực virút, trình thích ứng virút cúm A/H5N1 từ gia cầm sang người độ nhạy cảm virút với thuốc kháng virút: Oseltamivir 3.3.3.1 Đặc điểm di truyền học gen HA * Cây gia hệ gen HA: (hình 3.19) Tại Miền Bắc Việt Nam, đặc điểm di truyền gen HA virút cúm A/H5N1 lưu hành 6/2003- 5/2009 chia thành clade tương đương với kháng nguyên khác nhau: clade1 clade Trong đó: 17 23 A/duck/NCVD76/2007 A/duck/NCVD91/2007 A/duck/NCVD86/2007 A/Vie tNam/HN31388/2007 A/chicken/NCVD84/2007 A/Vie tNam/HN31244/2007 A/Vie tNam/HN31394/2008 13 61 A/VietNam/HN31413/2008 A/VietNa m/HN31461/2008 18 A/Vie tNam/HN31242/2007 A/Vie tNam/HN31412/2008 30 A/VietNa m/HN31239/2007 A/chicken/NCVD89/2007 A/duck/NCVD92/2007 56 A/Vie tnam/HN31641/2009 A/chicken/NCVD74/2007 42 A/duck/NCVD75/2007 68 A/Vie tnam/HN31312/2007 80 Cla d e 2.3 A/VietNam/HN31323/2007 A/goose/Yunnan/1136/2006 18 A/duck/Hunan/856/2006 48 A/goose/Shantou/18442/2005 47 A/Vietnam/HN31676/2009 A/Shenzhen/406H/2006 A/Duck/Laos/3295/2006 14 A/Anhui/1/2005 66 13 V a cc ine A/duck/NCVD79/2007 70 A/chicken/Guangxi/463/2006 Cla d e A/goose/Guiyang/765/2006 30 A/VietNam/HN30850/2005 A/goose/Guiyang/1794/2006 A/chicken/Hong Kong/947/2006 A/duck/Guangxi/150/2006 33 A/duck/Guangxi/5075/2005 52 A/VietNam/HN31432/2008 86 51 A/Vietna m/HN31604/2009 A/duck/Guiyang/3242/2005 A/chicken/Guiyang/3570/2005 93 A/goose/Guiyang/4180/2005 69 Cla d e 2.3 36 A/goose/Guiyang/3422/2005 A/duck/Guangxi/380/2004 27 A/pheasant/Shantou/2239/2006 A/chicken/Hunan/999/2005 63 A/Dk/HN/303/2004 23 A/chicken/Guangxi/2461/2004 46 A/Chicken/Shantou/810/05 36 A/Duck/Vietnam/568/2005 93 61 A/goose/Guangxi/3316/2005 Cla d e 2.3.2 A/Goose/Guangxi/3017/2005 33 A/duck/Guangxi/793/2005 61 A/chicken/Guangxi/604/2005 A/duck/Hunan/1265/2005 10 A/Duck/China/E319.2/03 18 A/grey heron/Hong Kong/728/2004 47 A/grey heron/Hong Kong/837/2004 45 A/Ck/HK/YU324/2003 A/Ck/Indonesia/BL/2003 Cla d e 2.1 A/chicken/Ngawi/BPPV4/2004 66 A/chicken/Sragen/BPPV4/2003 98 A/Chicken/Yunnan/493/05 A/Chicken/Yunnan/447/05 A/Dk/YN/6445/2003 49 Cla d e 2.4 A/Ck/YN/374/2004 95 A/Dk/YN/6255/2003 A/Ck/YN/115/2004 A/VietNam/HN31203/2007 13 11 A/Ck/Indonesia/PA/2003 Cla d e A/chicken/Pekalongan/BPPV4/2003 12 A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 67 43 A/Brown-headed Gull/Qinghai/3/05 32 98 A/Guinea fowl/Shantou/1341/2006 Cla d e 2.2 A/migratory duck/Jiangxi/2136/2005 A/migratory duck/Jiangxi/2295/2005 42 A/chicken/Korea/es/2003 76 27 A/chicken/Yamaguchi/7/2004 A/Ck/Shantou/4231/2003 47 Cla d e A/goose/Shantou/239/2006 49 89 A/goose/Shantou/2086/2006 A/Chicken/VietNam/1/2004 24 A/VietNa m/JPHN/178/2004 A/Vietnam/HN31673/2009 43 44 29 A/VietNam/HN1194/2004 A/VietNa m/HN1203/2004 47 27 A/VietNa m/HN30212/2004 Cla d e A/VietNa m/JPHN/30321/2005 A/VietNa m/HN30408/2005 11 A/Vie tNam/HN3062/2004 11 30 A/VietNam/JPNH/14/2005 A/VietNa m/JPHN/4207/2005 A/Goose/Guangdong/1/96 A/HongKong/97/98 88 A/HongKong/156/97 51 A/Chicken/HongKong/220/97 14 A/Hong Kong/483/97 33 A/Chicken/HongKong/728/97 Cla d e 0.005 Hình 3.19 Cây gia hệ gen HA (455 axit amin) virút cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, 2003-2009 18 + Clade 1: bao gồm chủng virút phân lập Miền Bắc Việt Nam từ 12/2003 đến 7/2005 Các virút clade có độ tương đồng cao (99,799,9%) so với chủng dự tuyển vắc xin A/Vietnam/1194/04 Chủng virút A/Vietnam/HN31673/2009 phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân tỉnh Đồng Tháp tháng 3/2009 thuộc clade + Clade 2: bao gồm 15 chủng virút cúm A/H5N1 phân lập Miền Bắc Việt Nam tháng 10/2005 (chủng xuất Việt Nam A/HN30850/2005) đến (tháng 5/2009) Trong clade 2, virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Bắc Việt Nam tập trung chủ yếu (98,9% - 99,7 %) độ tương đồng với chủng dự tuyển vắc xin cho nhánh 2.3 (A/Anhui/1/2005) đạt < 98% Trên gia hệ nhánh 2.3.4, chủng virút cúm A/H5N1 lưu hành năm 2007-2008 có độ tương đồng cao, chủng virút phân lập năm 2009 (A/HN 31604/2009) tách thành nhánh với chủng phân lập sau năm 2008 (A/HN31432/2009) Thông tin phù hợp với nhận định tần suất tiến hóa virút cúm A/H5N1 thuộc clade dường nhanh so với clade Phần lớn virút lưu hành Miền Bắc Việt Nam thuộc clade 2.3.4 clade với virút lưu hành Miền Nam Trung Quốc thời điểm Cây gia hệ gen HA nghiên cứu cho thấy rõ ràng đặc điểm lưu hành virút cúm A/H5N1 Việt Nam: virút lưu hành Việt Nam năm đầu dịch (12/2003- 10/2005) thuộc clade 1, chung nhóm với virút lưu hành khu vực Đông Nam Châu Á như: Lào, Campuchia, Thái Lan Từ năm 2005, virút lưu hành Miền Bắc Việt Nam chuyển sang clade 2.3 phân tách rõ ràng thành 2.3.4 vào năm 2007 đến 2009 Từ năm 2005 đến tháng 3/2009, khơng có báo cáo nhiễm virút cúm A/H5N1 người Miền Nam Việt Nam Tuy nhiên, đến tháng 3/2009 Đồng Tháp ghi nhận trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 virút phân lập từ bệnh nhân xác định thuộc clade Kết phù hợp với phân tích virút lưu hành gia cầm Miền Nam Việt Nam thời điểm nhóm với virút lưu hành Thái Lan, Campuchia năm 2007-2008 Sự lưu hành đồng thời nhiều clade gia cầm đưa gợi ý virút cúm A/H5N1 xâm nhập từ Miền Nam Trung Quốc vào Việt Nam, nơi mà virút clade 2.3.4 lưu hành trước Kết cho thấy, lưu hành virút cúm A/H5N1 Việt Nam có khác biệt rõ rệt miền: Bắc Nam Không giống giả thuyết vào năm 2003-2004 cho virút cúm gia cầm A/H5N1 lan truyền tới vùng miền khác giới thông qua tập quán di cư chim hoang dại Các thông tin thu gần cho thấy: đặc điểm di truyền học virút cúm gia cầm dường khoanh vùng rõ ràng : + Clade : tập trung nước Campuchia, Thái Lan + Clade 2.1 : tập trung Indonesia + Clade 2.2 : tập trung nước Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập… 19 + Clade 2.3 : tập trung Miền Nam Trung Quốc; Miền Bắc Việt Nam… Như vậy, tiến hóa lan truyền virút cúm A/H5N1 dường khu vực mà lưu hành khơng phụ thuộc vào trao đổi tích hợp với virút chim di cư mang đến Giả thuyết phù hợp với thực tế Việt Nam phân tích vật liệu di truyền virút cúm A/H5N1 lưu hành gia cầm từ năm 2001 -2007 Nghiên cứu Xiu cs cho thấy có kiểu gen (genotype) tương đương với clade khác lưu hành Việt Nam, kiểu gen ( VN3, VN6, VN7, VN8, VN9) phát năm 2007 Phân tích gen HA cho thấy VN6 VN thuộc clade 2.3.4 đặc biệt VN9 phát có trao đổi tích hợp clade clade * Vị trí axit amin protein HA virút cúm gia cầm A/H5N1 liên quan đến việc gắn với thụ thể tế bào chủ Virút cúm A/H5N1 mang đặc tính virút cúm gia cầm, có lực bám vào thụ thể galactose tế bào chủ vị trí 2.3 (SAα- 2,3 Gal), virút cúm người (cúm theo mùa A/H1N1, A/H3N2…) có lực mạnh bám vào thụ thể galactose tế bào chủ vị trí 2.6 (SAα- 2,6 Gal) Đặc tính yếu tố hạn chế khả lây truyền virút cúm gia cầm A/H5N1 sang người Một số axit amin gen HA xác định có liên quan đến kiểu gắn bám vào thụ thể tế bào chủ virút cúm A/H5N1 axit amin vị trí Gly139Arg, Asn182Lys, Gln192Arg, Asn193Lys Ser223Asn Khi đột biến vị trí xuất ảnh hưởng đến thay đổi kiểu gắn bám virút cúm A/H5N1 từ (SAα- 2,3 Gal) thành (SAα- 2,6 Gal) hệ virút cúm gia cầm có khả hoạt động giống virút cúm mùa tăng khả gây bệnh cho người A/Chicken/Scotland/1959 OUTGRO A/VietNam/HN1194/2004 (1) A/VietNam/HN1203/2004 (1) A/VietNam/HN30408/2005 (1) A/VietNam/HN3062/2004 (1) A/VietNam/HN30212/2004 (1) A/VietNam/JPNH/14/2005 (1) A/VietNam/JPHN/178/2004 (1) A/VietNam/JPHN/4207/2005 (1) A/VietNam/JPHN/30321/2005 (1) A/Vietnam/HN31673/2009 (1) A/VietNam/HN30850/2005 (2.3.4) A/VietNam/HN31203/2007 (2.1) A/VietNam/HN31239/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31242/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31244/2007 (2.3.4) A/Vietnam/HN31312/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31323/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31388/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31394/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31412/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31413/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31461/2008 (2.3.4) A/Vietnam/HN31604/2009 (2.3.4) A/Vietnam/HN31641/2009 (2.3.4) A/Vietnam/HN31676/2009 (2.3.4) 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | QIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYIGRSSFFRNVVWLIKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYVSVGTSTLNQRSIPEIATRPKVNGQSG K E L Q.K NST .V .I LV.R S K E L Q.K NST .V .I LV.R S K E L Q.K NST .V K I LV.R S K E L Q.K NST .V .I LV.R S K E L Q.K NST .V LV.R S K E L A Q.K NST .VM I LV.R S K E L Q.K NST .VM I LV.R S K E L Q.K NST .VM I LV.R S K E L Q .NST .VM R I LV.R S.I K P E L A Q.K NST D VM I LT.R S K E Q.TP N.T S I LV.K S K E L.SP NST K V R I.I LV.K S K E Q.VP N.T S I LV.K S K E Q.VP N.T S I LV.K S K E Q.VP N.T S I LV.K S K E Q.VP N.T .I LV.R S K E Q.VP N.T .I LV.K S K V E Q.VP N.T S I LV.K S KN E Q.TP N.T S I LV.K S K E Q.MP N.T S I LV.K S K E QXVP N.T S I LV.K S K E QXVP N.T S I LV.T S R K E L Q.TP N.T S E I .I LV.K S K E Q.VP N.T S T .I I LV.K S K E Q.TP N.T S V S T M LV.K S Hình 3.21 Các vị trí axit amin protein HA virút cúm gia cầm A/H5N1 liên quan đến việc gắn với thụ thể tế bào chủ Miền Bắc Việt Nam, 6/2006 – 5/2009 Kết phân tích nghiên cứu cho thấy axit amin vị trí liên quan đến kiểu gắn bám virút cúm A/H5N1 lưu hành Việt 20 Nam (bao gồm clade 2) không thay đổi Điều chứng tỏ virút lực tế bào gia cầm vị trí (SAα- 2,3 Gal) * Các axit amin protein HA liên quan đến độc lực virút cúm A/H5N1 Virút cúm gia cầm A/H5N1 chia thành loại: virút có độc lực cao (HPAI) virút có độc lực thấp (LPAI) Sự phân chia dựa vào khả gây chết gà hàng loạt virút Nghiên cứu khác loại virút này, Steinhauer DA (1999) cho thấy vùng phân tách HA1 HA2 virút cúm A/H5N1 có độc lực cao (HPAI) có thêm trình tự axit amin RERRRKKRGL (tại vị trí 339-348) virút cúm A/H5N1 có độc lực thấp (LPAI) khơng có trình tự Các axit amin giúp protein HA phân tách dễ dàng thành tiểu protein HA1 HA2 tác động enzyme furin có biểu mơ đường hơ hấp, ruột,… có khả lây nhiễm tới nhiều quan khác nhau: phổi, ruột, lách… Và nguyên nhân gây suy đa phủ tạng dẫn đến tử vong Trong virút cúm A/H5N1 độc lực thấp (LPAI) sử dụng enzyme tế bào biểu mô đường hô hấp trypsin để phân tách protein HA, hạn chế khả lây nhiễm gây bệnh cho quan đường hô hấp ruột A/VietNam/HN1194/2004 A/VietNam/HN1203/2004 A/VietNam/HN3062/2004 A/VietNam/JPHN/178/2004 A/VietNam/HN30212/2004 A/VietNam/HN30408/2005 A/VietNam/JPNH/14/2005 A/VietNam/JPHN/4207/2005 A/VietNam/JPHN/30321/2005 (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERR-KKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPLHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW Hình 3.22 Trình tự axit amin vùng phân tách HA1 HA2 gen HA virút cúm A/H5N1 thuộc clade (6/2003 - 7/2005) A/Anhui/1/2005 (2.3.4)Vaccine A/VietNam/HN30850/2005 (2.3.4) A/VietNam/HN31203/2007 (2.1) A/VietNam/HN31239/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31242/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31244/2007 (2.3.4) A/Vietnam/HN31312/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31323/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31388/2007 (2.3.4) A/VietNam/HN31394/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31412/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31413/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31432/2008 (2.3.4) A/VietNam/HN31461/2008 (2.3.4) A/Vietnam/HN31604/2009 (2.3.4) A/Vietnam/HN31641/2009 (2.3.4) A/Vietnam/HN31676/2009 (2.3.4) 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLREKRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLREKRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRR-KRGLFGAIAGFIEGGW Hình 3.23 Trình tự axit amin vùng phân tách HA1 HA2 gen HA virút cúm A/H5N1 thuộc clade (10/2005 - 5/2009) Trong nghiên cứu chúng tôi, virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Bắc Việt Nam từ 6/2003 đến 5/2009 có axit amin dư khu vực 21 phân tách HA số chủng xác định có thiếu hụt axit amin Arginin (R) vị trí 343 (RERR*KKRGL) (hình 3.22) axit amin Lysine (K) vị trí 344 (RERRR*KRGL) (hình 3.23) Như vậy, virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Bắc Việt Nam virút có độc lực cao Kết phù hợp với nghiên cứu virút cúm A/H5N1 lưu hành gia cầm Việt Nam thời điểm * Sự tương đồng axit amin protein HA chủng virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Bắc Việt Nam chủng dự tuyển vắc xin Tại Việt Nam, đến thời điểm có clade khác virút cúm A/H5N1 xuất việc theo dõi tương đồng mặt kháng ngun thơng qua phân tích trình tự chuỗi axit amin protein HA quan trọng Kết quan sát tần suất thay đổi kháng ngun mà đánh giá hiệu vắc xin phát triển chủng virút TCYTTG khuyến cáo + Chủng vắc xin dự tuyển cho virút cúm A/H5N1 thuộc clade 1: Chủng A/Vietnam/1194/04 sử dụng làm chủng chuẩn để so sánh Trong số chủng virút cúm A/H5N1 thuộc clade phân lập từ bệnh nhân năm 20032005 Miền Bắc Việt Nam cho thấy tương đồng cao chủng virút cúm A/H5N1 thuộc clade với chủng dự tuyển vắc xin, số axit amin thay đổi tối đa (A/VietNam/JPHN/30321/2005) tổng số 455 axit amin xác định protein HA + Chủng vắc xin dự tuyển cho clade 2: Chủng virút A/Anhui/01/2005 giới thiệu chủng vắc xin dự tuyển cho clade 2.3 So sánh với chủng này, virút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3 lưu hành Miền Bắc Việt Nam năm 2007 2008 có thay đổi 5-10 axit amin protein HA (A/VietNam/HN31203/2007), chủng virút A/HN30850/2005 (chủng xác định thuộc clade 2.3) có axit amin thay đổi so với chủng dự tuyển vắc xin Kết phù hợp với việc phân tích tiến hóa virút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4 Miền Bắc Việt Nam Trung Quốc Sự thay đổi axit amin protein HA với chiều hướng tăng dần theo thời gian thách thức việc phát triển vắc xin có hiệu lực bảo vệ cao để phòng chống virút cúm gia cầm A/H5N1 3.3.3.2 Đặc điểm di truyền học gen NA * Cây gia hệ gen NA: (hình 3.24) Gen NA virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Bắc từ năm 6/20035/2009 chia thành clade tương tự gen HA, clade clade Tuy nhiên, không giống gen HA, clade gen NA nhánh nhỏ phân tách không rõ ràng có độ tương đồng clade cao Gen NA virút thuộc clade (lưu hành từ 2003-2005) có trình tự nucleotide tương đồng với chủng gốc A/China/GD/01/2006 99,3% virút thuộc clade (lưu hành năm 2007- 2008) có trình tự nucleotide tương đồng với 22 A/chicken/Korea/es/2003 A/Ck/ST/4231/2003 A/goose/Guiyang/1794/2006 A/Ck/YN/374/2004 A/Ck/YN/115/2004 A/Dk/YN/6445/2003 A/chicken/Yamaguchi/7/2004 A/chicken/Sragen/BPPV4/2003 A/Chicken/Yunnan/493/05 A/chicken/Ngawi/BPPV4/2004 A/duck/China/E319-2/03 A/Chicken/Shantou/810/05 A/duck/Hunan/856/2006 A/Dk/YN/6255/2003 A/chicken/Pekalongan/BPPV4/2003 A/Ck/Indonesia/BL/2003 A/Ck/Indonesia/PA/2003 A/pheasant/Shantou/2239/2006 A/Ck/HK/YU324/2003 A/Chicken/Yunnan/447/05 A/goose/Guiyang/765/2006 A/Anhui/1/2005 A/duck/Laos/3295/2006 A/goose/Shantou/18442/2005 A/Goose/Guangdong/1/96 71 A/chicken/Hong Kong/947/2006 A/Shenzhen/406H/2006 61 A/duck/Guangxi/5075/2005 A/VietNam/HN31432/2008 Clade A/duck/Guangxi/150/2006 A/goose/Guangxi/3017/2005 A/goose/Guiyang/3422/2005 A/chicken/Guiyang/3570/2005 A/duck/Guangxi/380/2004 A/goose/Guiyang/4180/2005 A/duck/Hunan/1265/2005 A/chicken/Guangxi/2461/2004 A/chicken/Hunan/999/2005 A/duck/Vietnam/568/2005 A/VietNam/HN31604/2009 60 A/Vietnam/HN31641/2009 A/VietNam/HN31209/2007 A/VietNam/HN31412/2008 A/duck/Guangxi/793/2005 79 A/chicken/Guangxi/604/2005 A/VietNam/HN31323/2007 A/goose/Guangxi/3316/2005 A/VietNam/HN31394/2008 A/VietNam/HN31388/2007 A/Dk/HN/303/2004 A/VietNam/HN31203/2007 A/chicken/Guangxi/463/2006 A/VietNam/HN31312/2007 A/VietNam/HN31461/2008 A/VietNam/HN31239/2007 A/VietNam/HN31244/2007 A/VietNam/HN31242/2007 A/VietNam/HN31413/2008 A/migratory duck/Jiangxi/2295/2005 A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 79 A/migratory duck/Jiangxi/2136/2005 A/Brown-headed Gull/Qinghai/3/05 A/Guinea fowl/Shantou/1341/2006 A/Vietnam/HN31673/2009 A/Vietnam/HN3062/2004 Clade A/Vietnam/HN1203/2004 A/Vietnam/HN30408/2005 A/Vietnam/HN1194/2004 A/Vietnam/JPHN178/2004 A/Vietnam/JPHN14/2005 A/Vietnam/JPHN4207/2005 A/Chicken/HongKong/728/97 A/HongKong/483/97 98 A/HongKong/97/98 Clade 63 A/Chicken/HongKong/220/97 A/HongKong/156/97 A/chicken/Scotland/1959 0.002 Hình 3.24 Cây gia hệ gen NA (379 axit amin) virút cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, 6/2003-5/2009 23 chủng gốc 98,2% Cũng tương tự gen HA, gia hệ gen NA có chủng virút cúm A/H5N1 lưu hành Miền Nam Việt Nam (A/VN/HN31673/2009) vào tháng 3/2009 thuộc clade Trên protein NA, chúng tơi tập trung vào phân tích thay đổi axit amin liên quan đến giảm độ nhạy kháng thuốc kháng virút Oseltamivir * Kết xác định đột biến gen NA liên quan đến kháng giảm độ nhạy thuốc kháng virút cúm A/H5N1: Oseltamivir (Tamiflu) Kết phân tích vật liệu di truyền protein NA virút cúm A/H5N1 từ 6/2003 đến 5/2009 Miền Bắc Việt Nam cho thấy phát đột biến axit amin vị trí H275Y chủng virút cúm A/Vietnam/HN30408/2005 thuộc clade 1, không phát đột biến vị trí H275Y N295S virút cúm A/H5N1 thuộc clade Tuy nhiên, xác định đột biến axit amin vị trí I117V virút cúm A/H5N1 thuộc clade 2: chủng virút năm 2007 (A/Vietnam/HN31209/2007) chủng virút năm 2008 ( A/Vietnam/HN31412/2008) Một số công bố gần khẳng định đột biến axit amin vị trí 117, 275 295 thực gây nên tượng giảm độ nhạy kháng thuốc Oseltamivir virút cúm A (A/H1N1, A/H1N1s A/H5N1) Kết nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng vắc xin cúm A/H5N1 chưa phổ biến, thuốc kháng virút Oseltamivir dường phương tiện sử dụng điều trị phòng chống nhiễm virút cúm Tuy nhiên, kết nghiên cứu cần phát triển sâu tương lai cần có phối hợp với nghiên cứu gia cầm để giám sát đột biến tự nhiên (không chịu áp lực trực tiếp Oseltamivir) gia cầm có liên quan đến tượng KẾT LUẬN Về nguyên vụ dịch cúm Miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2001-2009 - Virút cúm A/H1N1 nguyên chủ yếu gây dịch năm: 2003, 2006 2008 - Virút cúm A/H3N2 nguyên chủ yếu gây dịch năm: 2002, 2004, 2005 2007 - Virút cúm B nguyên chủ yếu gây dịch năm 2001 - Virút cúm A/H5N1 nguyên gây viêm phổi nặng từ tháng 12/2003 đến tháng 5/2009 Virút cúm mùa lưu hành quanh năm, thường tập trung vào thời điểm cuối mùa xuân (tháng 2-3) mùa hè ( tháng 7-8) Virút cúm A/H5N1 xuất tập trung chủ yếu vào mùa đông –xuân Về đặc điểm di truyền học, tính kháng nguyên chủng virút cúm 2.1 Các chủng virút cúm theo mùa, 2001-2008 24 Virút cúm theo mùa A/H1N1 có kiểu hình gen HA NA tương đối ổn định, thay đổi, biến đổi từ chủng A/New Caledonia/20/99 (2001-2006) A/Solomon Island/3/06 (2007-2008) Gen HA gen NA biến đổi độc lập theo trật tự liên tiếp Virút cúm theo mùa A/H3N2 có thay đổi đa dạng kiểu hình gen HA NA, biến đổi từ chủng A/Panama/2007/99 (2002-2003) – A/Fujian/411/02 (2003) – A/Wincosin/67/05 (2005) đến A/Brisbane/10/07 (2007-2008) Gen HA biến đổi nhanh gen NA biến đổi độc lập theo trật tự liên tiếp Sự biến đổi vật liệu di truyền virút cúm A/H3N2 xảy thường xuyên virút cúm A/H1N1 Đặc tính kháng nguyên virút cúm theo mùa tương đồng với chủng sử dụng cho sản xuất vắc xin giai đoạn 2001- 2008 theo khuyến cáo TCYTTG 2.2 Virút cúm A/H5N1, 6/2003-5/2009 Virút cúm A/H5N1 lưu hành miền Bắc, Việt Nam bao gồm clade: virút cúm A/H5N1 lưu hành giai đoạn 12/2003 – 10/2005 thuộc clade 1; từ năm 10/2005 đến 5/2009, virút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4 Các chủng virút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4 chủng có độc lực cao, có lực thụ thể gia cầm vị trí (SAα- 2,3 Gal) tế bào chủ Một số đột biến axit amin protein NA liên quan đến giảm độ nhạy kháng thuốc Oseltamivir ghi nhận: đột biến axit amin vị trí H275Y (A/Vietnam/HN30408/2005) đột biến axit amin vị trí I117V (A/VietNam/HN31209/2007 A/VietNam/HN31412/2008) KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu trên, xin nêu số kiến nghị sau: Áp dụng phương pháp RT-PCR giám sát chẩn đoán sớm nhiễm virút cúm mùa virút cúm A/H5N1 Tiếp tục giám sát lưu hành virút cúm mùa virút cúm A/H5N1 để xác định tần suất tiến hoá, yếu tố tiềm tàng trao đổi tích hợp virút cúm mùa virút cúm A/H5N1, H1N1/09 đại dịch, khả thay đổi tính kháng nguyên liên quan đến giảm khả bảo vệ vắc xin tương thích Giám sát đột biến liên quan đến tượng kháng giảm độ nhạy thuốc kháng virút (Amantadine Oseltamivir), phối hợp với nghiên cứu gia cầm để giám sát đột biến tự nhiên (không chịu áp lực trực tiếp thuốc kháng virút) gia cầm có liên quan đến tượng ... tính kháng nguyên cần thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nguyên vụ dịch cúm người đầu năm 2000 Miền Bắc Việt Nam ” Với mục tiêu: Xác định nguyên vụ dịch cúm giai... tượng KẾT LUẬN Về nguyên vụ dịch cúm Miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2001-2009 - Virút cúm A/H1N1 nguyên chủ yếu gây dịch năm: 2003, 2006 2008 - Virút cúm A/H3N2 nguyên chủ yếu gây dịch năm: 2002,... kháng nguyên chủng virút cúm mùa A/H1N1, A/H3N2, B virút cúm A/H5N1 lưu hành giai đoạn 2001-2009 Những đóng góp luận án Xác định nguyên vụ dịch cúm thời gian lưu hành virút cúm Miền Bắc Việt Nam