Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.42.01.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết 2: PGS.TS Phạm Thị Tâm HÀ NỘI- NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Xuân Viết PGS.TS Phạm Thị Tâm Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành luận án này, tơi nhận hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ quan tâm, động viên từ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến hai thầy, giáo kính mến mình, PGS.TS Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội) Thầy cô người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu cho suốt q trình thực đề tài Thầy ln động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu nhiệt tình hỗ trợ tơi thực đề tài bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Công nghệ sinh học), Th.S Cao Thị Thanh Hương, ThS Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS Đặng Thị Hồng Thắm sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN), Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN) Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cán - giảng viên - sinh viên mơn Di truyền học - Hóa Sinh, cán - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội ủng hộ tạo điều kiện để tơi thực nội dung đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành chương trình học Nghiên cứu sinh Trường Tơi xin cảm ơn tập thể cán - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tơi triển khai thuận lợi nội dung đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến gia đình bạn bè ln bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền DANH MỤC VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ nghĩa Việt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 A Ala Asn Asp bp BHI CFU C DNA Gln Glu Gly G His Ile KIA KP Leu LPS LD50 LB Met NCBI 24 25 26 27 Phe PCR Pro OMPs 28 ORF Adenine Alanine Asparagine Aspartic acid Base pair Brain Heart Infusion Colony Forming Units Cytosine Deoxyribonucleic acid (axit nucleic) Glutamine Glutamic acid Glycine Guanine Histidine Isoleucine Kligler Iron Agar Kanagawa phenomenon Leucine Lipopolysaccharides Lethal dose (Liều gây chết trung bình) Luria Broth Methionine National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) Phenylalanine Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Proline Outer membrane proteins (Protein màng ngoài) Open reading frame (Khung đọc mở) 29 30 PBS RRDR 31 32 33 34 35 36 37 38 RNA Ser TRH TDH TLH TCBS Thr RPS 39 40 41 42 42 T Tyr Val & cs VPGs Phosphate buffered saline Rifampicin-resistance determining region (Vùng xác định kháng rifampicin) Ribonucleic acid Serine TDH-related haemolysin Thermostable direct haemolysin Thermolabile haemolysin Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose Threonine Relative percent survival (Tỉ lệ bảo hộ) Tymine Tyrosine Valine Và cộng Vibrio parahaemolyticus ghosts MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Tính mới, tính độc đáo đề tài Địa điểm thời gian nghiên cứu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận số loài cá 1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa sinh trưởng vi khuẩn Vibrio 1.1.2 Hệ gen vi khuẩn V parahaemolyticus 1.1.3 Độc tố gen quy định độc tố haemolysin 1.1.4 Gen rpoB tính kháng rifampicin 12 1.1.5 Kháng nguyên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 14 1.2 Bệnh hoại tử gan thận cá biển 15 1.2.1 Triệu chứng 15 1.2.2 Chẩn đoán điều trị 17 1.3 Vắc-xin chế miễn dịch chủ động 18 1.3.1 Vắc-xin phân loại vắc-xin cho cá 18 1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu cá xương 21 1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào thể cá 23 1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá 25 1.4.1 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân vật lý 25 1.4.2 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân hóa học 26 1.4.3 Tạo vi khuẩn giảm độc lực kĩ thuật gen 32 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá 35 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 35 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 38 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1 Cá bệnh 41 2.1.2 Cá thí nghiệm 41 2.1.3 Vi khuẩn 41 2.1.4 Hóa chất 41 2.1.5 Thiết bị 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Sơ đồ bước thực 43 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh 43 2.2.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn 44 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram 44 2.2.5 Phương pháp xác định khả sinh trưởng vi khuẩn 44 2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 44 2.2.7 Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn 47 2.2.8 Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin 48 2.2.9 Phương pháp đánh giá độc lực dòng vi khuẩn kháng rifampicin .49 2.2.10 Nhóm phương pháp sinh học phân tử 50 2.2.10.1 Phương pháp thiết kế mồi 50 2.2.10.2 Phương pháp tách DNA tổng số 50 2.2.10.3 Phương pháp PCR, giải trình tự gen 50 2.2.11 Phương pháp tin sinh 52 2.2.12 Phương pháp đánh giá tính ổn định độc lực độ an tồn dòng vi khuẩn giảm độc lực cá mú chấm cam 52 2.2.13 Phương pháp đánh giá khả đáp ứng miễn dịch dòng giảm độc lực cá mú 53 2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu 54 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận 55 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio 55 3.1.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa mẫu vi khuẩn phân lập 58 3.1.3 Xác định chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phương pháp phân tử 62 3.1.4 Đánh giá khả gây bệnh cho cá mú chủng vi khuẩn phân lập 65 3.1.5 Phân lập, giải trình tự gen độc tố toxR, tlh gen rpoB chủng vi khuẩn phân lập 68 3.2 Kết tạo dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực 78 3.2.1 Đánh giá độc lực dòng vi khuẩn kháng rifampicin 78 3.2.2 Đánh giá đặc điểm sinh hóa dòng vi khuẩn giảm độc lực 90 3.2.3 So sánh trình tự gen toxR, tlh rpoB dòng giảm độc lực so chủng vi khuẩn dại 90 3.2.3.1 So sánh trình tự gen toxR tlh dòng giảm độc lực chủng vi khuẩn dại 90 3.2.3.2 So sánh trình tự rpoB chủng dại với dòng giảm độc lực 99 3.3 Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch, khả sinh trưởng dòng vi khuẩn giảm độc lực 104 3.3.1 Đánh giá tính ổn định độc lực, khả sinh trưởng dòng giảm độc lực 104 3.3.2 Xác định tính an tồn dòng L4650 106 3.3.3 Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch dòng vi khuẩn giảm độc lực cá mú 107 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 4.1 Kết luận 112 4.2 Kiến nghị 113 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 Tài liệu tiếng Việt 115 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ bước thực 43 Hình 2.2 Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú 48 Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập môi trường TCBS 57 Hình 3.2 Phản ứng lên men môi trường KIA (A) phản ứng sinh indol với thuốc thử Kovac (B) mẫu vi khuẩn 59 Hình 3.3 Vi khuẩn VCTT 12233 (A) HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi bọt thử nghiệm với H2O2 60 Hình 3.4 Vi khuẩn LBT6 gây tượng tan huyết mơi trường thạch máu (A) có khả di động môi trường LB bán lỏng (B) 60 Hình 3.5 Vi khuẩn N13.1.1 ni BHI agar với đĩa giấy kháng sinh 61 Hình 3.6 DNA tổng số vi khuẩn điện di gel agarose 62 Hình 3.7 Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR mẫu vi khuẩn với cặp mồi toxR-4, toxR-7 64 Hình 3.8 Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh mẫu vi khuẩn với cặp mồi tlhF-tlhR 65 Hình 3.9 Cá mú chết ngày thứ sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) ngày thứ sau gây nhiễm chủng LBT6 với tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B) 66 Hình 3.10 Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4 68 Hình 3.11 So sánh hai trình tự gen toxR chủng LBT6 khuếch đại cặp mồi toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) 70 Hình 3.12 Sơ đồ minh họa đoạn trình tự gen toxR chủng V parahaemolyticus NCBI với trình tự tương ứng gen toxR hoàn chỉnh chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 71 Hình 3.13 Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3 72 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 ... thực tiễn trên, đề tài Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc- xin phòng bệnh hoại tử gan thận số loài cá biển tiến hành nhằm tạo làm sở... vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển ni 4 Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho số loài cá biển Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus. .. độc lực L4650 ứng vi n tiềm cho nghiên cứu phát triển vắc- xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận số lồi cá biển ni lồng Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu ổn định độc lực, tỉ lệ sống