Nghiên cứu độc tính và tác dụng điều trị thoái hóa khớp gối của viên hoàn cứngTD0015 trên thực nghiệm tt

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết luận án Thối hóa khớp gối bệnh lý xương khớp thường gặp nay, số nguyên nhân gây giảm khả vận động Bệnh có chi phí điều trị tốn kém, hiệu chưa đạt mong muốn có nhiều tai biến nặng nề, tạo gánh nặng cho người bệnh xã hội Việc tìm kiếm thuốc an tồn, hiệu có nguồn gốc dược liệu có tác dụng điều trị bệnh lý cần thiết, đặc biệt nước có nguồn dược liệu dồi y học cổ truyền lâu đời Việt Nam Viên hoàn cứng TD0015 gồm 21 vị dược liệu phối hợp với nhằm đạt tác dụng bổ thận, khu phong, trừ thấp, tán hàn Đồng thời, vị dược liệu TD0015 nhiều nghiên cứu giới báo cáo tác dụng chống viêm, giảm đau chống thối hóa khớp Như vậy, việc khẳng định hiệu điều trị cung cấp chứng khoa học tính an toàn sản phẩm kết hợp vị dược liệu với vấn đề cấp thiết, có tính khoa học thực tiễn, đem lại nhiều lựa chọn điều trị thối hóa khớp Với mục đích này, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu độc tính tác dụng điều trị thối hóa khớp gối viên hồn cứng TD0015 thực nghiệm” Mục tiêu luận án Xác định độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên hoàn cứng TD0015 thực nghiệm Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau viên hoàn cứng TD0015 thực nghiệm Đánh giá tác dụng điều trị viên hoàn cứng TD0015 chuột cống bị gây thối hóa khớp gối Những đóng góp luận án Luận án nghiên cứu tiến hành xây dựng mơ hình thối hóa khớp gối chuột cống Việt Nam Đây mô hình thực nghiệm tương đối giới, áp dụng theo phương pháp Kim Joon Ki, cho phép đánh giá tác dụng giảm triệu chứng thối hóa khớp viêm, đau, hạn chế vận động tổn thương sụn khớp Trên sở này, luận án cung cấp chứng chứng minh tác dụng điều trị thối hóa khớp gối viên hồn cứng TD0015 chuột cống trắng, thông qua tác dụng giảm đau, chống viêm, cải thiện hoạt động khớp gối, cải thiện cấu trúc sụn khớp, giảm số cytokin đặc hiệu thối hóa khớp, từ làm sở cho nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng hiệu TD0015 điều trị thối hóa khớp gối Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Ý nghĩa khoa học: Các kết nghiên cứu luận án góp phần khẳng định tính an tồn tác dụng điều trị thối hóa khớp gối TD0015 thực nghiệm, tạo tiền đề tiếp tục thử nghiệm lâm sàng - Ý nghĩa thực tiễn: làm sở khoa học để phát triển thuốc điều trị thối hóa khớp gối hiệu từ nguồn nguyên liệu sẵn có tự nhiên Cấu trúc luận án Luận án có 139 trang, bao gồm phần: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (36 trang), đối tượng phương pháp nghiên cứu (18 trang), kết (42 trang) bao gồm 34 bảng, biểu đồ, 38 hình, bàn luận (38 trang), kết luận (2 trang), kiến nghị (1 trang) Luận án có 177 tài liệu tham khảo (tiếng Anh tiếng Việt) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương thối hóa khớp gối Thối hóa khớp tổn thương tồn khớp, bao gồm tổn thương sụn, xương sụn, dây chằng, cạnh khớp màng hoạt dịch, kèm theo biến đổi hình thái hẹp khe khớp, gai xương xơ xương sụn Thối hóa khớp gối chiếm tỷ lệ cao Viêm màng hoạt dịch coi yếu tố then chốt chế bệnh sinh thối hóa khớp Tổn thương xương sụn đóng vai trò quan trọng thối hóa khớp, biểu tái cấu trúc xương xảy chủ yếu giai đoạn đầu thối hóa khớp Điều có khả làm cho phần xương sụn giảm khả hấp thu phân tán lực tác động, kết hợp gia tăng khối lượng xương làm tăng thêm lực truyền qua khớp, dẫn đến tăng tổn thương cấu trúc khớp Các biện pháp điều trị bao gồm: điều trị khơng dùng thuốc, điều trị nội khoa dùng thuốc điều trị ngoại khoa 1.2 Thuốc điều trị thối hóa khớp Các thuốc điều trị thối hóa khớp gồm thuốc điều trị triệu chứng thuốc chống thối hóa khớp tác dụng chậm Trong đó, chủ yếu vai trò thuốc chống viêm, giảm đau có tác dụng làm giảm triệu chứng bệnh nhân nhanh chóng 1.2.1 Thuốc giảm đau, chống viêm Học viện phẫu thuật chỉnh hình Mỹ khuyến cáo bệnh nhân bị THK gối có triệu chứng nguy rối loạn tiêu hóa tăng (tuổi ≥60 năm, có nhiều bệnh phối hợp, tiền sử loét dày, tiền sử chảy máu, sử dụng corticosteroid đồng thời và/hoặc đồng thời sử dụng thuốc chống đông máu) nên dùng số thuốc sau để giảm đau: Paracetamol (không 4g ngày); Các NSAIDs chỗ; NSAIDs đường uống không chọn lọc kèm thuốc bảo vệ dày; Thuốc ức chế chọn lọc COX-2 1.2.2 Thuốc chống thối hóa khớp tác dụng chậm Các thuốc chống thối hóa khớp tác dụng chậm bao gồm glucosamin, chondroitin sulphat, diacerein, chất không xà phòng hóa từ bơ đậu nành, acid hyaluronic Nhóm thuốc đặc trưng hiệu giảm triệu chứng xuất muộn (trung bình 1-2 tháng sau sử dụng) trì sau ngừng điều trị (sau vài tuần đến 2-3 tháng) Glucosamin tồn thể giống chất sinh tổng hợp proteoglycan - hợp chất cần thiết để trì tính tồn vẹn sụn Mặc dù chế tác dụng chưa rõ ràng glucosamin chứng minh gây đảo ngược tác dụng gây viêm phá hủy khớp IL-1 tế bào sụn sụn thối hóa Chondroitin sulphat polysaccharid có tác dụng ức chế số enzyme tiêu sụn, metalloprotease, cải thiện triệu chứng đau cấu trúc sụn khớp Diacerein thuốc ức chế cytokin IL-1 thông qua giảm số lượng giảm nhạy cảm với receptor IL-1 tế bào sụn khớp; giảm nồng độ TNF-α; giảm sản xuất cytokin, NO, MMPs gây huỷ hoại tế bào sụn màng hoạt dịch; thuốc có bất lợi nguy gây tiêu chảy đáng kể bệnh nhân Hyaluronic acid có tác dụng bao phủ bơi trơn bề mặt sụn khớp, ngăn cản proteoglycan, nhiên, chứng tác dụng cho cải thiện chức vận động giảm đau vận động gây nhiều tranh cãi Ngồi ra, số thuốc khác nghiên cứu thử nghiệm, liên quan đến chế phân tử thối hóa khớp, chất ức chế enzym tiêu hủy cấu trúc (MMPs); chất ức chế ADAMTS; chất ức chế tổng hợp iNOS; kháng thể đơn dòng kháng IL-1β (canakinumab), kháng thể kháng TNF-α (adalimumab, infliximab) 1.3 Tổng quan viên hoàn cứng TD0015 1.3.1 TD0015 Chế phẩm TD0015 gồm 21 vị dược liệu: Hoàng bá (2,26g), Bạch thược (0,77g), Sinh địa (0,7g), Đỗ trọng (0,47g), Phục linh (0,47g), Đảng sâm (0,34g), Đương quy (0,34g), Tri mẫu (0,31g), Hoa đào (0,26g), Phòng phong (0,23g), Tang ký sinh (0,23g), Tần giao (0,23g), Trần bì (0,22g), Xuyên khung (0,17g), Độc hoạt (0,17g), Cam thảo (0,12g), Quế chi (0,08g), Tế tân (0,08g), Ngưu tất (0,03g), Qui (2,97g), Cao xương hỗn hợp (0,7g) 1.3.2 Các nghiên cứu tác dụng TD0015 liên quan đến bệnh lý xương khớp Nhiều vị thuốc TD0015 chứng minh tác dụng chống viêm, giảm đau tác dụng cải thiện cấu trúc sụn thối hóa khớp bao gồm: Hồng bá, Phòng phong, Độc hoạt, Bạch thược, Ngưu tất, Tần giao, Quế, Cam thảo, Phục linh, Đảng sâm, Đương quy, Đỗ trọng, Tế tân, Tri mẫu Nghiên cứu Hoàng Thị Thắng năm 2017 chứng minh hiệu giảm đau, cải thiện tầm vận động cột sống cổ, giảm hội chứng rễ, cải thiện chức sinh hoạt bệnh nhân dùng phương pháp điện châm kết hợp viên hoàn cứng TD0015 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu TD0015 sản xuất công ty Cổ phần Sao Thái Dương, đạt TCCS Chế phẩm thử bào chế dạng viên hoàn cứng, gói gram Liều dùng dự kiến TD0015 người uống gói/ngày, tương đương 10 gram/ngày, nên dùng tháng liên tục 2.2 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss, chuột cống trắng chủng Wistar 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn viên hồn cứng TD0015 2.3.1.1 Độc tính cấp TD0015 theo đường uống chuột nhắt trắng Nghiên cứu tiến hành theo hướng dẫn Tổ chức y tế giới hướng dẫn Bộ y tế Việt Nam thuốc có nguồn gốc dược liệu Chuột nhắt trắng trọng lượng 20 ± 2g chia thành lô, lô 10 Cho lô chuột uống thuốc thử TD0015 với liều từ liều cao không gây chết tới liều thấp gây chết 100% chuột Chuột nhịn ăn 12 trước uống thuốc, uống nước đầy đủ Theo dõi số chuột chết 72 đầu tình trạng chung chuột ngày sau uống thuốc Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể tổn thương quan Xác định LD50 theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon theo tỷ lệ chuột chết vòng 72 đầu 5 2.3.1.2 Độc tính bán trường diễn TD0015 theo đường uống chuột cống trắng Nghiên cứu độc tính bán trường diễn chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn WHO thuốc có nguồn gốc dược liệu Chuột cống trắng chia làm lô (n = 10) - Lô chứng: uống nước cất 10 ml/kg/ngày - Lô trị 1: uống TD0015 liều 1,2g/kg/ngày - Lô trị 2: uống TD0015 liều 3,6g/kg/ngày Chuột uống nước thuốc 90 ngày, ngày lần vào buổi sáng Các thông số theo dõi kiểm tra thời điểm: trước uống thuốc, sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày, bao gồm: tình trạng chung, thay đổi thể trọng chuột, đánh giá chức tạo máu (số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, cơng thức bạch cầu số lượng tiểu cầu), đánh giá chức gan (bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần) mức độ hủy hoại tế bào gan (hoạt độ ALT, AST), đánh giá chức lọc cầu thận (nồng độ creatinin máu) Sau 90 ngày, chuột mổ để quan sát đại thể toàn quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận 30% số chuột lô 2.3.2 Đánh giá tác dụng giảm đau viên hoàn cứng TD0015 Đánh giá theo phương pháp Ezeja Mi (2011) 2.3.2.1 Đánh giá tác dụng giảm đau máy Hot plate Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10) - Lô chứng: uống nước cất liều 20ml/kg/ngày - Lô 2: uống codein phosphat 20 mg/kg - Lô 3: uống TD0015 liều 2,4g/kg/ngày - Lô 4: uống TD0015 liều 7,2g/kg/ngày Chuột lô uống nước cất thuốc thử ngày lần vào buổi sáng ngày Đo thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột trước uống thuốc sau uống thuốc lần cuối Đặt chuột lên mâm nóng ln trì nhiệt độ 55 ± 10C Tính thời gian từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến chuột liếm chân sau So sánh thời gian phản ứng với kích thích nhiệt trước sau uống thuốc thử 2.3.2.2 Đánh giá tác dụng giảm đau máy đo ngưỡng đau Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10), thiết kế nghiên cứu tương tự Đo thời gian phản ứng với đau chuột lực gây đau chuột (sử dụng máy Dynamic Plantar Aesthesiometer) trước uống thuốc sau uống thuốc lần cuối So sánh thời gian phản ứng với kích thích đau trước sau uống thuốc thử 2.3.2.3 Đánh giá tác dụng giảm đau với phương pháp gây quặn đau acid acetic Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10), thiết kế nghiên cứu tương tự Ngày cuối cùng, sau uống thuốc giờ, tiêm vào ổ bụng chuột 0,2 mL dung dịch acid acetic 1% Đếm số quặn đau chuột phút phút thứ 30 sau tiêm acid acetic 2.3.3 Đánh giá tác dụng chống viêm viên hoàn cứng TD0015 Đánh giá theo phương pháp Kim Kyung Soo (2008) 2.3.3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp TD0015 * Tác dụng chống viêm cấp mô hình gây phù chân chuột carrageenin Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10) - Lô chứng: uống nước cất, 10ml/kg - Lô 2: uống aspirin liều 200 mg/kg - Lô 3: uống TD0015 liều 1,2g/kg/ngày - Lô 4: uống TD0015 liều 3,6g/kg/ngày Chuột uống thuốc ngày liên tục trước gây viêm Ngày thứ 5, sau uống thuốc thử giờ, gây viêm cách tiêm carrageenin 1%, 0,05 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải chuột Đo thể tích chân chuột dụng cụ chuyên biệt vào thời điểm: trước gây viêm (V0); sau gây viêm (V2), (V4), (V6) 24 (V24) Kết tính theo công thức Fontaine * Tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây viêm màng bụng chuột Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10), thiết kế nghiên cứu tương tự Ngày thứ 5, sau uống thuốc thử giờ, gây viêm màng bụng chuột dung dịch carrageenin 0,05g + formaldehyd 1,5 ml, pha vừa đủ 100ml nước muối sinh lý, tiêm 1ml/100g vào ổ bụng chuột Sau 24 giờ, mở ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm, đo thể tích, đếm số lượng bạch cầu/ml dịch rỉ viêm định lượng protein dịch rỉ viêm 2.3.3.2 Đánh giá tác dụng chống viêm mạn phương pháp tạo u hạt amiant Chuột nhắt trắng, chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10) - Lô chứng: uống nước cất, 0,2 ml/10 g - Lô 2: uống methylprednisolon liều 10mg/kg - Lô 3: uống TD0015 liều 2,4g/kg/ngày - Lô 4: uống TD0015 liều 7,2g/kg/ngày Gây viêm mạn tính cách cấy viên amiant trọng lượng mg tiệt trùng (sấy 120oC giờ) tẩm carrageenin 1%, da gáy chuột Sau cấy u hạt, chuột uống nước cất thuốc thử liên tục 10 ngày Ngày thứ 11 tiến hành giết chuột, bóc tách khối u hạt cân tươi Chọn ngẫu nhiên lô khối u hạt để làm xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể Các khối u hạt lại sấy khơ nhiệt độ 56oC 18 Cân trọng lượng u hạt sau sấy khô 2.3.4 Đánh giá tác dụng điều trị THK gối viên hoàn cứng TD0015 Đánh giá theo phương pháp Kim(2012), Calado(2015) Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10) Lô 1A 1B (chứng sinh học): uống nước cất 10ml/kg Lơ 2A 2B (mơ hình): uống nước cất 10ml/kg Lô (chứng dương): uống diclofenac 3mg/kg Lô (thuốc thử): uống TD0015 liều 1,2g/kg/ngày Lô (thuốc thử): uống TD0015 liều 3,6g/kg/ngày Chuột lơ ni ổn định điều kiện phòng thí nghiệm tuần trước đưa vào nghiên cứu Chuột lơ đến lơ gây thối hóa khớp theo phương pháp Kim cộng cách tiêm dung dịch MIA liều 3mg/khớp vào khớp gối bên phải chuột Lô chứng sinh học tiêm nước muối sinh lý dung môi pha thuốc vào khớp gối bên phải chuột Thể tích dung dịch tiêm vào khớp 50µl/khớp Sau gây mơ hình, lơ chuột uống nước thuốc tương ứng tuần liên tục, lần/ngày Các số đánh giá gồm: 2.3.4.1 Đường kính khớp gối Đường kính khớp gối bên phải đo thước điện tử vào thời điểm: trước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc ngày, ngày, tuần, tuần, tuần, tuần, tuần tuần Chỉ số đánh giá độ tăng đường kính khớp gối thời điểm nghiên cứu so với trước nghiên cứu, đơn vị milimet 2.3.4.2 Tác dụng giảm đau, cải thiện hoạt động khớp gối * Tác dụng giảm đau khớp theo phương pháp Randall Selitto Sử dụng máy Analgesy meter 7200 để đo lực gây đau vị trí khớp gối chân sau, bên phải chuột lô, thời điểm trước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc tuần tuần, so sánh lô chuột với * Tác dụng cải thiện hoạt động khớp gối máy đo ngưỡng đau sử dụng kim Von frey Đo thời gian phản ứng với đau chuột lực gây đau chuột, sử dụng máy Dynamic Plantar Aesthesiometer vị trí gan chân sau, bên phải chuột trước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc tuần tuần, so sánh lơ chuột với Từ đánh giá tác dụng giảm đau khả vận động khớp gối phải chuột * Tác dụng cải thiện hoạt động khớp gối phương pháp sử dụng máy Hot plate Giai đoạn huấn luyện (3 tuần): chuột làm quen với máy Hot plate lần, cách tuần Giai đoạn đánh giá hiệu quả: chuột đánh giá lần máy Hot plate trước gây mơ hình thối hóa khớp gối Sau gây mơ hình uống thuốc Sự vận động khớp gối chuột đánh giá máy Hot plate vào thời điểm sau tiêm MIA uống thuốc tuần tuần, thông qua số sau: *Thời gian chuột nhảy khỏi mâm nóng: Đặt chuột lên mâm nóng (55 ± độ C) Thời gian phản ứng với kích thích nhiệt khiến chuột nhảy khỏi mâm nóng (tính giây) tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến chuột nhảy bật khỏi mâm nóng ngồi máy Hot plate * Độ cao đạt chuột nhảy khỏi mâm nóng: độ cao cực đại đạt chuột nhảy thành cơng khỏi mâm nóng chạm hai chân sau vào thành ống bám vào mép thành ống để ngồi * Số lần nhảy đà chuột nhảy khỏi mâm nóng: Động tác nhảy đà chuột dậm nhảy không thành công hạn chế vận động khớp gối Tính số lần nhảy đà chuột lô so sánh lô Hoạt động chuột ghi lại thơng qua hệ thống camera đảm bảo tính xác đồng 2.3.4.3 Chỉ số cytokin Các số IL-1β TNF α số đặc hiệu định lượng huyết chuột thời điểm sau tuần tiêm MIA kỹ thuật ELISA, sử dụng KIT IL-1β TNFα dành riêng cho chuột cống hãng Cloud Clone Corp (Mỹ) 9 2.3.4.4 Đánh giá mô bệnh học khớp gối * Sau tuần tiêm MIA: Chuột lô 1B, 2B sau tuần tiêm MIA gây mê, phẫu thuật tách khớp gối phải, bảo quản dung dịch formaldehyd 10% * Sau tuần tiêm MIA uống thuốc: Đánh giá chuột tất lô sau tuần tiêm MIA uống thuốc Chuột gây mê phẫu thuật tách khớp gối phải, bảo quản dung dịch formaldehyd 10% Mức độ thối hóa khớp đánh giá tiêu giải phẫu mô bệnh học, dựa vào bảng điểm tổn thương theo phương pháp Janusz Al Saffar 2.4 Xử lý số liệu: Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel 2013 SPSS 20, sử dụng thuật tốn thống kê thích hợp (Student’s t-test, Paired t-test, Mann Whitney U test) Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn viên hồn cứng TD0015 3.1.1 Độc tính cấp TD0015 chuột nhắt trắng Bảng 3.1 Mối tương quan liều dùng TD0015 tỷ lệ chuột chết Liều Tỷ lệ chết Dấu hiệu Lô chuột n (g/kg thể trọng) (%) bất thường khác Lô 10 15,0 Không Lô 10 22,5 Không Lô 10 30,0 Không Lô 10 37,5 Không Lô chuột uống đến liều 37,5g/kg thể trọng chuột Theo dõi thấy khơng có chuột chết, không xuất triệu chứng bất thường 72 sau uống thuốc thử sau ngày, chưa xác định LD50 TD0015 chuột nhắt trắng theo đường uống phương pháp Litchfield – Wilcoxon 3.1.2 Độc tính bán trường diễn viên hoàn cứng TD0015 chuột cống trắng 3.1.2.1 Tình trạng chung cân nặng chuột cống trắng Trong thời gian thí nghiệm, chuột lơ hoạt động bình thường, ăn uống tốt, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, phân khô Trọng lượng chuột lô tăng so với trước nghiên cứu gia tăng 10 trọng lượng lô uống TD0015 thấp so với lô chứng sinh học, đặc biệt thời điểm sau 90 ngày (p < 0,05) 3.1.2.2 Ảnh hưởng TD0015 lên chức tạo máu TD0015 liều 1,2g/kg 3,6g/kg không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng cơng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày uống thuốc (p>0,05) 3.1.2.3 Ảnh hưởng TD0015 lên chức gan TD0015 liều 1,2g/kg 3,6g/kg uống liên tục 90 ngày không làm ảnh hưởng đến nồng độ albumin bilirubin toàn phần máu chuột (p > 0,05) Ở thời điểm sau 90 ngày uống thuốc, lô uống TD0015 liều 1,2g/kg 3,6g/kg có nồng độ cholesterol giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng so với thời điểm trước uống thuốc (p < 0,05) Bảng 3.2 Ảnh hưởng TD0015 lên nồng độ cholesterol toàn phần Nồng độ cholesterol toàn phần (mmol/l) Thời gian p Lô chứng Lô trị Lô trị (n=10) (n=10) (n=10) D0 1,53 ± 0,26 1,56 ± 0,18 1,43 ± 0,19 > 0,05 D30 1,42 ± 0,23 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,20 > 0,05 p (trước – sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05 D60 1,57 ± 0,13 1,52 ± 0,23 1,50 ± 0,22 > 0,05 p (trước – sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05 D90 1,36 ± 0,12 1,14 ± 0,22 1,10 ± 0,13 < 0,05 p (trước – sau) > 0,05 < 0,05 < 0,05 3.1.2.4 Ảnh hưởng TD0015 lên mức độ hủy hoại tế bào gan Khơng có khác biệt hoạt độ enzym AST, ALT lô uống TD0015 so với chứng sinh học thời điểm trước sau uống thuốc thử suốt thời gian nghiên cứu (p > 0,05) 3.1.2.5 Ảnh hưởng TD0015 lên chức lọc cầu thận TD0015 liều không làm ảnh hưởng đến nồng độ creatinin máu chuột sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày uống thuốc liên tục (p > 0,05) 3.1.2.6 Ảnh hưởng TD0015 lên giải phẫu bệnh gan, thận - Cấu trúc vi thể gan: Ở lô, cấu trúc gan không bị đảo lộn Vùng tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy gan vùng khoảng cửa không bị xơ hóa, khơng xâm nhập viêm, khơng tăng sinh ống mật Các tế bào gan bình thường 11 thối hóa nhẹ Khơng có khác biệt cấu trúc vi thể gan lô dùng thuốc thử TD0015 với lô chứng - Cấu trúc vi thể thận: Ở lơ, cầu thận có hình thái, cấu trúc giới hạn bình thường, khơng xơ hóa, khơng tăng sinh tế bào Nhu mô thận không viêm, không hoại tử, mơ đệm bình thường, khơng có xâm nhập tế bào viêm 3.2 Đánh giá tác dụng giảm đau viên hoàn cứng TD0015 3.2.1 Đánh giá tác dụng giảm đau máy Hot plate Codein có tác dụng kéo dài rõ rệt thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột so với thời điểm trước uống codein so với lô chứng sinh học (p < 0,05) TD0015 liều uống ngày liên tục có xu hướng kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột nhắt trắng so với trước uống thuốc so với lô chứng, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.2.2 Đánh giá tác dụng giảm đau máy đo ngưỡng đau TD0015 liều uống ngày liên tục làm tăng rõ rệt lực gây phản xạ đau thời gian đáp ứng với đau máy đo ngưỡng đau chuột (p < 0,05) Tác dụng tương tự với codein 20mg/kg Không có khác biệt rõ rệt lơ uống TD0015 liều 2,4g/kg/ngày với lô uống TD0015 liều 7,2g/kg/ngày 3.2.3 Đánh giá tác dụng giảm đau phương pháp gây quặn đau acid acetic TD0015 liều 2,4g/kg/ngày uống ngày liên tục có tác dụng làm giảm số quặn đau tất thời điểm, rõ phút thứ 5, 15, 20 25 (p < 0,05) TD0015 liều 7,2g/kg/ngày uống ngày liên tục có tác dụng làm giảm rõ số quặn đau tất thời điểm, đặc biệt phút thứ 10 phút thứ 20 (p < 0,01, p < 0,001) Tác dụng tương tự với aspirin 150mg/kg Khơng có khác biệt rõ rệt lơ uống TD0015 liều 2,4g/kg/ngày với lô uống TD0015 liều 7,2g/kg/ngày 3.3 Đánh giá tác dụng chống viêm viên hoàn cứng TD0015 3.3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp * Tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân chuột carrageenin 12 Aspirin 200mg/kg có tác dụng chống viêm cấp thời điểm nghiên cứu, rõ vào thời điểm sau gây viêm 2h (p < 0,001) sau gây viêm 4h (p < 0,05) TD0015 liều 1,2g/kg có xu hướng làm giảm phù chân chuột thời điểm sau gây viêm 2h, 4h, 6h (p > 0,05) giảm rõ thời điểm sau 24h (p 0,05) * 250 200 ∆ ∆ 150 IL-1β 100 TNF-α 50 * ∆ ∆ Chứng sinh học Mô hình Diclofenac TD0015 1,2g/kg TD0015 3,6g/kg Biểu đồ 3.4 Nồng độ cytokin lô nghiên cứu 3.4.4 Tác dụng viên hồn cứng TD0015 lên mơ bệnh học khớp gối 3.4.4.1 Sau tuần tiêm MIA Ở lô chứng sinh học, mức độ tổn thương tối thiểu Ở lơ mơ hình, sau tuần tiêm MIA, tổn thương sụn, proteoglycan, xuất chồi xương gai xương, tổn thương tế bào sụn mức độ nhẹ đến trung bình, tăng cao rõ rệt so với lô chứng (p < 0,01) Sự viêm màng hoạt dịch lơ mơ hình nặng lơ chứng sinh học khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Chứng sinh học Mơ hình Hình 3.1 Mô bệnh học khớp gối lô chứng mô hình sau tuần (HE x 20) 16 3.4.4.2 Sau tuần tiêm MIA Chứng sinh học Mơ hình TD0015 1,2g/kg Diclofenac 3mg/kg TD0015 3,6g/kg Hình 3.2 Mơ bệnh học khớp gối sau tuần (HE x 20) Ở lô chứng sinh học, mức độ tổn thương tối thiểu Ở lơ mơ hình, tổn thương mức độ nhẹ đến trung bình, tăng cao rõ rệt so với lô chứng (p < 0,001) Ở lô uống diclofenac 3mg/kg, mức độ tổn thương giảm so với mơ hình, thể rõ cấu trúc proteoglycan màng hoạt dịch (p < 0,05) Ở lô uống TD0015 liều 1,2g/kg, mức độ tổn thương giảm so với mơ hình, rõ cấu trúc proteoglycan, tế bào sụn màng hoạt dịch (p 0,05), không ảnh hưởng xấu đến chức lọc cầu thận Hình ảnh đại thể vi thể thận chuột giới hạn bình thường, cho thấy TD0015 không làm ảnh hưởng đến chức cấu trúc thận chuột Từ kết nghiên cứu trên, TD0015 liều 1,2g/kg/ngày 3,6g/kg/ngày uống liên tục 90 ngày khơng gây độc tính bán trường diễn chuột cống trắng Như vậy, xếp TD0015 vào nhóm thuốc khơng có độc tính sử dụng liều lặp lại dài ngày (90 ngày) Kết luận phù hợp với số nghiên cứu giới độc tính dài ngày vị dược liệu có TD0015 4.2 Tác dụng chống viêm viên hoàn cứng TD0015 4.2.1 Tác dụng chống viêm cấp * Trên mơ hình gây phù chân chuột carrageenin Aspirin 200mg/kg có tác dụng chống viêm cấp xuất sớm không kéo dài TD0015 liều 1,2 g/kg làm giảm độ phù chân chuột từ thời điểm sau rõ sau 24 với mức độ ức chế phù lên đến 40,7% TD0015 liều 3,6 g/kg thể tác dụng sớm hơn, từ thời điểm sau đạt 24,33% ức chế phù, so với aspirin, tác dụng trì đến sau 24 với hiệu chống viêm cấp tương đương liều 1,2g/kg với mức độ ức chế phù 40,3% Điều cho thấy, TD0015 có tác dụng chống viêm cấp tốt liều 3,6g/kg với hiệu sớm kéo dài TD0015 liều tương đương lâm sàng 1,2g/kg cho tác dụng chống viêm muộn 19 * Trên mơ hình gây viêm màng bụng TD0015 liều aspirin 200mg/kg có tác dụng làm giảm thể tích dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu protein rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,01) Như vậy, TD0015 liều 1,2g/kg 3,6g/kg có tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây viêm màng bụng, với hiệu tương đương Cơ chế chống viêm TD0015 giảm tính thấm thành mạch, làm giảm dịch rỉ viêm lượng protein dịch rỉ viêm, đồng thời hạn chế di chuyển bạch cầu vào mô viêm thông qua việc ức chế sản xuất chất trung gian hóa học gây viêm NO, PG E2, IL8, IL-12 hay histamine 5-hydroxytryptamin nhờ thành phần chứa Hoàng bá, Độc hoạt, Bạch thược, Tần giao 4.2.2 Tác dụng chống viêm mạn Thuốc có tác dụng chống viêm mạn thể việc ức chế tạo thành u hạt, làm giảm khối lượng u hạt so với nhóm chứng Kết nghiên cứu cho thấy, chuột nhắt, TD0015 liều 2,4g/kg/ngày liều 7,2g/kg/ngày làm giảm trọng lượng khối u hạt trước sau sấy khô Mức giảm TD0015 liều 7,2g/kg mạnh liều 2,4g/kg tương đương với tác dụng methylprednisolon 10mg/kg Kết thu thực nghiệm phù hợp với nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn vị dược liệu có TD0015 như: Độc hoạt, Tần giao, Bạch thược, Ngưu tất… 4.3 Đánh giá tác dụng giảm đau viên hoàn cứng TD0015 4.3.1 Tác dụng giảm đau mơ hình Hot plate Mơ hình mâm nóng sử dụng nhiệt tác nhân gây đau nhằm đánh giá tác dụng giảm đau trung ương thuốc TD0015 liều 2,4g/kg/ngày 7,2g/kg/ngày có xu hướng giảm đau, chưa thể tác dụng rõ ràng Như vậy, theo mơ hình này, TD0015 khơng có tác dụng giảm đau theo chế thần kinh thông qua tác động nhiệt vào da TD0015 thuốc có nguồn gốc cổ truyền, vị dược liệu có tác dụng chậm, thời gian uống thuốc TD0015 có ngày, chưa đủ để thể tác dụng giảm đau với nguyên nhân nhiệt độ 4.3.2 Tác dụng giảm đau máy rê kim Phương pháp rê kim sử dụng tác nhân học làm tác nhân gây đau đánh giá tác dụng giảm đau trung ương TD0015 thông qua đánh giá thời gian phản ứng với đau cường độ lực gây đau chuột TD0015 liều 2,4g/kg/ngày 7,2g/kg/ngày làm tăng rõ rệt lực gây phản xạ đau thời gian đáp ứng với đau máy đo ngưỡng đau chuột, 20 tác dụng tương đương liều nghiên cứu tương đương với codein 20mg/kg Như vậy, mơ hình này, TD0015 có tác dụng giảm đau trung ương với nguyên nhân gây đau học 4.3.3 Tác dụng giảm đau mơ hình quặn đau acid acetic Mơ hình gây đau acid acetic để đánh giá tác dụng giảm đau ngoại biên, dùng acid acetic kích thích gây viêm đau chỗ Cơ chế gây đau hóa chất kích thích đại thực bào dưỡng bào có mặt phúc mạc giải phóng chất gây đau: TNF-α IL-1β, IL-8 TD0015 liều 2,4g/kg/ngày 7,2g/kg/ngày làm giảm số quặn đau tất thời điểm nghiên cứu TD0015 có tác dụng giảm đau ngoại biên từ liều lâm sàng Từ kết trên, TD0015 thể tác dụng giảm đau theo chế trung ương ngoại biên rõ Một số dược liệu thuốc chứng minh có tác dụng giảm đau như: Bạch thược, Độc hoạt, Tần giao, Phòng phong, Đương quy, Ngưu tất… 4.4 Đánh giá tác dụng điều trị thối hóa khớp gối TD0015 4.4.1 Về mơ hình gây thối hóa khớp gối chuột cống MIA Trong luận án này, mơ hình gây THK gối thực nghiệm MIA lần đầu tiến hành Việt Nam, sử dụng MIA tiêm vào khớp gối chuột MIA có tác dụng ức chế hoạt tính glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase sụn khớp, làm dần lớp sụn khớp tổn thương cấu trúc xương sụn Nhiều nghiên cứu chứng minh MIA liều 3mg/khớp tiêm lần có hiệu việc gây mơ hình THK Mơ hình thối hóa khớp động vật chẩn đoán dựa vào yếu tố: Đánh giá triệu chứng viêm, đau, hạn chế vận động; Định lượng số cytokin đặc hiệu thối hóa khớp; Thăm dò hình ảnh: siêu âm, Xquang; Đánh giá tổn thương giải phẫu bệnh khớp Trong luận án này, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tiêu chí đau, viêm, hạn chế vận động, số số interleukin giải phẫu bệnh vi thể khớp gối Chỉ số viêm mơ hình thối hóa khớp gối đánh giá thơng qua đường kính khớp gối chuột Khớp gối lơ mơ hình tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh học, thời điểm đạt đỉnh sau ngày tiêm MIA, phù hợp với nghiên cứu Calado năm 2015 Đau lượng giá khớp gối tiêm MIA, thông qua phương pháp Randall Selitto, ngưỡng đau khớp gối giảm rõ so với lô chứng sinh học, mạnh thời điểm sau tuần tiêm MIA, khớp bị viêm sưng to, nhạy cảm với kích thích học nên chuột rút chân nhanh Kết phù hợp 21 với báo cáo Neugebauer 2007 tổng hợp triệu chứng đau chuột gây thối hóa khớp Nhóm nghiên cứu áp dụng hai phương pháp đánh giá khả vận động khớp chuột gồm đánh giá máy rê kim Hot plate Hạn chế hoạt động khớp gối máy rê kim thể qua số thời gian lực gây đau làm chuột nhấc chân khỏi kim Von Frey Các số giảm rõ so với lô chứng sinh học sau tuần tiêm MIA khớp gối chuột giai đoạn viêm nên nhạy cảm với lực tác động, tăng lên từ tuần thứ giai đoạn tổn thương sụn khớp gối chuột nặng nề, làm cử động chuột trở nên khó khăn, chậm hoạt động rút chân khỏi kim Von Frey Phương pháp Hot plate phương pháp kinh điển đánh giá tác dụng giảm đau gây nhiệt độ Nghiên cứu sử dụng nhiệt độ mâm nóng làm tác nhân kích thích chuột nhảy, từ lựa chọn ba thông số để đánh giá đau cử động khớp gối gồm có: (1) độ cao chuột đạt lần nhảy thành công, (2) thời gian từ thả vào mâm nóng đến lúc nhảy thành công, (3) số lần nhảy đà Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần, thời gian nhảy thành công chuột tất lô dài so với trước nghiên cứu, phản ứng màng hoạt dịch khớp gối sau tiêm MIA nước muối sinh lý, điều tương xứng với tăng đường kính khớp gối Từ tuần thứ trở đi, phản ứng màng hoạt dịch dần nên chuột đỡ đau nhanh nhẹn Chuột lơ mơ hình có thời gian nhảy thành công dài so với chứng sinh học tất thời điểm chứng tỏ tổn thương khớp gối dai dẳng Kết phù hợp với độ cao chuột đạt lần nhảy thành công, chuột tiêm MIA nhảy thấp chứng sinh học so với trước nghiên cứu, rõ thời điểm tuần thứ thứ 6, tổn thương thối hóa khớp hình thành rõ nét với phá hủy sụn cấu trúc quanh khớp Nhận thấy số chuột phải nhảy đà số lần nhảy đà chuột lơ có tương xứng với số trên, lô mô hình, số lần nhảy đà cao lơ chứng sinh học, cho thấy hạn chế vận động rõ chuột tiêm MIA IL-1β TNF-α cytokin đặc hiệu tham gia vào trình phá huỷ sụn khớp thối hóa khớp, gây cảm ứng tế bào sụn tăng tổng hợp enzym proteinase, tăng trình tổng hợp cytokin tiền viêm khác IL-17 IL-18 Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn số IL-1β TNF-α để đánh giá tình trạng thối hóa khớp chuột Ở lơ mơ hình, IL-1β TNF-α tăng rõ so với chứng sinh học Kết chứng tỏ nồng độ cytokin gắn liền với bệnh sinh thối hóa khớp, 22 cho phép đánh giá chế tác dụng thuốc điều trị thối hóa khớp cách rõ ràng Trên giới có nhiều cách đánh giá tổn thương giải phẫu bệnh, nghiên cứu chọn cách đánh giá hai tác giả Janusz Al Safar bảng điểm rõ ràng, chi tiết đánh giá tiêu sụn khớp nhuộm hematoxylin – eosin Kết cho thấy thành cơng mơ hình gây thối hóa khớp gối chuột cống MIA, tổn thương sụn hình thành rõ ràng từ sau tuần nặng thời điểm sau tuần, hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Al Safar tiêm MIA liều 3mg/khớp chuột cống 4.4.2 Tác dụng viên hoàn cứng TD0015 chuột gây thối hóa khớp gối MIA Do tính chất phá hủy sụn khớp MIA nhanh nên hầu hết nghiên cứu giới cho động vật sử dụng thuốc thử sau tiêm MIA, đánh giá tác dụng thuốc thử giai đoạn thuốc thử thể tác dụng bảo vệ sụn khớp hiệu Trong nghiên cứu này, với tính chất tổn thương MIA gây ra, chọn diclofenac làm thuốc chứng dương Thời gian uống thuốc kéo dài tuần liên tục lý do: (1) thời gian điều trị trung bình TD0015 thực tế lâm sàng từ tuần đến 12 tuần, tuần thời gian thích hợp để xác định hiệu tác dụng thuốc; (2) là, với liều MIA 3mg/khớp tuần thời gian thể tổn thương thối hóa khớp rõ ràng nhất, từ đánh giá tác dụng điều trị thuốc toàn diện Sự giảm đường kính khớp ngưỡng đau khớp sau tuần tiêm MIA, kéo dài đến tuần cho thấy hiệu diclofenac TD0015 liều Có tác dụng nhờ chế chống viêm, giảm đau vị dược liệu thành phần TD0015 trình bày Trên máy rê kim, TD0015 liều diclofenac cải thiện số thời gian lực gây đau so với lơ mơ hình, cho thấy hạn chế vận động khớp gối chuột giảm đáng kể Trên máy Hot plate, diclofenac liều 3mg/kg TD0015 liều rút ngắn thời gian nhảy thành công chuột, tăng độ cao nhảy giảm số lần nhảy đà so với mơ hình, thuốc có tác dụng giảm đau, chống viêm khớp nên cử động khớp trở nên linh hoạt dễ dàng Tác dụng TD0015 liều 3,6g/kg tương đương diclofenac 3mg/kg mạnh TD0015 liều 1,2g/kg Diclofenac 3mg/kg TD0015 liều 3,6g/kg có tác dụng giảm nồng độ IL-1β TNF-α rõ rệt so với lơ mơ hình, TD0015 liều 1,2g/kg chưa thể tác dụng 23 Kết phù hợp với cải thiện cấu trúc sụn khớp sau tuần điều trị, TD0015 liều 3,6g/kg làm giảm số điểm tổn thương sụn khớp tiêu chí so với lơ mơ hình TD0015 liều 1,2g/kg cải thiện 3/5 tiêu chí cho thấy tác dụng khơng hiệu liều 3,6g/kg Diclofenac 3mg/kg thể tác dụng cải thiện tổn thương cấu trúc sụn khớp không nhiều, đạt 2/5 tiêu chí Cơ chế tác dụng thuốc giải thích tác dụng riêng lẻ vị dược liệu hay tác dụng phối hợp vị dược liệu có TD0015 cơng bố rộng rãi: Hoàng bá, Độc hoạt, Tế tân, Bạch thược làm giảm IL-6, IL-1β, TNF-α, tăng biểu proteoglycan; Ngưu tất tăng sinh sụn tăng biểu collagen typ II sụn… Kết phù hợp với số báo cáo tác dụng điều trị thoái hóa khớp phối hợp dược liệu có TD0015 như: DJW (2004), DHJST (2011), Tam tý thang (2005), Độc hoạt ký sinh (2016) KẾT LUẬN Độc tính - Độc tính cấp: Chưa xác định độc tính cấp cho chuột nhắt trắng uống đến liều 37,5g/kg/ngày, liều gấp 15,625 lần liều dùng dự kiến lâm sàng - Độc tính bán trường diễn: TD0015 liều 1,2g/kg/ngày 3,6g/kg/ngày uống 90 ngày liên tục không làm ảnh hưởng đến tình trạng chung, số đánh giá chức tạo máu, chức gan, mức độ hủy hoại tế bào gan chức lọc thận, khơng ảnh hưởng đến hình ảnh giải phẫu bệnh gan thận Chỉ số cân nặng cholesterol toàn phần có giảm khơng gây bất thường chuột Tác dụng chống viêm giảm đau Tác dụng chống viêm cấp - TD0015 liều 1,2g/kg chưa thể rõ tác dụng chống viêm cấp chuột cống trắng mơ hình gây phù chân chuột, có tác dụng thời điểm sau 24 gây viêm, có tác dụng chống viêm cấp nghiên cứu mơ hình gây viêm màng bụng chuột - TD0015 liều 3,6g/kg có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt chuột cống trắng mơ hình gây phù chân chuột, thể tất thời điểm có tác dụng chống viêm cấp nghiên cứu mơ hình gây viêm màng bụng chuột Tác dụng chống viêm mạn TD0015 liều 2,4g/kg/ngày liều 7,2g/kg/ngày có tác dụng chống 24 viêm mạn tính mơ hình gây viêm mạn chuột nhắt trắng thông qua giảm trọng lượng u hạt, giảm số lượng tế bào viêm vùng vỏ khối u hạt Tác dụng tương đương methylprednisolon liều 10mg/kg/ngày Về tác dụng giảm đau TD0015 liều dùng 2,4g/kg/ngày liều 7,2g/kg/ngày có tác dụng giảm đau mơ hình gây đau acid acetic máy đo ngưỡng đau chuột nhắt trắng, khơng có tác dụng giảm đau nghiên cứu mơ hình mâm nóng Tác dụng điều trị thối hóa khớp - TD0015 liều 1,2g/kg có tác dụng điều trị thối hóa khớp gối chuột cống thể qua: + Làm giảm đường kính khớp gối, giảm đau cải thiện hoạt động khớp gối mơ hình sử dụng máy đo ngưỡng đau theo phương pháp Randall Selitto, máy rê kim máy Hot plate + Cải thiện cấu trúc sụn khớp gối - TD0015 liều 3,6g/kg có tác dụng điều trị thối hóa khớp gối chuột cống thể qua: + Làm giảm đường kính khớp gối, giảm đau cải thiện hoạt động khớp gối mơ hình sử dụng máy đo ngưỡng đau theo phương pháp Randall Selitto, máy rê kim máy Hot plate + Làm giảm số interleukin-1β TNF-α số đặc hiệu thối hóa khớp + Cải thiện cấu trúc sụn khớp + Tác dụng TD0015 liều 3,6g/kg mạnh liều 1,2g/kg KIẾN NGHỊ Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tính an tồn hiệu viên hồn cứng TD0015 bệnh nhân bị thối hóa khớp gối TD0015 liều cao gấp liều tương đương lâm sàng cho kết tốt liều tương đương lâm sàng, đồng thời chưa phát độc tính dùng 90 ngày liên tục Do khuyến cáo dùng liều cao gấp điều trị  ... có tác dụng giảm đau nghiên cứu mơ hình mâm nóng Tác dụng điều trị thối hóa khớp - TD0015 liều 1,2g/kg có tác dụng điều trị thối hóa khớp gối chuột cống thể qua: + Làm giảm đường kính khớp gối, ... biện pháp điều trị bao gồm: điều trị không dùng thuốc, điều trị nội khoa dùng thuốc điều trị ngoại khoa 1.2 Thuốc điều trị thối hóa khớp Các thuốc điều trị thối hóa khớp gồm thuốc điều trị triệu... định tính an tồn tác dụng điều trị thối hóa khớp gối TD0015 thực nghiệm, tạo tiền đề tiếp tục thử nghiệm lâm sàng - Ý nghĩa thực tiễn: làm sở khoa học để phát triển thuốc điều trị thối hóa khớp gối