PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ ổn nhiệt, cân điện tử, máy khử trùng, bộ pipette, bình nuôi cấy, đĩa Petri, que cấy khuẩn hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn. 2.1.2. Hóa chất và môi trường Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm này là: Ethanol, NaClO, Ka, Hygromycin, AS, 2,4-D, BAP, IAA, Agar. Các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là: LB, MS, C1, C2, C3, C4, C5, C6 (xem thành phần các loại môi trường ở phần phụ lục). 2.1.3. Vi khuẩn Chủng vi khuẩn được sử dụng là: A.tumefaciens AGL1 và GV3101. Cả hai chủng đều mang vector pCAMBIA 1301 có gen gus làm chỉ thi sàng lọc, gen kháng kanamycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng hygromycin làm chỉ thị chọn lọc thực vật. Hai chủng có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, viện Di truyền nông nghiệp. 2.1.4. Đối tượng nghiên cứu Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. - Nguyên tắc: Sử dụng các dung dịch khử trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi khuẩn (bởi vì hạt đậu tương được thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm). - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển bình thường. - Hóa chất: Ethanol, NaClO, nước cất vô trùng. - Tiến hành: khử trùng hạt được tiến hành trong tủ cấy vô trùng và theo quy trình khử trùng hạt được cải tiến từ quy trình của Xue R.G. et al. (2006)[31]. * Ngâm hạt với nước cất vô trùng trong 30 phút (hạt được bỏ trong bình tam giác 250ml với số lượng 20-25 hạt). * Lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút. * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 1 lần. * Lắc hạt với NaClO với các nồng độ 10%; 12,5%; 15%; 20% trong thời gian 5; 10; 13,5 phút. * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 5-6 lần (rửa đến khi hết bọt). * Dùng dao và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt. * Cấy hạt vào môi trường nảy mầm MS, cho hạt nảy mầm trong 2-3 ngày. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26. 2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa vào nghiên cứu của Xue R.G. et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. X-gluc được sử dụng để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft et al. [30]. ♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 - Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực vật và có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật. Tuy nhiên, mỗi chủng có cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật. - Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thể chuyển gen gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao - Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C 1 và C 2, X-gluc. - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có chứa Ka, nuôi trong tủ 28 0 C qua đêm. Sau đó đem bảo quản trong tủ 4 0 C (sử dụng 2-3 tháng kể từ ngày nuôi). Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 28 0 C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1. • Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4): Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37 0 C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26. Hình . Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. - Nguyên tắc: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của A.tumefaciens. Nếu trong dịch khuẩn mà mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ làm cho hiệu quả biến nạp vào mẫu thấp và gây chết mẫu. Còn nếu mật độ vi khuẩn ít thì hiệu quả biến nạp thấp. - Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sống và phát triển bình thường có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường) , hiệu quả biến nạp cao. - Vật liệu: : hạt đậu tương đã nảy mầm 1 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C 1 và C 2. - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AA43 từ đĩa thạch rên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l trong tủ lắc 28 0 C cho đến khi đạt nồng độ OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1. • Tiến hành chuyển gen theo quy trình được tóm tắt như hình 5: Ngâm nửa hạt một ngày tuổi có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn A.tumefaciens có OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C 1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C 2 trong 5 ngày. Hình . Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) lên biểu hiện gus của giống đậu tương ĐT26 Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37 0 C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26. - Nguyên tắc: Sử dụng chủng A.tumefaciens chủng AGL1, là loại vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen cho tế bào vật chủ. Dựa vào các gen chỉ thị để nhận biết sự thành công của việc chuyển gen. - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường). - Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector có chứa gen gus, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C 1 và C 2 . - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 28 0 C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS). • Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 6): Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với các khoảng thời gian 30, 45, 60 và 90 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C 1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C 2 trong 5 ngày. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37 0 C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. Hình . Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến biểu hiện gus trên giống đậu tương ĐT26 - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. - Nguyên tắc: Sử dụng A.tumefaciens AGL1 mang vector pCAMBIA1301 để chuyển gen vào đậu tương, nốt lá mầm của hạt đậu tương bị làm tổn thương bằng kim và vi khuẩn sẽ xâm nhập dễ dàng hơn ở vị trí bị tổn thương do tại đó thực vật tiết ra các chất có bản chất phenolic (AS, Hydroxyl acetosyringon) là hợp chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường). - Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C 1 và C 2 , kim vô trùng (đường kính 0,11mm, dài 7cm). - Tiến hành: ● Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 28 0 C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp. ● Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Chia đôi số lượng hạt 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1. Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, phần rễ của hạt, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C 1 (có bổ xung AS). Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau đó, sử dụng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm). Sau khi làm tổn thương nốt lá mầm thì ngâm vào dung dịch C 1 (có bổ xung AS). ● Tiến hành chuyển gen (tóm tắt ở hình 7): Hình . Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến biểu hiện gus. Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm đã chuẩn bị ở trên (cả nốt lá mầm nguyên và bị tổn thương) vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với thời gian là 60 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C 1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C 2 trong 5 ngày. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37 0 C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen - Nguyên tắc: Sau các thí nghiệm từ 1 đến 5, chúng tôi đã thử nghiệm với các yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen cũng như ảnh hưởng đến việc tái sinh cây chuyển gen như xác định thời gian thích hợp khi khử trùng mẫu hạt bằng dung dịch khử trùng, xác định chủng A.tumefaciens thích hợp với giống đậu tương ĐT26, xác định mật độ vi khuẩn thích hợp, xác định thời gian lây nhiễm thích hợp cũng như so sánh hiệu quả biến nạp giữa việc làm tổn thương và không làm tổn thương vị trí nốt lá mầm trên hạt. Từ đó, xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen. - Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sau khi chuyển gen có khả năng tái sinh cao tức là tỷ lệ % mẫu sống cao, tỷ lệ % mẫu chết và nhiễm thấp. - Vật liệu: bao gồm toàn bộ các vật liệu đã sử dụng ở thí nghiệm từ 1-5. - Tiến hành (quy trình được tóm tắt như hình 8): • Khử trùng hạt đậu tương ĐT26 theo quy trình như thí nghiệm 1 với Ethanol 75% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút. Tách vỏ và cho hạt nảy mầm trong MS 2-3 ngày. • Sau 2-3 ngày nảy mầm, dùng dao tách bỏ 1 lá mầm của hạt, chỉ giữ lại 1 lá mầm có cùng với nốt lá mầm. Sau đó dùng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm), ngâm vào trong dung dịch C1 trong 30 phút. Sau đó, tiến hành lây nhiễm mẫu và vi khuẩn AGL1 bằng cách ngâm mẫu trong dịch khuẩn AGL1 có OD = 0,8 trong 60 phút. Và đồng nuôi cấy trong C2 trong 5 ngày. • Sau đồng nuôi cấy, chuyển mẫu sang môi trường C3 có chứa kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn cũng như để chọn lọc thực vật trong 8 ngày ở 26 0 C với chu kì 18/6h sáng tối. • Sau 8 ngày, sử dụng dao cắt bỏ lá mầm, chỉ giữ lại phần nốt lá mầm và tiếp tục chuyển mẫu sang môi trường C4 trong 21 ngày để nhân chồi. • Sau 21 ngày thì chuyển mẫu sang môi trường C5 để kéo dài chồi đến khi chồi dài 3- 5cm thì chuyển tiếp sang môi trường C6. • Ở C6, đợi khi nào mẫu ra rễ thì chuyển cây ra đất. Hình . Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 ► Thí nghiệm 7.1: Tách chiết ADN từ lá cây đậu tương chuyển gen T0 * Vật liệu thực vật . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm Các thiết bị. nghiệp. 2.1.4. Đối tượng nghiên cứu Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tạo