Công nghệ ENZYME ENZYME TECHNOLOGY

Trang 1

Ẫ Z?, E' CễNG NGHỆ ENZYME ENZYME TECHNOLOGY a> “ = pepaico femal Og ts 29/09/2011 11:21 SA ‡vmench

giỏ Cừng nghệ enzyme

+ _ “Without enzymes there can be no life”

+ Enzyme: lỏ cõc phức hợp protein hớnh cầu, trong tế bỏo sống, thực hiện cõc xỷc tõc sinh hụa chuyền đổi cơ chất một cõch nhanh chụng

‹Ổ Cừng nghệ Enzyme : sự sản xuất enzyme cho cõc

mục đợch cừng nghiệp chế biến thực phẩm, y học,

phục hồi sinh học (bioremediation),

Ậ@( * @œ°

29/09/2011 11:21 SA

3 Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Cừng nghệ enzyme

- _ Sản xuất vỏ sử dụng enzyme lỏ lĩnh vực thỏnh cừng nhất của CNSH vỏ gia tăng 12% họng năm trong suốt 10 năm qua + Cụ hơn 400 cừng ty khắp thế giới sản xuất enzyme, chóu óu

chiếm đa số (60%)

}ẩ)! “lcê tagđtđ l1 Tate 33 eat Sees! Were pret ee

™ 7 eh vs — .( Ob + Ậ Ậ ˆ.* ste ‹ mx & rae

29/09/2011 11:21 SA 2 Nguyễn Hữu Trợ Oo

- Do cụ cấu hớnh gấp cuộn rất phức tạp nởn mỗi enzyme chỉ xỷc tõc được phố hẹp cơ chất, trong một giới hạn cơ chất vỏ nhiệt độ

-Ổ Trong ứng dụng cừng nghiệp, tạo sản phẩm cụ chất

lượng cao, ợt sản phẩm phụ, dễ tỉnh sạch,

Enzyme khừng độc vỏ cụ khả năng bị phón giải (thón thiện mừi trường)

Cụ thể được tạo ra một lượng lớn nhờ vi sinh vật

Tham gia giải quyết cõc vấn đề xọ hội hiện đại: sản xuất lượng thực, thiếu hụt vỏ bảo tồn năng lượng, cải

thiện mừi trường, cỳng với cõc ứng dụng y học 29/09/2011 11:21 SA

4 Nguyễn Hữu Trợ oO

giỏ Vai trú xỷc tõc của enzyme

- Năng lượng hoạt hụa tức lỏ mức nắng lượng cõc

chất tham gia phản ứng phải đạt được

Trang 2

Phản ứng Saccharose + H;O-—› glucose + fructose | H;O;-› H;O + 1/20,

(calo/mol) (calo/mol)

Khừng xỷc tõc | 32.000 18.000 Xỷc tõc vừ co’ | (H*) 25.000 (Pt) 11.700

Enzyme (saccharase) 9.400 (catalase) 5.500

29/09/2011 11:21 SA 7 Nguyễn Hữu Tợ S

€Ồỏ Phón loại enzyme theo cấu tạo

Apoenzym hay apoprotein: chỉ cụ protein trong thỏnh

phần cấu tạo của nụ

Coenzym: enzym cụ protein kết hợp với phón tử kim loại tạo thỏnh phức hữu cơ — kim loại

Cõc đồng yếu tố được gọi lỏ nhụm ngoại prosthetic Cún phức chất chứa cả hai yếu tố được gọi lỏ enzym

hoỏn chỉnh — holoenzym

29/09/2011 11:21 SA 9 Nguyễn Hữu Trợ oj

&m Danh phõp quốc tế vỏ phón loại

enzyme

Phón loại:

° Oxidoreductase: xỷc tõc phản ứng oxi hụa khử,

chuyển electron, H, O

+ Transferase: xỷc tõc phản ứng chuyển nhụm chức

năng từ chất cho sang chất nhận

+ Hydrolase: xỷc tõc phản ứng thủy phón (Hydrolysis

reacfion)

29/09/2011 11:21 SA " Nguyễn Hữu Trợ c3

Đặc điểm Chất xỷc tõc vừ cơ Chất xỷc tõc hữu cơ seas Phan tir nhd gdm val] .„

Bản chất hụa học nguyởn tố (Pt, HCI ) Đại phón tử protein

Tăng tốc độ phản ẻ 1qz_ 4e tỏn ứng 408 ~ 101 lần Cao (2 100%) Thắp (36 — 45%)

Cõc điều kiện: eareunen Acid hoặc kiềm mạnh | pH sinh ly x

Cao (val atm) Ap suat khi quyờn (1 atm)

Nhiệt độ thich hop | Cao ( 100%c) Thấp (36 — 45%)

pH thợch hợp nhất |Acld hoặc kiềm mạnh pH sinh lý

đị Danh phõp quừc tở vỏ phón loại

`” enzyme

° Danh phõp:

Í Tởn thừng thường: trypsin, pepsin, renin

- Tởn hệ thống: tởn cơ chất - tởn kiểu phản ứng

Pyruvate — decarboxylase lỏ enzyme khử CO2 của acid pyruvic

Glucophosphate -— isomerase [a enzyme giỷp

chuyờn gờc phosphate trong glucose

29/09/2011 11:21 SA 10 Nguyễn Hữu Tri oO

eas Danh phõp quốc tế vỏ phón loại enzyme

s Lyase: xỷc tõc phản ứng cắt liởn kết hụa học (chemical

bonds)

* Isomerase: xtic tac phản ứng chuyển hụa một cơ chất thỏnh

một dạng đồng phón của nụ (isomer)

Í Ligase: xỷc tõc phản ứng liởn kết 2 nguyởn tử (C-O, C-ư, C-

N, C-C, phosphoric ester, C-kim loại)

Trang 3

STT Nhụm enzyme Phản ứng xỷc tõc

1 Oxidoreductase | Chuyờn e-,, H+ hoặc nguyởn từ H) A-+B‹› A+B-

2 Transferase Phản ứng chuyển nhụm chức = A-B+C<+A+B-C

3 Hydrolase Phón ứng phón ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhụm

chức cho phón tử nước) : A-B + H;O <› A-H + B-OH

4 Lyase Phản ứng chuyển hụa nhờ bổ sung nhụm chức vỏo

liởn kết đừi hoặc tạo liởn kết đừi nhờ lấy đi nhụm chức (phón giải khừng cụ nước tham gia)

XY

| |

A-B <> A=B + X-Y

5 Isomerase Chuyển nhụm chức trong phón từ tạo cõc dạng đồng

phón

XY YX

Il od |

A-B o A-B

6 Ligase Tổng hợp liởn kết C-C, C-S, G-O vỏ C-N nhờ phản ứng trỳng ngưng liởn hợp với sự thủy giải ATP

giỏ Danh phõp quốc tế vỏ phón loại

enzyme

fee) af ' + m 4 Seow ee Pd

I 1

"The: See |) Sew | ợi tự

6á Tợnh đặc hiệu của enzyme

- Đặc hiệu phản ứng

* Dac hiệu cơ chất — Đặc hiệu tuyệt đối — Đặc hiệu tương đối

— Đặc hiệu nhụm

— Đặc hiệu đồng phón quang học

29/09/2011 11:21 SA 1 Nguyễn Hữu Trợ c3

đỏõ Danh phõp quốc tế vỏ phón loại

„” enzyme

— 0 lạ | ke

my _- l4 =>

te trees — 5 :

ome : : è `

29/09/2011 11:21 SA 14 Nguyễn Hữu Trợ oO

€Ề cường lực xỷc tõc lớn

1 gam Rennine cụ thể góy đừng tụ 7,2 tấn sữa

( 4 3 â0 H;O,—— 90 H,O+ 510, 29/09/2011 11:21 SA 16 Nguyễn Hữu Trợ oO đi Đặc hiệu phản ứng

* Oxy hoa nho oxydase:

Trang 4

_ Đặc hiệu tuyệt đối

Urea Urease | CO, + 2NH, NH;-CO-NH; H,0

Acetamide Urease Khừng xảy ra NH;-CO-CH; H,O

29/09/2011 11:21 SA 1 Nguyễn Hữu Trợ F

giỏ Đặc hiệu nhụm Ễ Carboxyl peptidase R R—G—N-CH-+- —r— R~C—OH + NHz-Ch vs OH đooH O COOH R Carboxyl peptldase R’ R-@-N-GH H,O R-f-N- H O H CH, O H GH, COOH COOH 29/09/2011 11:21 SA 21 Nguyễn Hữu Trợ PY - P|

Chymotrypsin Has A Site for Specificity

giỏ Đặc hiệu tương đừi

CH,-O-CO-R, LIPASE CH,-O-H HOOC-R, CH -O-CO-R, "no.n - CH -O—H +HOOC —R, CH, - O— CO -R, CH,-O-H HOOC-R, Enzym cụ khả năng tõc dụng lởn một kiểu nối hoõ học nhất

định trong phón tử cơ chất mỏ khừng phụ thuộc vỏo cầu tao của cõc phần tham gia tạo thỏnh kiểu liởn kết đụ

29/09/2011 11:21 SA 20 Nguyễn Hữu Tợ @-= vẻ P|

đỏ = Đặc hiệu đồng phón quang học

H H-COOH

H,COOH Ỷ , HOOC-CH +H;O

L— malic Acid fumaric

OOH Fumarathydratase

HO-

29/09/2011 11:21 SA 22 Nguyễn Hữu Tri „ ” ]

Specificity of Ser-Protease Family

Trypsin Chymotrypsin Elastase

cut at Lys, Arg cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly

Shallow and non-polar

pocket

Trang 5

& Enzyme

-Ổ Cừng nghiệp tổng hợp enzyme cần thiết cho ngỏnh

cừng nghệ thực phóm vỏ nước giải khõt Enzymes

cũng được sử dụng trong phón tợch y học vỏ cừn nghiệp vỏ ngỏy nay chỷng được thởm vỏo bột giặt (cellulase, protease, lipase)

+ Enzyme cụ thể được tổng hợp bởi thực vật, động

vật, vi sinh vật hoặc nuừi cóy mừ động ,thực vật

- Cõc enzyme động thực vật cụ thể được từng hợp

nhờ quõ trinh lờn men vi sinh vat Hau het cõc enzyme duoc tong hop trong tropophase thi

amylases (bởi Bacillus stearothermophilus) được

từng hợp trong idiophase, vớ vậy nụ lỏ chất biởn

29/09/2011 11:21 SA 25 dưỡng thứ cấp Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Lịch sử phõt triởn enzyme

1897, Eduard Buchner phõt hiởn khả năng lởn men của

dịch chiết nấm men 1907, ừng nhận nobel prize cho

phõt minh “cell free fermentation”

1926, James B Sumner kết tỉnh enzyme urease vỏ 1937 cho enzyme catalase

1930, Northrop vỏ Staley kết tỉnh enzyem pepsin

Thế chiến thứ 2, sản xuất khõng sinh theo qui mừ cừng

nghiệp 29/09/2011 11:21 SA 27 Nguyễn Hữu Trợ oj ii — Cầu trỷc lysozyme Su trỷ 60 ee re, + > ể Ậ bục > Ys ‘a Y = v> >2 + ẳ a + + 2 ta ca ‘ 2 Ậes vie = ~3 ` ` : gr - 4 ~~ * Ò > a ` kh “ Ẩ ta S 4 er : : os ace? Í ` `x:x-ế * 29/09/2011 11:21 SA 29 Nguyễn Hữu Trợ c3

giỏ Lịch sử phõt triển enzyme

Cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19, sự phón giải cõc chất

nhờ enzyme đọ được ghi nhận nhưng cơ chế vẫn

chưa biết

Thế kỷ 19, Louis Pasteur phõt hiện một chất cụ khả

năng xỷc tõc trong quõ trớnh lởn men chuyờn hụa

đường thỏnh rượu gọi lỏ ferment cụ trong tế bỏo nấm

men

1877, Wilhelm Kuhne, sinh lý học người Đức đầu tiởn dỳng thuật ngữ enzyme

Thế chiến thứ 1, Weitzman sản xuất aceton ở Anh

Nguyễn Hữu Trợ Oo 29/09/2011 11:21 SA 26

@& — Lịch sử phõt triển enzyme

Lysozyme lỏ enzyme được xõc định cấu trỷc đầu tiởn vỏ năm 1965

1969, xóy dựng qui trớnh cừng nghiệp sản xuất amino acid sử dụng enzyme

1972, Boyer et al õp dụng kỹ thuật di truyền trong

cừng nghệ enzyme

1973, sản xuất aspartic acid bằng lởn men cố định tế

bỏo

1984 đến nay, phõt hiện hỏng trăm loại enzyme khõc

nhau vỏ ứng dụng rộng rọi

ia `

Cừng nghệ sản xuất enzyme từ vi

sinh vật

Trang 6

gỏ Sinh vật như một hệ thống mở chế

tạo enzyme

Sinh vật được xem như hệ thống mở liện quan mật

thiết đến quõ trớnh trao đổi chất giữa tế bỏo vỏ mừi

trường bởn ngoỏi

Quõ trớnh trởn lỏ con đường chuyển hoõ chợnh đụng vai trú quan trọng chu trớnh chuyền hoõ cõc chất trong tự nhiởn

Cõc phản ứng trong vỏ ngoỏi tế bỏo trong chu trớnh

chuyển hụa trởn được xỷc tõc bởi một chất xỷc tõc

sinh học cụ bản chất protein, được gọi lỏ enzyme Tuỳ theo nơi xỷc tõc trong hoặc ngoỏi tế bỏo: enzyme nội bỏo vỏ enzyme ngoại bỏo

Nguyễn Hữu Tợ S 29/09/2011 11:21 SA 31

€ỏ Nguồn enzyme chủ yếu từ vi sinh vật

1960, 70% enzyme từ thực vật vỏ động vật

Ngỏy nay, enzyme từ nguồn vi sinh vật chiếm 90% thị

trường

Vi sinh vật lỏ nguồn enzyme duy nhất trởn qui mừ cừng

nghiệp

Chuyởn hụa khối lượng lớn cơ chất

Nguyởn liệu sản xuất rẻ tiền, dễ kiếm, khừng bị biến

đừng theo mỳa

^ aA " " za

đi Tuyởn chọn giồng vi sinh vat cho enzyme co hoat tinh cao

* Cõc nhỏ di truyền học khi chọn lựa cho cừng nghiệp sản xuất enzyme phải tớm những đặc tợnh mong muon toi wu:

— san pham enzyme cao — khừng phụ thuộc chất cảm ứng — dễ dỏng thu nhận

+ Cố gắng loại bỏ hoặc ức chế những đặc tợnh

khừng mong muừn

— những chất đồng biến dưỡng cụ hại

— mỳi, mỏu

giỏ Ưu thế

Enzyme thu nhận từ vỉ sinh vật cụ hoạt tợnh cao

Chủ động về nguyởn liệu nuừi cấy vỏ giống vi sinh vật Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn nởn cụ thể thu hoạch nhiều lần quanh năm

Co thờ điều khiến sinh tổng hợp enzyme dễ dỏng theo

hướng cụ lợi vớ vi sinh vật cụ khả năng cảm ứng với

mừi trường rất nhanh

Giõ thỏnh tương đối thấp vớ mừi trường nuừi cấy tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất

Vi sinh vật cụ thể tổng hợp cỳng lỷc nhiều loại

enzyme khõc nhau

giỏ Nguồn enzyme chủ yếu từ vỉ sinh vật Hoạt tợnh enzyme cao nhất

Tốc độ sinh sản nhanh

Sản xuất chủ yếu nhờ vỏo quõ trớnh lởn men chớm

Vi sinh vật sản xuất enzyme nhờ thừng tin di

truyền của chợnh nụ vỏ nguồn gene được chuyền vỏo

Tốc độ sinh tổng hợp enzyme cụ thể điều khiến

được

29/09/2011 11:21 SA x Nguyễn Hữu Tri oO

đi Chọn lọc chủng sản xuất enzyme

ae 5! te "` oe

Trang 7

a = Ban chat sinh hoc cua enzyme

Enzyme được tạo ra trong tế bỏo sinh vật

Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bỏo sống vỏ khi đươc tõch khỏi tế bỏo sống

Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ừn hoỏ

Enzyme tham gia xỷc tõc từ giai đoạn đầu đến giai

đoạn giải phụng hoỏn toỏn năng lượng dự trữ Enzyme co thờ thuc hiện một phản ứng đơn lẻ Phản ứng cụ enzyme giỷp tiết kiệm năng lượng

Enzyme chịu sự điều khiển của gene va điều kiện phản

29/09/2011 11:21 SA 37 ứng Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Cau tric enzyme

Trung tam hoạt động (active site) + Cơ chất cụ cấu trỷc phón tử thợch hợp với trung tóm hoạt động của enzyme mới cụ thể kết hợp

với trung tóm hoạt động tạo phức enzyme — cơ

chất

Cõc loại enzyme thường tạo ra trung tóm hoạt

động cụ cấu trỷc khừng gian nhất định

Thuyết trung tóm hoạt động linh hoạt của

Koshland: cơ chất lỏm thay đổi cấu trỷc khừng

gian của trung tóm hoạt động, giỷp trung tóm

hoạt đừng tham gia xỷc tõc

29/09/2011 11:21 SA Í Nguyễn Hữu Trợ oj

Z od &

giỏ Cõc tiởn chất enzyme

* Tiền enzyme (proenzyme; zymogen): một số enzyme khừng cụ khả năng xỷc tõc ngay sau khi được từng hợp mỏ phải trải qua một giai đọan biởn đừi nhật định (giai đoạn hoạt hoõ)

- Tiền enzyme trải qua giai đoạn hoạt hoõ nhằm loại bỏ

đoạn peptide che lấp trung tóm hoạt đừng enzyme

Pepsinogen > pepsin Trypsinogen > trypsin Chymotrypsinogen > chymotrypsin 29/09/2011 11:21 SA 41 Nguyễn Hữu Trợ c3 đỏ Cấu trỷc enzyme

Trung tóm hoạt động (active site)

- Trung tóm hoạt động: nhụm hụa học tiếp xỷc trực

tiếp cơ chất; nhụm hụa học khừng tiếp xỷc cơ chất nhưng tõc dụng trực tiếp đến quõ trớnh xỷc

tõc

+ Gồm cõc amino acid cụ nhụm hoõ học hoạt động mạnh; ion kim loại; nhụm chức của coenzyme + Enzyme thở cụ một, hai, thậm chợ 4 trung tóm hoạt

động 29/09/2011 11:21 SA 38 Nguyễn Hữu Trợ Oo

6 Ý nghĩa quõ trớnh xỷc tõc trong

tở bỏo sinh vật

-Ổ Giảm năng lương hoạt hoõ > gắn liền quõ trớnh tiến hụa sinh vật

- Tăng tốc độ phản ứng sinh hụa trong cơ thể, giỷp tế bỏo tăng nhanh về số lương vỏ khối lượng

Trang 8

€Ằủ Cơ chế tõc dụng của enzyme

+ Trong phản ứng cụ enzyme, cơ chất được hoạt

hụa mạnh, thay đổi tợnh chất hụa học > san pham

của phản ứng

* Quõ trớnh xỷc tõc của enzyme gồm 3 giai đoạn:

* Giai doan 1: enzyme kờt hop cơ chất bằng liởn kết yếu tạo phức hợp tạm thời

* Giai đoạn 2: Cơ chất bị thay đổi cấu hớnh khừng

gian

ẬỔ Giai đoan 3: sản phẩm được tạo ra vỏ tõch khỏi enzyme

E+4S = ES = EP = E+P

29/09/2011 11:21 SA 43 Nguyễn Hữu Tợ S

@& M6 hớnh “chớa vỏ khụa” của Fisher

(1894) Cơ chất È_ Trung tóm hoạt động Cơ chất 29/09/2011 11:21 SA 45 Nguyễn Hữu Trợ oj đi Phương trớnh động học Michaelis - Menten

1913, Michaelis vỏ Menten xóy dựng phương trớnh động học giải thợch phản ứng xỷc tõc cụ enzyme

Phương trớnh thể hiện mối quan hệ giữa vận tốc

phản ứng với nừng độ cơ chất va enzyme

Enzyme kết hợp cơ chất tạo phức ES

Phức hợp chuyển hụa tạo sản phẩm P, enzyme

được giải phụng vỏ tiếp tục xỷc tõc phản ứng mới

giỏ Cơ chế tõc dụng của enzyme

lởn cơ chất

beans wet ards I

a ".a

[ Li

giỏ Mừ hớnh “khớp cảm ứng” của Koshland

(1958) Cơ chất a Cơ chất Trung tóm hoạt động 29/09/2011 11:21 SA 46 Nguyễn Hữu Trợ oO

địa Phương trớnh động học Michaclis -

x7 Menten

- Wạ: vận tốc ban đầu của

phản ứng et, eh

- V„„: Vah tờe tờidacia = | ™

phản ứng ẻ

- [S]: nồng độ cơ chất

k2 4 219

Phceet t cormart cowie

Trang 9

Gf Cõc yếu tố ảnh hưởng hoạt tợnh

M enzyme

- Nhiệt độ

pH

* Chat kiờm ham - Chất hoạt hụa

29/09/2011 11:21 SA 9 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Ảnh hưởng của nhiệt độ

’ “ĩ Ậ "1; 29/09/2011 11:21 SA 51 Nguyễn Hữu Trợ oj giỏ pH

-Ổ pH ảnh hưởng đến mức độ ion hụa của enzyme

vỏ cơ chất

- Tỳy enzyme sẽ cụ pH tối ưu khõc nhau

- Đề đạt hiệu quả xỷc tõc, nghiởn cứu vỏ xõc định

nhiệt độ vỏ pH tối ưu của enzyme lỏ rất quan

trọng 29/09/2011 11:21 SA 53 Nguyễn Hữu Trợ c3 & Nhiệt độ

Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nhiệt độ trong một giới

hạn nhất định

Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao

nhất được gọi lỏ nhiệt độ tối ưu

Mỗi enzyme cụ nhiệt độ tối ưu khõc nhau

Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tợnh enzyme giam > enzyme bi biờn tinh

Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, hoat tinh enzyme yếu nhưng cụ thể tăng trở lại khi tăng dần nhiệt độ

29/09/2011 11:21 SA s0 Nguyễn Hữu Trợ Oo

giỏ Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trang 10

gỏ Ảnh hưởng của pH pF t4 ; ——— lites Microbial rennet — ẳ VY "` == “t+ aroylase Y2-êtrẪ~n:7 œ - 0MWfWI&c — {ạ.(/y22ê b &&#0(C$o;iđ2c ——— heey wer actety opaeemn

prez act at > ê0 Ð ọớPQzXă3

29/09/2011 11:21 SA 55 Nguyễn Hữu Tợ S ia os 29/09/2011 11:21 SA ar Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Cõc yếu tố ảnh hưởng hoạt tợnh

enzyme- Chất hoạt hụa

- Giỷp tăng hoạt tợnh enzyme ở nồng độ nhất định

* Tac dụng ức chế khi vượt quõ nồng độ nỏy -Ổ Giỷp phõ vỡ một số liởn kết trong phón tử tiền

enzyme hoặc phục hồi cõc nhụm chức năng trong trung tóm hoạt đừng của enzyme

29/09/2011 11:21 SA s Nguyễn Hữu Trợ c3

& Ảnh hưởng của pH

Enzyme Nguồn gốc pHop

Pepsin Dịch vị 1,8 Trypsin Dịch tụy ư Chymotrypsin Dịch tụy 8,1- 8,6 Amylase Nước bọt, dịch tụy 7,0

Lipase Dịch tụy 7,0 — T,5

Phosphatase acid Tuyến tiền Hệt 5,0 — 5,6

Phosphatase kiờm Xưởng, gan 8,6- 9,1

€ỒỀ Chất kớm họm vỏ họat hụa enzyme Chất hoạt hoõ: lỏ chất lỏm tăng hoạt tợnh của enzyme,

chỷng cụ bản chất hoõ học khõc nhau

Chất kớm họm: Lỏ chất lỏm giảm hoạt tợnh của enzyme

do lỏm giảm õi lực của enzyme với cơ chất hoặc lỏm

enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất

a Cõc yếu tố ảnh hưởng hoạt tợnh

enzyme — chất kớm họm

-Ổ Chất kớm họm lỏm giảm hoạt tợnh enzyme nhưng

khừng bị thay đổi bởi enzyme Cơ chế kớm họm cụ thể

thuận nghịch hoặc khừng thuận nghịch

Trang 11

đa Kớm họm cạnh tranh

=

Cụ cấu trỷc gần giống cơ chất, nụ kết hợp với trung tóm hoạt động của Enzyme do đụ chiếm chỗ của cơ chất

vỏ lỏm giam hoat tinh Enzyme (H): E+S —~ ES >E+P

E+lI — El+S —› EI + S (I lỏ chất ức chế cạnh tranh)

" - 0° $ 6 —— se ee oe ~— tm Ore o:đờ P ——`—= Nguyởn Hữu Tợ S 29/09/2011 11:21 SA on Km Chất kớm họm khừng cạnh tranh

- Kết hợp với enzyme ở vị trợ ngoỏi trung tóm hoạt động

> lỏm thay đội cấu trỷc khừng gian phón tử enzyme, dẫn đến giảm hoạt tợnh enzyme - Trong trường hợp nỏy, enzyme vẫn kết hợp cơ

chất

Í Mức độ kớm họm khừng phụ thuộc vỏo sự tương

quan giữa nồng độ cơ chất vỏ chất kớm họm

29/09/2011 11:21 SA 6 Nguyễn Hữu Trợ oj @ỏ Phương phõp xõc định hoạt tợnh “= enzyme

-ề - Xõc định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm

tạo thỏnh sau một (thời gợan nhất định vỏ lượng

enzyme xac định (phương phõp phỗ biến)

- _ Xõc định thời gian cần thiết đề enzyme khảo sõt biến đổi một lượng cơ chất mất đi hay thu được lượng sản phẩm nhất định

* Xõc định nỗng độ enzyme cần thiết trong một thời gian nhất định cụ thể tạo thỏnh sản phẩm hoặc biến đổi một lương cơ chất nhất định

* Luu y: Dam bao dieu kiện pH, nhiệt độ, thời gian,

chất hoạt hụa hoặc chất lỏm bởn enzyme

Nguyễn Hữu Trợ c3 29/09/2011 11:21 SA 65

giỏ Kớm họm khừng cạnh tranh Cụ cấu tạo hoõ học khõc cơ chất, gắn với enzyme ở vị trợ

khừng nhất định, cụ thể ở ngoỏi trung tóm hoạt động

— = 5 —> -—~-—-; a > Ps Nguyễn Hữu Trợ Oo 29/09/2011 11:21 SA

@& Kim ham bdi san pham phan tng

Sản phẩm P sau phản ứng đụng vai trú giống chất

kớm họm khừng cạnh tranh

đi Phương phõp xõc định hoạt tợnh

enzyme

Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): lượng enzyme xỷc tõc được 1umol cơ chất sau một phỷt ở điều kiện tiởu chuẩn

Katal: Lương enzyme cụ khả năng xỷc tõc lõm chuyền

hụa được một mol cơ chất sau một gióy ở điều kiện tiởu chuẩn

Hoạt độ riởng: Số đơn vị WI (katal) ứng với một mi

dung dịch hoặc gram chế phẩm khừ

Hoạt độ riởng của phón tử: Số phón tử cơ chất được

chuyền hụa bởi một phón tử enzyme trong một đơn vi thời gian

Trang 12

@ỏ — Qui trớnh sản xuất enzyme

- Sinh tổng hợp enzyme

- Thu nhận enzyme: phõ vỡ tế bỏo, tõch enzyme, cừ đặc enzyme

* Tinh sach enzyme

- Hớnh thỏnh cừng thức chế pham enzyme (enzyme

product formulation)

29/09/2011 11:21 SA 67 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Phương phõp đồng hụa bằng mõy xay sinh tố

* Thich hợp phõ cõc mừ mềm

như gan, tim, cơ, Í° Thực hiện nhanh trong 5 —

10 phỷt ở nhiệt độ 49G

- Sau khi đồng hụa, dịch đồng hụa được li tóm ở 23

000 g trong 1 giờ ở 4 °C, thu

dịch nỗi 29/09/2011 11:21 SA 6 Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Phõ vỡ tế bỏo bằng mõy French press

- Húa trộn tế bỏo vỏo dung dịch

buffer thợch hợp vỏ nạp vỏo mõy

Tế bỏo bởn trong mõy French press đang ở õp suất rất cao, nhach chong bi day ra õp suất khi quyờn

Sự thay đổi õp suất đột ngột lỏm tế bỏo bị vỡ Li tóm ở 23 000 g trong 1h ở 4 %C, thu dịch nỗi 29/09/2011 11:21 SA lẻ Nguyễn Hữu Trợ c3

€Ÿỏ Thu nhận enzyme - Phõ vỡ tế bỏo

- Phõ vỡ tế bỏo bằng phương phõp vật lý: — Phương phõp đồng hụa bằng mõy xay sinh tố — Phương phõp đồng hụa bằng mõy đồng hụa — Phõ vỡ tế bỏo bằng mõy French press

— Phương phõp nghiền với alumina hay cõt — Phương phõp nghiền với bi thủy tỉnh — Phương phõp siởu óm

@ủỏ Phương phõp đồng hụa bằng mõy

“~ đồng hụa (tế bỏo động vật) a o—, | = * —_e x aA yee "

đi Phương phõp nghiởn với alumina hay cõt

- Dỳng chỏy nghiền tế bỏo với cõt thạch anh, hoặc cõt nhừm (2 lần khối lượng tế bỏo)

- Húa hỗn hợp nghiền trởn vỏo dung dịch buffer

thợch hợp (3 — 4 lần thể tợch tế bỏo)

Ậ Dịch trởn được li tóm ở 23 000 g trong 1 gid & 4 °C,

thu dịch nỗi

Trang 13

€fỏ Phương phõp nghiền với bi thủy tỉnh

- Thường dỳng cho tế bỏo nấm men

- Cho 0.1 — 3 g tế bỏo vỏo cõc ống polysterene

- Thởm vỏo 1 thể tợch buffer phỳ hợp

- Thởm vỏo 1- 3 g bi thủy tỉnh lạnh/ 1 gam tế bỏo

- Vortex 5 lần trong 1 phỷt

- _ Li tóm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 °C, thu dịch nỗi

29/09/2011 11:21 SA 73 Nguyễn Hữu Tợ S

@& Thu nhan enzyme — Pha vo tờ bao

Ậ2 Phương phõp hụa học: dựa trởn khả nắng tạo õp suất thẳm thấu hoặc khả năng oxy hụa manh của chất hụa học > Khừng cần õp suất cao, ợt chỉ phợ nhưng thường bị lẫn hụa chất vỏo hỗn hợp

3 Phương phõp sinh học (phương phõp enzyme)

Phương phõp tự phón: tạo điều kiởn enzyme tối ưu cho một số enzyme phón giải thỏnh phần thỏnh tế bỏo

Thủy phón cả những chất khõc vỏ enzyme

Phương phõp sử dụng enzyme từ ngoỏi tế bỏo: sử

dụng enzyme hệ cellulase xử lý thỏnh tế bao nam men vỏ tế bỏo thực vật

Lưu ý: Huyền phỳ tế bỏo vi sinh vật phải được ly tóm,

lọc đề thu enzyme ngoại bỏo

29/09/2011 11:21 SA T5

ae Phương phõp phõ vỡ tế bỏo bằng

mõy siởu óm

Sụng siởu óm tạo rung

động mạnh phõ võch tế

bỏo

Mừ được cho vỏo 2 lần thể =|

tich buffer |

Tiến hỏnh siởu óm ở mức LỄ |

cao nhất trong 2 phỷt E

Li tóm 23 000 q trong 1 giờ |

mm =a Nguyễn Hữu Trợ Oo 29/09/2011 11:21 SA 74 Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Thu nhận enzyme - Phương phõp

cừ đặc

* Phương phõp nhiệt

- Phương phõp kết tủa

- Phương phõp tham tich (dialysis) Í Phương phap siờu loc (ultrafiltration)

29/09/2011 11:21 SA T7

@& Thu nhan enzyme — Tach enzyme

Phương phõp ly tóm: tõch vật rắn ra khỏi dung dịch, thực hiện trong điởu kiện nhiệt độ thập, trong cừng nghiệp người ta thường dỳng mõy ly tóm liởn tục

Phương phõp lọc: tõch phần rắn ra khỏi dung dịch Lọc ờp: dung dịch cần lọc cụ khối lượng nhỏ

Lọc chón khừng: sử dụng nhiều trong sản xuất vỏ nghiởn

cứu

Lọc theo dúng chảy cắt ngang: nguyởn liệu chảy song song vật liệu lọc

Lọc thừng thường 29/09/2011 11:21 SA 76 Nguyễn Hữu Trợ oO

Nguyễn Hữu Trợ c3

@Ẽ Phương phõp nhiệt

* Lỏm bốc hơi nước, cừ đặc dung dịch enzyme, giỷp tăng hoạt tợnh enzyme

Trang 14

giỏ Phương phõp kết tủa

- Kết tủa bằng muối (amonium sulphate; NaCl) > thẩm tợch

+ Dung mừi hữu cơ (ethanol; acetone) * Dung polymer

- Kết tủa ở điểm đẳng điện

29/09/2011 11:21 SA 7 Nguyễn Hữu Tợ S giỏ Phương phõp thẩm tợch saad Í court “+ 29/09/2011 11:21 SA „1 Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Một số mỏng siởu lọc thừng dụng

Cerrenen UWitrailirefion Dewko

*e ờ‹Ò s44 ( \Vectwme:

‘now ody Ce Ue “wer

oul: — uh VWbew ted he se

giỏ Phương phõp thắm tợch

Tham tõch dựa trởn nguyởn tắc sự khuếch tõn cõc phón tử từ nơi cụ nồng độ cao sang thấp

Dung dịch enzyme được chứa trong mỏng bõn thắm vỏ ngóm trong beaker cụ chứa dung dịch buffer thợch hợp Mỏng bõn thẫm cho phờp cõc phón tử cụ kợch thước nhỏ hơn phón tử enzyme đi qua mỏng thừng qua sự khuếch tõn

qua cõc lỗ nhỏ trởn mỏng

Quõ trớnh thẫm tõch thực hiện ở 4° C kết hợp khuẫy nhẹ

Thay dung dịch buffer sau † — 2 giờ

Sau khi thóm tợch, dỳng pipetteman hỷt dung dịch ra khỏi

tỷi thẫm tợch 29/09/2011 11:21 SA 80 Nguyễn Hữu Trợ Oo

giỏ Phương phõp siởu lọc

Sử dụng mỏng lọc với kợch thước lỗ lọc siởu nhỏ, õp suất cao (nitrogen pressure) được sử dụng 100 — 500 Kpa, khừng dỳng khừng khợ nhằm trõnh sự oxi hụa enzyme Ap dung dúng chảy ngang cross — flow giỷp trõnh tat

nghẹt lỗ lọc

Cõc phón tử enzyme quan tóm được giữ lại trong mỏng trong khợ cõc phón tử kợch thước nhỏ đi qua cõc lỗ trởn mỏng

Loại bỏ dung mừi vỏ phón tử kợch thước nhỏ hơn kợch

thước enzyme 29/09/2011 11:21 SA 82 Nguyễn Hữu Tri oO

& Tinh sach enzyme

Phương phõp kết tỉnh: dỳng dung dịch amonium sulfate, khụ thực hiởn để cụ enzyme cụ độ tỉnh sạch cao

Phương phõp sắc ký

Phương phõp điện di: chưa õp dụng trởn qui mừ cừng nghiệp

29/09/2011 11:21 SA a Nguyễn Hữu Trợ Oo

Trang 15

đ@ủỏ Hớnh thỏnh cừng thức chế phẩm

” enzyme

Cừng việc mang tợnh bảo mật, thừng tin cừng thức chế

phẩm được giữ kợn bởi nhỏ sản xuất

Bợ mật cụ thể được tiết lộ kộm theo nhiều điều kiện rỏng buột trởn hợp đồng

Lỏ bước chợnh trong qui trớnh sản xuất enzyme

Cừng thức chế phẩm bao gồm thỏnh phần trong enzyme

thỏnh phẩm giỷp bảo quản, duy trớ hoạt tợnh enzyme, những chỉ dẫn vỏ những qui định chặc chẽ về việc sử dụng chỷng

Qui định trởn tỳy thuộc vỏo mục đợch sử dụng của

29/09/2011 11:21 SA 85 enzyme Nguyễn Hữu Tợ S

miicac enzyme vỏ quõ trớnh chế biến thực phẩm

Cõc enzyme khừng thở thiếu được trong kỹ thuật chế biến thực

phẩm hiện đại

Cõc enzyme lỏ một phần cần thiết của hầu hết quõ trớnh lởn men thức ăn vỏ thức uống, vỏ trong khi hầu hết cõc enzyme sẽ cụ nguồn gốc từ cõc vi sinh vật thớ cỏng cụ nhiều cõc quõ trớnh

đang được cải thiện bởi sự thởm vỏo cõc enzyme ngoại sinh

Đõ, ott

đỏ Sử dụng cừng nghệ rDNA —>Sự cải thiện được tăng cường rử rỏng ở giõ trị , sự tỉnh sạch vỏ giõ cả của enzyme -> sẽ

dem lại lợi ợch vỏ cải thiện chất lượng thực phẩm cho người tiởu dỳng OT co ưu ts et gy ee et on pe ~ 2-8 re ee TT ằ .= — ae ° V oo ome trons — — - — ee eo ree — x" — —=— ee - ` ie

oe hwo we wee SỈ ‘oe —s * oe wee

ore OF ee ——

_*ư eee ee wore se —* ee + seẰ

†È———

++ one ~~ s i ờ< — ae #5 %

—- — ~~ -.- 7m

`

— eee’ fee ee — poo “* =e

| =

VI sinh vật Ứng dụng

Aspergillus oryzae Amylases Aspergillus niger Glucamylase Trichoderma reesii Cellulase Saccharomyces cerevisiea Invertase Kluyveromyces fragllis Lactase Saccharomycopsis lipolytica Lipase

Aspergillus species Pectinases va proteases Bacillus species Proteases

Mucor pusillus Rennet vé sinh

Mucor melhel Rennet vi sinh

= `

Ngỏy cỏng cụ nhiều sự sản xuất enzyme thực phầm sử dụng cừng nghệ sinh học tõi tổ hợp DNA- rDNA

Việc sử dụng được chấp nhận của cõc enzyme bởi cừng nghệ rDNA thớ

dựa vỏo cõc điởu kiện sau:

+ Enzyme được tạo ra bởi cừng nghệ sinh học rDNA thớ giống với những enzyme trong tự nhiởn

Ậ Sự chuẩn bị enzyme khừng bị nhiễm bất kỳ cõc chất độc nỏo mỏ cụ thể

được đưa vỏo trong suốt quõ trớnh chế biến hay tỉnh sạch (Vợ dụ cõc nội độc tố từ Escherichia coli)

+ Cõc vi sinh vật sống sớt bất nguồn từ cừng nghệ rDNA khừng hiện diện ở bước chuẩn bị cuỗi cỳng

Trang 16

đỏ Enzyme tự do - Nhược điểm: - Lẫn vỏo sản phẩm

- Hoạt tợnh giảm dần sau mỗi phản ứng xỷc tõc

- Khừng bỏn nhiệt, acid, kiềm, dung mừi hữu cơ

29/09/2011 11:21 SA vA Nguyễn Hữu Tợ S

€ Lợi ợch của việc sử dụng enzyme cố định

+ Giảm giõ thỏnh do enzyme được sử dụng lặp đi lặp lại, chế phẩm bền hơn trong cõc điởu kiện pH,t, õp suất thóm thấu tối ưu, bền nhiệt, cụ thể hoạt động ' trong điều kiện nghiởn ngặt hơn - Enzyme cố định thường ừn định hơn so với dạng

húa tan của nụ vỏ cụ thở tõi sử dụng ở dạng tỉnh khiết, bõn tỉnh khiết hoặc dạng toỏn tế bỏo

— Vd: glucose isomerase cố định cụ thể được sử dụng

liởn tục hơn 1000 giờ trong khoảng nhiệt độ 60 đến 65°C

* San pham phan ứng khừng bị lẫn lộn với enzyme

-_ Dễ dỏng tổ chức sản xuất cõc sản phẩm lởn men

bằng enzyme ngoại bỏo

93 Nguyễn Hữu Trợ oy

29/09/2011 11:21 SA

đi Đặc điềm enzyme cừ định

Hoạt tợnh yếu hơn hoạt tợnh enzyme húa tan cỳng loại Tuan theo dinh luat Michaelis — Menten:

— Cụ sự cạnh tranh cơ chất với enzyme va chat mang — Cản trở sự khuếch tõn cơ chất vỏ sản phẩm phản ứng >

giảm tốc độ phản ứng

Cụ tợnh bền nhiệt cao hơn enzyme húa tan

pH tối ưu dịch chuyền sang kiềm hoặc acid so với pH

tối ưu của enzyme húa tan cỳng loại

Cụ thể bảo quản tốt hơn

Tõi sử dụng nhiều lần 29/09/2011 11:21 SA 95 Nguyễn Hữu Trợ c3

& Enzyme cố định Ý ` ` tr vo ca Ă~-—>—— ~- S0l|dorporouz@@42s “$#Ẫqsplyfferir1itrlx Senpermeableremirane

Enzyme hờa tan được gắn vỏo chất mang

92 Nguyễn Hữu Trợ Oo

29/09/2011 11:21 SA

giỏ Thuận lợi của xỷc tõc sinh học cụ định

1 Cho phờp sử dụng lại của cõc enzyme thỏnh phần

2 Lý tưởng cho tiến hỏnh liởn tục 3 Sản phẩm khừng chứa enzyme

4 Cho phờp sự kiểm soõt chợnh xõc hơn của cõc quõ trớnh xỷc tõc

5 Cải thiện sự ỗn định của enzyme

6 Cho phờp phõt triển của hệ thống phản ứng đa enzyme

7 Cụ thế xem xờt đề nghị khả năng ứng dụng trong

cừng nghiệp vỏ y học

8 Giảm cõc vấn đề thất thoõt 29/09/2011 11:21 SA 94 Nguyễn Hữu Tri oO

đỏ Cõc yếu từ ảnh hưởng hoạt tợnh

= enzyme khừng húa tan

Phụ thuộc vỏo bản chất vỏ tợnh chất hụa học enzyme

khừng húa tan, tỳy chất mang lỏ polyanion; polycation, enzyme sẽ bị ảnh hưởng khõc nhau

> bd sung dung dich cụ lực ion cao hoặc dung dịch

đệm nồng độ cao

Phụ thuộc vỏo sự khuếch tõn cơ chất, sản phẩm vỏ cõc phần tử khõc: tốc độ khuếch tõn trởn phụ thuộc vỏo cõc yếu tố kợch thước lỗ gel, trong lượng phón tử cơ chất, chởnh lệch nồng độ giữa mừi trường vi mừ

xung quan enzyme vỏ enzyme tự do Giới hạn khuếch tõn: rỏo khuếch tõn bởn ngoỏi vỏ bởn trong

- Điện tợch chất mang ảnh hưởng pH tối ưu enzyme

% Nguyễn Hữu Trợ c3

29/09/2011 11:21 SA

Trang 17

€Ÿỏ Cõc phương phõp cố định enzyme

- Chọn chất mang phỳ hợp để cố định enzyme - Hoạt hụa chất mang

- Cõc phương phõp cố định enzyme 29/09/2011 11:21 SA a7 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Cõc loại chót mang trong cừ định

enzyme

* Chat mang hiru co: Polymer tong hop va polymer

tự nhiởn

-Ổ Chất mang vừ cơ: sợi bừng thủy tỉnh, silicum oxide, Allumium oxide, mangesium oxide

29/09/2011 11:21 SA ” Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Polymer từng hợp

Í Polyacrylamide; polyester, polyacry lic;

polyvinylalcohol

- Ưu điểm: bền, tợnh chất cơ Wý tốt, hoỏn toỏn trơ trước sự tấn cừng của vi khuẩn, độ trương tốt,

kợch thước siởu lỗ cụ thể điều chợnh được - Nhược điểm: Giõ thỏnh cao, khừng tương thợch

sinh học, góy ừ nhiễm mừi trường

29/09/2011 11:21 SA 101 Nguyễn Hữu Trợ c3 €Ÿỏ Chất mang dỳng cố định enzyme - Kinh tế - Tợnh chất cơ lý bền vững, ồn định

Í Cụ tợnh bền về mặt hụa học, khừng bi tan trong

mừi trường phản ứng

Ậ Cụ tợnh khõng khuẩn cao

‹Ậ Cụ độ trương tốt, diện tợch bề mặt tiếp xỷc lớn * Cau trỷc lỗ xốp, siởu lỗ, dạng hạt, mỏng hoặc

dạng phim mỏng

giỏ Polymer tự nhiởn

* Chat mang polysaccharide: cellulose, agarose, dextran, sephadex, tinh bot, chitin, chitosan

* Chat mang co ban chat protein: gelatin, keratin,

albumin

đi Chất mang vừ cơ

- Lỏ những dang oxide cụ cấu trỷc lỗ vỏ khả năng

hấp thu tốt

- Nhược điểm: giõ thỏnh cao, tan trong dung dịch

kiềm pH > 7.5 > cố định những enzyme đặc biệt

Trang 18

€Ÿỏ Phương phõp hoạt hụa chất mang

Hoạt hụa bằng cyanogen halogenur Hoạt hụa bằng ethyl chloroformate Hoạt hụa bằng phương phõp azide

Hoạt hụa bằng glutaraldehyde

Hoạt hụa bằng phương phõp diazo

Hoạt hụa bằng carbodiimide

Hoõt hụa bằng 3 — aminopropyltriethoxysilane

29/09/2011 11:21 SA 103 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Phương phõp hoạt hụa enzyme

ettvichporairale oO Ệ pro, E ỷ— > Se eee „ CH 0) intemedite

* Quy trinh van tao ra sản phẩm trung gian, nhưng khừng cụ độc tợnh

@% = Hoat hda bang glutaraldehyde

Quai ye glc[iga#%œ Aa — Hi—— — L H | Hạ FQ H | fb 1% H H F Oe H;N San ( "ng = TỶ — = 4 > Hp Hạ Be 5 ee Hi—we

- Dỳng cho cõc chất mang nhụm —NH, Glutaraldehyde cụ 2 nhụm aldehyde hoạt hụa

29/09/2011 11:21 SA 107

địa Phương phõp hoạt hụa bằng

~~ cyanogen halogenur

CWEHI COS OTe

`

⁄ k

?

s X

- Tạo sản phẩm trung gian rất độc ( s3

€ệ Hoạt hụa bằng phương phõp azide

se — ——

CH) 0B NEONH) —— CH COOr = PCH) COOCH; —“-== CH)CONHH;

: BO teyuhenziche

&trrstrve

4uygsa4r ’

(eg cafzony nudeyt colldces)

MANO? + BC] + ,“ - euzZtuœe-.NH+ | .CH;CONHẬ.ưmB S— | CH CONH) | pH 49 ; apport sport

- Sử dụng phương phõp azide cho cõc chất cụ nhụm chức -COOH của CM - cellulose polyacrylamide vỏ nylon

Nguyễn Hữu Trợ oO

29/09/2011 11:21 SA 106

đi Hoạt hụa bằng phương phõp diazo

- Ap dụng cho cõc chất mang chứa nhụm amine

Trang 19

€ẰỒ Hoạt hụa bằng carbodiimide

cabcdinie H—zrzre R——=\—':; Hỏ

È* |

mm = em

(— TH > —I

rat I ^ i i" i ret J-acylouea / Fh hy 1

&

- Hoạt hụa cõc chất mang nhụm carboxyl

109 Nguyễn Hữu Tợ S

29/09/2011 11:21 SA

i Cac phương phõp cố định enzyme

1A Be

11 Nguyễn Hữu Trợ oj

29/09/2011 11:21 SA

đi Covalent immobilization

- Liởn kết cộng hụa trợ giữa nhụm chức năng (functinal group) cia chat mang đọ hoạt hụa vỏ nhụm chức năng trởn acid amin của enzyme: -OH; -SH; -NH;; -COOH

* Kho thu hai lai chat mang - Hiệu suất cố định enzyme thấp

- Động học enzyme thường bị thay đồi * Tợnh linh động vỏ độ ỗn định cao 29/09/2011 11:21 SA 113 Nguyễn Hữu Trợ c3 '” 3-Aminopropyltriethoxysilane Hoạt hụa bằng Os I I J - = OH —— C— mS) me — Jo — 2 A F—ˆCH;ạ—rvt ' | te Ca+ (CH;}——IdđŒ& i `

13ê#rII LJ! CỊ nợ E L1XV SEI kz — F-1-—`—E

hae ye ——— œ mm Me WS

—_ o Hạ — i t—yn

— Z rors =

— — o } Ni - —`'zr+êe

Hoat hoa vặt liệu trở như thủy tỉnh

110 Nguyễn Hữu Trợ Oo

29/09/2011 11:21 SA

@ỏ NHỢP Phương phõp hụa học — carrier

bound

-Ổ Phương phõp hụa học trong cố định enzyme lỏ

phương phõp tạo liởn kết enzyme với chất mang Gồm 2 kiểu:

— 1 Covalent immobilization(Cố định enzyme với chất mang bằng liởn kết cộng hụa trị)

— 2 Non — covalent immobilization (Cố định enzyme với

chat mang bằng liởn kết khừng cộng hụa trị - phương phõp hấp phụ):

Covalent immobilization “= Multi point covalent attachment

+ Enzyme được cừ định vỏo chất mang thừng qua sự liởn kết của nhiều cấu tử acid amin lởn chất mang

* Chat nờn: thủy tỉnh xốp, polyacrylamide, cellulose, hạt từ

tợnh

* VD: glyoxyl — agarose: enzyme gan vao chat mang thờng qua liởn kết của vỳng giau lysine

Trang 20

giỏ Non - covalent

* Non — covalent (Phương phõp hấp phụ -Khừng cộng hụa trị): Phương phõp liởn kết ion (ionic exchange; van der Waals; tương tõc ky nước (strong hydrophobic interaction)

VD: lonic exchange: liởn kết giữa chất mang truyền thống vỏ enzyme dễ bị phõ vỡ khi thay đổi nồng độ muối vỏ pH

Porous glass, agarose gel, hạt từ (magnetic particle) được phủ lớp ionic polymers:polyethylenimine (PEI); dextran sulfate chứa nhiều nhụm cụ khả năng tạo liởn

kết ion (ionic group) vỏ cụ cấu trỷc linh động dễ dỏng

tương thợch enzyme

Nguyễn Hữu Tợ S

29/09/2011 11:21 SA 115

giỏ Liởn kết cộng hụa trị

-_ Cõc chất mang thường sử dụng: polypeptide, polysacharide, agarose

* Cac liờn kờt dờng hờa tri giữa chất mang vỏ E cụ thể phón

loại như sau:

Í Diazo hụa: chất mang- N=N- E * Tạo cầu amit: chất mang-CO-NH- E

- Alkyl vỏ Aryl hụa: chất mang-CH2-NH2-E

* Tao bazo Schiff: chat mang-CH=N-E - Trao đổi tiol disulfua: chất mang-S-S- E -ề Ưu điểm: Ậ Khuyết điểm

- Bền, khừng bị ly giải - Đất tiền vỏ quy trớnh theo sản phẩm phức tạp

- Cụ nhiều lựa chọn — Cụ thở lỏm thay đổi vị trợ

chất mang phỳ hợp hoạt động của enzyme

29/09/2011 11:21 SA 1 Nguyễn Hữu Trợ S|

đi Carrier free

- Enzyme tự động cố định trong khối protein của nụ mỏ

khừng cụ sự hỗ trợ của chất mang với sự hiện diện của bifuntional reagents như glutaraldehyde

* Cross - linked enzyme (CLEs * Cross - linked enzyme crystal (CLECs * Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs)

giỏ Covalent

Covalent (cộng hụa trị): liởn kết cộng hụa trợ giữa nhụm chức năng (functinal group) của chất mang vỏ nhụm chức nắng trởn acid amin của enzyme: -OH; - SH; -NH2; -COOH

Multi — point covalent attachment: da vi tri cụ khả

năng tạo liởn kết cừng hụa trị giữa enzyme va chất

mang

Support: Porous glass, agarose gel, hat tlr (magnetic particle)

Spacer arm: ngan 29/09/2011 11:21 SA 116 Nguyễn Hữu Trợ Oo

@Ẽ Covalent

È*%

đi Carrier free

Cross - linked enzyme (CLEs): Được tạo ra từ sự liởn kết chờo của cõc enzyme húa tan

Cross - linked enzyme crystal (CLECs): được tạo ra từ

sự liởn kết chờo của cõc tỉnh thể enzyme > tinh ổn định cao trong cõc điều kiện khắc nghiệt

Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs): được tạo ra từ sự liởn kết chờo của cõc protein ở trang thõi tủa

Tủa ( muối, dung mừi ) khuấy mạnh > tạo liởn kết

dưới sự hiện diện của glutaraldehyde

Trang 21

-Ổ Ưu điểm:

_ Liởn kởt chờo

Dựa trởn liởn kết cộng hụa trị

giữa cõc enzyme tạo thỏnh ‘

khối khừng gian ba chiều

— Liởn kết enzyme chặt

—

Crome creed ecryme

- Khuyết điểm:

— C6 thờ lam thay dời

-Kết hợp với cõc đõng kế vị trợ hoạt

phương phõp khõc động

tạo ra liởn kết bền — Mat hoat tinh enzyme

vững trong quõ trớnh cố

ự;âđịnh -

29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trợ S

giỏ Phương phõp containment

- Phương phõp nhốt enzyme (entrapment)

* Phuong phõp giữ ultrafiltration 29/09/2011 11:21 SA trong mỏng: microcapsule; 123 Nguyễn Hữu Trợ oj

đi Phương phõp bẫy (nhốt)

116 Microoncapsulaton (gụi trong cõc bao cực nhỏ) Mỏng polymer thóm thóu dỏy 200A°(cellulose, polysacarit, phi tỉnh bột) gụi enzyme bởn trong Mỏng nỏy cho cơ chất vỏ sản phẩm enzyme đi qua nhưng khừng cho cõc đại phón tử đi qua

1.2 Bay trong gel: việc bay enzyme trong thể nền của gel đạt được bằng cõch thực hiện phản polymer hờa, tia / lỏm đừng với sự hiện diện của enzyme

29/09/2011 11:21 SA enzyme đ Micrnc spas ứng Esư grnự weckeion 125 Nguyễn Hữu Trợ c3

& Carrier free

o4? =] oon - — “= ee 2ê CaP - e— ie seSeo_ oa, c° '"M ` * —~ — - M_

đỏ Phương phõp nhốt enzyme

“~ (entrapment)

+ Enzyme được giữ lại trong một khoảng khừng nhỏ được tạo ra trong quõ trớnh polymer hụa Enzyme húa tan vỏo dung dich monomer trước khi được polymer hụa bằng cõc tõc nhón vật lý, hụa học

* Chat nờn (matrix): Alginate Polyacrylamide;

polyvinyl alcohol

6 Phương phõp giữ trong mỏng

- Enzyme microcapsule: quõ trớnh polymer hụa được

tiến hỏnh trởn bề mặt của giọt enzyme phón tõn trong dung mừi với sự hỗ trợ của chất hoạt tợnh bề mặt

(surfactant) + _ Vỏ bọc bởn ngoỏi

+ Mỏng siởu loc (Ultrafilatration membrane): enzyme

được nhốt trong mỏng siởu lọc, cho phờp cơ chất va sản phẩm ra vỏo mỏng > enzyme hoạt động cần coenzyme

- Nhược điểm: dễ bị tắc lỗ mỏng do bọt khợ; sự tụ tập cõc chất khừng mong muốn

29/09/2011 11:21 SA 126 Nguyễn Hữu Trợ Ẫ

Trang 22

aa Hap phu enzyme lờn chat khừng tan

Một số chất mang được sử dụng

+ Hữu cơ: than hoạt tợnh, tinh bột, cellulose agarose + Vơ cơ: Silic, thủy tỉnh xếp, oxyt của kim loại + Polymer tổng hợp: polyamit, nilon, polyacrylamide

+ Chat trao dời ion: amberit, dietyl-amino-etyl sephadex (DEAE —

sephadex), DEAE — cellulose, carboxyl metyl cellulose (CM cellulose) Carrier-Dound enzyme 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Ứng dụng trong sản xuất cừng nghiệp

* Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase - Ưng dụng của enzyme raffinase cố định

- Ưng dụng của enzyme invertase cố định

- Sản xuất L - amino acid nhờ enzyme aminoacylase

cố định

- Ưng dụng của lactase cố định

- Sản xuất khõng sinh

đi Ứng dụng của enzyme raffinase cụ định

- Sản xuất: Nuừi nấm mắc Mortierella vinacea var

faffinoseutilizer trong cõc hạt > sấy khừ > sử

dụng như enzyme cố định

* Ung dung: Raffinase (o— galactosidase) cố định giỷp loại bỏ raffinose vỏ stachyose từ sữa đậu nỏnh, trõnh nguy cơ bị đầy hơi khi dỳng thức

uống nỏy

giỏ Hắp phụ enzyme lởn chất khừng tan

- Ưu điểm: * Khuyờt điểm: - Khừng thay đổi cấu - Dễ ly giải khi thay

trỷc enzyme hay đổi một số đặc trung tóm tóm hoạt điểm như pH, t động — Khừng đặc hiệu

- Khừng hoặc ợt đúi hỏi hụa chất đi kộm

— Đơn giản, rẻ tiền

@& Sản xuất fructose nhờ enzyme

glucose isomerase

Ậ Glucose isomerase tao ra tie Arthrobacter va streptomyces sp, nhạy với tõc nhón kim loại > cố định enzyme trởn collagen, bừng

* D-glucose > D- fructose

đi Ứng dụng của enzyme invertase cố định

* Enzyme invertase nam men được cố định trong

than (tởn thương hiệu Brimac TM) > sản xuất siro nghịch đảo chất lượng tương đương, trõnh sự

đậm mỏu, giảm nồng độ muối vỏ tro trong sản phẩm, hiệu xuất chuyền đổi cao

- Thời gian phản ứng giảm đõng kể: Enzyme invertase tự do (24 giờ), enzyme invertase cố định {15 phỷt)

Trang 23

giỏ Sản xuất L ~ amino acid nhờ enzyme

aminoacylase cố định

- Sản xuất theo phương phõp hụa học chỉ thu được amino acid ở dạng đồng phón D - khừng cụ giõ trị dinh dưỡng

- L—amino acid tõch khỏi hỗn hợp dựa vỏo sự khõc biệt về độ húa tan DL — acylomino acid quay trở lại lú phản

29/09/2011 11:21 SA 133 Nguyễn Hữu Tợ S

đỏ wy San xuat khang sinh

* Penicillin amidase tiv E co/i cd định trởn sephadex G200 hoạt hụa bởi cyanogen bromide > thủy phan benzylpenicillin va phenoxymethylpenicillin sinh ra từ quõ trớnh lởn men giải phụng ampicillin

& — oo — con =< =+Ậ ` ` - or ~— = *s ~* woth ve : , a4 se rr 7 wee —_ ˆ ~_— 29/09/2011 11:21 SA 137 Nguyễn Hữu Trợ c3

giỏ Ứng dụng của lactase cố định

* Gia thanh cao > enzyme lactase tl tế bao nam men được nhỏ khoa học Ý cố định với cõc sợi

cellulose triacetate

- Lactase dễ bị ức chế bởi sản phẩm tạo thỏnh, chất

bờo, protein nhũ tương khi dỳng xử lý huyết thanh

sữa > nhiễm vi sinh vật

e Ung dung trong y hoc va phan tich

- Một số bệnh di truyền về rối loạn chuyễn hụa ở người do thiếu một loại enzyme đặc biệt > thay thờ bang

cõch sử dụng enzyme cố định trong cõc vi hạt, sợi

hay gel nhằm trõnh góy ra đõp ứng miễn nhiễm cơ

thờ

VD: Tạo thận nhón tạo, enzyme urease cố định trong hạt resin hấp phụ hoặc than chớ tạo thỏnh cõc vỉ nang

lỏ nơi hấp phụ sản phẩm qũ trớnh phón hủy urea ở

thận

&

Ky thuat tach chiờt enzyme

Trang 24

đt Phõ vỡ mừ vỏ tế bỏo

„” (Disruption of tissues and cells)

Lựa chọn mừ

- Dựa vỏo giõ thỏnh, tợnh sẵn cụ vỏ sự phong phỷ của enzyme

* Recombinant DNA technology — xay dung host cell (expression system)

* Trõnh hoặc hạn chế sử dụng cõc mừ giỏu proteinase Vd: gan, lõch, thận Ở vi sinh vật tạo mutant strain

(dúng đột biến) thiếu mờt sd proteinase (E Coli,

Bacillus subtilis)

29/09/2011 11:21 SA 139 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Phõ vỡ mừ ~ tõch tế bỏo

(disruption of tissue and separation of cells)

- Nhiều loại tế bỏo cụ trong cỳng một mừ

- Huyền phỳ tế bỏo được chuẩn bị bằng phương phõp

cơ học hoặc phương phõp enzyme

- Phương phõp cơ học: ảnh hương tới sự nguyởn vẹn tế bỏo

* Phuong phap enzyme: collagenase tty Clostridium histolyticum, trypsin, estalase > tach dywa vao điện tich, antigenicity, kịch thước, tỷ trọng

đi Phõ vỡ tế bỏo thực vật - Thu nhón enzyme từ tế bỏo thực vật tương đối khụ

khăn do sự hiện diện võch tế bỏo, khừng bỏo (vacuole)

vỏ hợp chất phenolic

Việc phõ vỡ khừng bỏo > giải phụng proteinases, pH

dịch chiết thấp

Khi cụ oxygen, phenol oxidases xỷc tõc chuyền hợp chat phenolic thanh dang polymeric pigment co thờ bat hoat (inactivate) enzyme trong dich chiờt

Bo sung chat kh? 2 — mercaptoethanol

Bỗ sung polyvinylpolypyrollidone giỷp hấp thu hợp chat phenolic 29/09/2011 11:21 SA 143 Nguyễn Hữu Trợ c3

x ~~ ˆ ` K `

đồ Phõ vỡ mừ vỏ tở bỏo (Disruption of tissues and cells)

đ Vi sinh vật thường được chọn lỏm host organism

- Ưu điểm: tốc độ sinh trưởng nhanh

Í Nhược điểm: thiếu cơ chế cải biởn sau dịch mọ

vỏ enzyme thường ở dang inclusion body

* Cải biởn gene biểu hiện giỷp sản phẩm enzyme tiết ra mừi trường ngoỏi tế bỏo

giỏ Phõ vỡ tế bỏo động vật Í Mừ được cất nhỏ (loại bỏ mỡ vỏ mừ liởn kết) - Mừ mềm đồng hụa trong thiết bị đồng hụa

Ậ Mừ cứng cần được xay nhỏ trong mõy xay trước khi cho vỏo thiết bị đồng hụa

° Ly tóm

đi Phõ vỡ tế bỏo nắm men

- Võch tế bỏo Nhiều proteinase

Tạo đột biến góy ra sự thiếu hụt một vỏi proteinase

Ngan chan sv tao proteinase bang cõch nuừi trởn mừi trường khừng chứa cơ chất protein

Phương phõp 1: ủ bõnh men trong toluene (6% (viw)) va 2 — mercaptoethonol (0.2 % (viw)) ở 370 C trong 1h

> tach thanh phan vach tờ bao > EDTA (15 mM) pH 7.0

chứa 5 mM 2 — mercaptoethanol, ủ qua đởm > pha vỡ võch tế bỏo > ly tóm 15 000 rpm trong 30 phỷt

Trang 25

giỏ Phõ vỡ tế bỏo nắm men

- Phương phõp 2: lắc với hạt thủy tỉnh (đường kợnh 1 mm) > 1ml dịch được ly tóm 2500 rpm ở 100 C

-Ổ Nấm men Pichia pasforis được dỳng như tế bỏo

chủ, recombinant protein được tiết vỏo mừi

trường nuừi cấy

29/09/2011 11:21 SA 145 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Phõ vỡ tế bỏo vi khuẩn

- Dna trong dịch chiết cụ cụ độ nhớt cao góy khụ khăn trong viờc tinh sach enzyme

>Hoac xt? ly voi deoxyribonuclease 1 (10 pg/ml) >Hoac xt ly vdời protamine ( protein giau arginine trong

cau tao)

Hoặc xử lý polymer tợch điện dương

(polyethyleneimine)

đi Ung dung cua enzyme

giỏ Phõ vỡ tế bỏo vi khuẩn - Võch tế bỏo

Phương phõp cơ học thường ảnh hưởng đến cõc

thỏnh phần của tế bỏo

> Vi khuan gram duong (Bacillus, Micrococcus, Streptococcus) : dung enzyme lysozyme pha huy vach tờ bao, U voi lysozyme tir tring ga (0.2 mg/ml) & 37°C trong 15 phỷt

> Vi khuan gram 4m (E coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) : riva tờbao voi detergent (0.1% (v/v) N-lauroyl-sarcosine) > xtr ly voi voi sucrose (0.7 M), Tris (0.2 M), EDTA (0.04 M) 29/09/2011 11:21 SA 146 Nguyễn Hữu Trợ Oo

@& = Enzyme gan trờn mang tờbao

+ Mang tờ bao can được xử ly voi non — ionic

detergent nhu Triton hay Tween Cac detergent nỏy ợt góy ảnh hương lởn cấu trỷc protein nụi chung vỏ enzyme nụi riởng

* Quy luat str dung detergent: 2 mg detergent dung

cho 1 mg mang tờ bao

* CD - circular dichroism duoc dung dờ kiểm tra cấu trỷc bậc 2 của enzyme tach chiờt

Ce img dyng cờng nghiờp cla enzymes

Ứng dụng Enzyme sử dụng Sử dụng Vẫn đề Chat tẩy rửa | - Đầu tiởn lỏ cõc proteas, được ấ - sử dụng cho cõc điều kiện trước khi ngóm vỏ é - phản ứng dj img của cừng nhón chế

sinh học sản xuất ở dang ngoại bỏo cốc ứng dụng lỏng trực tiếp biến ngỏy nay để vượt qua từ vi khuẩn - chất tẩy rửa cho mõy rửa chến để loại khõng được bằng cắc cừng nghệ chứa

- Amylase cặn tỉnh bột

Cừng nghiệp |- Alpha-amylase nfm; bớnh | - xỷc tốc cắt tỉnh bột từ bột thỏnh đường, cụ bõnh kẹo bị bất hoạt ở 50%C, được sử dụng bởi nắm men Sử dụng bị phõ hủy trong quờ tinh trong sản xuất bõnh mỳ trắng, bắnh bao,

Trung nồng 'bắnh tỳ hỏ

- Proteinase - sản xuất bõnh quy dễ hạ thấp nate protein

trang bột

Cừng nghiệp | -edzyme được tạo t4 từ lỷa

tượu bia mạch giết giai doạn ngóm trong sin xudt bia - sắp enzyme được sản xuất

cừng nghiệp: amylases, uoanases, proteinase, beta glucanase, axnyloglucosidase proteinase

- phón hủy tỉnh bột va protein để tạo đường dome , axit amin va peptide duoc oF dung

bởi nắm men để thỷc đóy tạo cồn

- ngay nay dược sử dụng rộng rải trong sản

rượu bia: cỈt polysaccharide va

protein trong lầm malt; cải thiện cấc đặp

tợnh lọc; bia thấp calo, loại vấn duc trong

trữ bia

Cừng nghiệp | - Remrin, từ dạ dỏy từ động vật

chế biển thai lại non (bở, cửu, dở

bơ sữa con)

- cắc erizyme được tạo từ vớ sinh vật

-Lipas

- Lactase

- sản xudt phờ mai, sử dụng để phón cắt protein Ngỏy nay tớm thầy sự gia tăng sử

trong cừng nghiệp bơ sữa

- kợch thợch 1am chin phừ mai mốc xanh (phừ

mai van xan, Roque fort)

- bờ gay lactose thỏnh glucose va galactose

- cõc động vật giỏ khừng thể được sử dụng vớ khi gia tăng tuổi tõc thớ sin xudt rennin giảm vỏ được thay thờ bời proteinase, pepsin, khừng thợch hợp cho sản xuất phừ mai Những năm gần đóy thịt bỏ dẫn tới gia tăng thiếu

hut rennin va gia tng gid cd

Trang 26

ứng dụng Enzyme sử dụng St dụng 'Vẫn đề

Cừng nghiệp | - Amylase, ẻ - chuyển tỉnh bột thỏnh glueose vỏ cõc chất ngọt (siro) é Được sử dụng rộng

tỉnh bột amyloglucosidases khõc, tỏi ở Mỹ vỏ vi glucoamylases - chuyển glucose thanh fructose (cõc siro cao fructose Nhật nhưng ở

= Glucose isomerase bắt nguồn từ cõc chất liệu tớnh bột đố kợch thợch Chóu ằu giới - cắc enzyme cừ định tợnh lỏm ngọt vỏ thấp năng lượng) hạn để bảo vệ

- sản Xuất cõc siro cao fruetose Tiừng dan tring củ cải

đường,

- ngỏy nay được sử dụng rộng Tải để loại tỉnh bột,

được sử dụng như một chất dợnh hoặc hồ vải rởn cõc sợi vải của bề mặt vỏi nhất định để ngắn chặn

cõc hư hại trong dệt (heo cỗ truyền, sự loại hỗ

dõn st dụng cõo hồa chất mạnh lỏ phổ biến)

- thừng thường dỏnh cho loại hồ vải bởi vớ chỷng số

khả năng chịu nhiệt lởn tới 100-110C

Cừng nghiệp dệt | Enzyme Amylase ~ Cõc enzyme vỉ khuón

Cừng nghiệp | - Cõc enzyme tớm ở phón | - theo cổ truyền, được sử dụng để xử lý da thuộc để è - việc chuẩn bị cụ thuộc da chụ vỏ bồ cừn lỏm mềm lại bởi loại bỏ cõc thỏnh phần protein mỳi rất khụ

- cõc cnzyme Trypsin từ nhất định (qũ trinh gọi lỏ ngóm mềm; ngóm chị

lú mỗ vỏ từ vi sinh mềm mạnh được đúi hỏi để lỏm cho miếng da

vật mềm, mịn, ngóm mềm nhẹ cho để gầy - hiện nay thay thờ một lượng lớn cõc enzyme & để

cập ở trởn trong ngóm mởm cũng được sử dụng cho loại lừng từ da sống,

Sử dụng trong y | - Trypsin - giải phẩu loại cõc mừ hư, lỏm tan cõc cục mõu

học — vỏ | -trypsintuyễn tụy nghẽn

được học - hỗ trợ kiểm sõt phón cắt, xỳ lý sưng tấy, - nhiều enzyme được sử dụng trong hụa học lóm sing Ty cõc A uke td,

đỏ ° Ứng ng dụng của enzyme d T

- Phần lớn enzyme cụ thể được sản xuất bởi vi sinh vật (nấm sợi, vi khuẩn vỏ nấm men phần cún lại từ

động vật vỏ thực vật)

- Khi sử dụng tế bỏo vi vật trong lởn men co dờ xỷc tõc lại cụ một số nhược điểm:

— Tiởu thụ cơ chất

— Hớnh thỏnh cõc sản phẩm khừng mong muốn - Thu nhận vỏ tỉnh sạch sản phẩm cụ thể khụ

khan

Í Hwong khac phuc: ding enzyme cờ dinh

Nguyễn Hữu Trợ a

P|

29/09/2011 11:21 SA 153

đi Ứng dụng của enzyme

- Nhờ cừng nghệ di truyền, cụ thể chuyờn gene mong

muốn từ sinh vật nỏy sang sinh vật chủ thợch

hợp>>sản xuất cõc enzyme cừng nghiệp chất lượng

vỏ độ tinh sạch cao

-_Vi sinh vật tõi tổ hợp ngỏy cỏng được sử dụng rộng

rải vỏ lỏ xu hướng chủ yếu trong tương lai

29/09/2011 11:21 SA 155 Nguyễn Hữu Tợ @-=

—

giỏ Ung dung cua enzyme

Cừng nghề enzyme bõt đầu phat triờn vao những năm

1950, khi thế chiến II cần lượng lớn penicilline

29/09/2011 11:21 SA 52 Nguyễn Hữu Trợ Ps

el

giỏ Ung dung cua enzyme

- Phần lớn enzyme sử dụng trong cừng nghiệp lỏ enzyme ngoại bỏo (protease, amylase vỏ (mức độ ợt hon) cellulose, lipase ), thường khừng cần

cofactor đề hoạt động

-_ Một số enzyme nội bỏo được sản xuất cừng nghiệp bỏo gồm glucose oxidase cho bảo quản thực phẩm,

asparaginase cho trị liệu ung thư vỏ penicillin

acylase cho sự biến đổi khõng sinh

Trang 27

Cõc enzyme được sử dụng ở quy mừ cừng nghiệp trong cừng nghệ thực phẩm đa

Mỏ — nae 5 we ê ak 4 & ` " zm

s““ T——— =_ — vey Chế biởn cõc chót ngọt từ tỉnh bột

—_ eee = Ree — “Ẽ“———— et fae terry ‹ * Nguyờn liệu: tinh bột Bắp,

a ro ê2 Se rrr Lỷa mớ, bột

3 S ae Khoai mi,

‘ * m

= as P TẾ TU Sá2.Ịý coi Khoai tóy

- < ; ae

` Ẫ - 9 rare `

~ - Ha ễ” như ừng * a eo (oer ee

=o aa — Zz om es ỉ › “aes

An dc Ậ+ Ẽ *%.~r*“* +1 9 `

ons 5 sen) a *

acme wore stem _—— meee

= EXH: - -

29/09/2011 11:21 SA + Nguyởn Hữu Tợ ———,y, T" Nguyễn Hữu Trợ

| “` =

Tet If ota Ậates aceÍ đ Gia ca: gid enzyme

eee _ đọ giảm đõng kế, 'ˆ mức chấp nhận được

Sf (x0 _ trong thập kỷ qua

Peat si co Ẫ * Gia tăng sử dụng

enzyme tỉnh sạch cao

to ox va dac hiờu cao Ca ° - 5Í => gia tăng lợi nhuận er + — từ mua bõn enzyme

Ậ rầt nhiều

29/09/2011 11:21 SA 159 Nguyễn Hữu Trợ (iP

-

|

đi Protease thực vật — Bromelin

(E.C.3.4.4.24)

Bromelin lỏ nhụm protease chứa nhụm

sulfhydryl, thu nhận từ thực vật thuộc họ Bromeliaceae

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa pH hoạt động: pH 6 —8; Mw: 33 000 Da Bromelin la mờt glycoprotein

Thịt dứa cụ hoạt tợnh enzyme bromelin kế từ 3 thõng trước khi chợn vỏ hoạt độ cao nhất trong khoảng 20 ngỏy trước khi chợn

29/09/2011 11:21 SA 161 Nguyễn Hữu Trợ PS Má

Trang 28

@ủỏ Bromelin — Quy trớnh thu nhận vỏ =

tỉnh sạch bromelin

Qua/than/chời > xay nhuyờn/loc > dich loc > ly

tam > dich ly tam > kết tủa > thu tủa (chế phẩm enzyme thừ) > sấy khừ > tỉnh sạch > sản phẩm enzyme tỉnh khiết

29/09/2011 11:21 SA 163 Nguyễn Hữu Tợ S

giỏ Thu dịch thừ bromelin

- Xay nhuyễn thón, quả dứa bằng mõy xay

- Vất kỹ

+ Lọc > thu dich loc

- Ly tóm 6000 rpm trong 10 phỷt > thu dịch nỗi

đi Phương phõp tõch bromelin

Phương phõp hấp phụ: Kaolin khừ được trộn dung dịch nước dứa sau ly tóm theo tỷ lệ 25 mg kaolin/1ml dịch > khuóy từ > ly tam thu tua bromelin — kaolin Phương phõp siởu lọc: loại bỏ cõc chất cụ kợch thước nhỏ hơn phón tử bromelin > giỷp cừ đặc bromelin

Điều khiển nhiệt độ thợch hợp nhằm trõnh tắt nghẽn lỗ

lọc

Điều chỉnh õp suất giỷp tăng tốc độ dúng chảy giỷp

tăng hiệu suất lọc

giỏ Thu nhận bromelin

đ Thu dich bromelin thờ Í Phương phõp tõch bromelin Í Phương phõp kết tủa * Phương phõp hấp phụ + Phương phõp siởu lọc 29/09/2011 11:21 SA 164 Nguyễn Hữu Trợ Oo €ồ Phương phõp tõch bromelin

Í Phương phõp kết tủa protein: kết tủa phải được thực hiện trong điều kiện lạnh

+ Sử dụng aceton: dịch ờp được lỏm lạnh từ 0 — 49 C, aceton được giữ ở 200 C

* Ethanol: dich chiờt va ethanol phai duoc giữ lạnh

Kết tủa thu được phải được rửa bằng acetone vỏ

lỏm khừ nhanh

* Amonium sulphate: amonium sulphate nồng độ bọo húa (70%) giỷp kết tủa bromelin Quõ trớnh

thực hiện ở nhiệt độ thấp

ia Phương phõp tỉnh sạch bromelin - Tỉnh sạch bằng phương phõp thẩm tợch

+ Húa 1 g bromelin thừ trong 10 ml đệm sodium phosphate 0.03 M pH 7.2> tdi cellophane đựng trong cốc chứa san 1 lit dờm sodium phosphate 0.03 M pH 7.2 > khuấy từ trong 6 giờ > thay dung dịch đệm ngoỏi tỷi mỗi 2 giờ

Í Điều chỉnh nhiệt độ phỳ hợp

* Tinh sạch bằng phương phõp lọc qua sephadex G — 50, G — 100

- Tỉnh sạch bằng phương phõp sắc ký

Trang 29

giỏ Protease thuc vat — Papain

(E.C.3.4.4.10)

Papain lỏ một sulfhydryl protease tõch được từ nhựa đu đủ xanh

Quả xanh 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất Trong

nhựa, nhoỏi thỏnh phần chợnh lỏ papain (95%) cún chứa

một số protein khõc

Papain lỏ endoprotease gồm 185 amino acid Mw: 20 900 Da

Papain cụ cấu trỷc khừng gian dạng hớnh cầu, gồm 2

nhón ky nước

Vỳng trung tóm hoạt động papain: Lys — Asp — Glu — Gly — Ser — Cys — Gly — Ser - Cys

Nguyễn Hữu Tợ S

29/09/2011 11:21 SA 169

đa Protease động vật — pepsin

xơ (E.C.3.4.4.1)

Pepsin lỏ enzyme quan trọng cụ trong tuyến tiởu hụa động vật, thuộc nhụm enzyme thủy phón

Cấu trỷc: pepsin cụ dạng hớnh cầu, cấu trỷc bậc 4 gồm bốn tiểu đơn vị

Một trong 3 liởn kết S - S trong phón tử cần thiết cho

trung tóm hoạt động

Papain gdm 329 amino acid pl : pH 1.0

Trung tóm hoạt động pepsin gồm một hoặc 2 nhụm carboxyl của acid giutamic, một nhón thơm của tyrosine

Pepsin cụ tợnh acid mạnh Mw: 34 500 Da

Tiền enzyme của pepsin lỏ pepsinogen 29/09/2011 11:21 SA 171 Nguyễn Hữu Trợ oj

Protease d6ng vat — trypsin

(E.C.3.4.21.4)

Í Trypsin cụ trong dịch tụy người vỏ động vật Trypsin lỏ một protease kiềm tợnh hoạt động ở ruột Tiền enzyme của trypsin lỏ trypsinogen: hoạt hụa nhờ enzyme đường ruột enterokinase

Mw: 22.680 — 23.400 Da gồm 249 amino acid

pH tối ưu: pH 8; pH thợch hợp: 7.8 — 9.5, vẫn ồn định pH thấp 3 — 5

Nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ cơ thể vỏ vẫn hoạt động

tốt trong khoản 30 — 400 C

Trypsin được hoạt hụa bởi: Ca, Co, Mn vỏ bị ức chế boi: Cu, Ag, Hg

Nguyễn Hữu Trợ c3 @Ẽ 29/09/2011 11:21 SA 173

€Ÿỏ Hoạt tợnh enzyme vỏ cơ chế xỷc tõc

Papain cần nhụm sulhydryl tự do đề thể hiện hoạt tinh

Papain thủy phón protein thỏnh cõc polypeptide vỏ cõc amino acid

Papain cụ khả năng thủy phón sóu hơn

Papain cụ tợnh đặc hiệu rộng: thủy phón hầu hất liởn

ket peptide tri liờn ket v@i proline va voi cac glutamic cờ carboxyl tu do

Kha nang thủy phón tỳy thuộc vỏo trạng thõi cơ chất Papain cún cụ hoạt tợnh esterase, thiol esterase va

transferase 29/09/2011 11:21 SA 170 Nguyễn Hữu Trợ Oo

giỏ Hoạt động xỷc tõc của pepsin Protease chỉ cụ khả phón cắt 15% liởn kết peptide

trong protein > đoạn peptide

Pepsin chỉ đặc hiệu cất liởn kết peptide giữa acid

amine nhón thơm với amino acid khõc

Pepsin cún cụ khả năng cắt cõc nối peptide giữa

Leu -Val, Val — Cys, Glu — Asn, Leu — Glu & mức độ thập hơm

Pepsin phón cắt dễ dỏng protein tan trong nước

Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxide

địa Hoạt động vỏ tợnh đặc hiệu của

4 trypsin

Trung tóm hoạt động: -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-

Trypsin cắt liởn kết peptide giữa carboxyl của lysine,

arginine với nhụm amine của cõc amino acid khõc

Trypsin tõc dụng tốt hơn với protein bị biến tợnh Trypsin chỉ phón cắt được 1/3 liởn kết peptide trong

phón tử protein, tạo cõc peptide nhỏ vỏ cõc amino acid

Trypsin cún khả năng thủy phón ester

Trang 30

giỏ Amylase

- Amylase lỏ một enzyme đụng vai trú chủ yếu trong hoạt động thủy phón tinh bột trong quõ trớnh nảy mầm

của hạt ngũ cốc

Cụ 6 loại amyalse, cõc enzyme nỏy khõc nhau ở đặc tợnh, pH hoạt động vỏ tợnh ồn định với nhiệt:

a — amylase, pf — amylase, y— amylase (glycoamylase): thủy phón a- 1,4 - glycoside cua tinh bot

Dextrin—6-glucanhydrolase, amylopectin—6—

glucanhydrolase vỏ oligodextrin — 6 — glucanhydrolase (dextrinaxe): thuỷ phón œ- 1,6 - glycoside của tỉnh bột

Nguyễn Hữu Tợ S 29/09/2011 11:21 SA 175 @Ẽ Amylase

Nudi vi sinh vat tao amylase bang ~ phương phõp bở mặt

- Nguyởn liệu: cõm mớ, cõm gạo, chất lượng nguyởn liệu ảnh hưởng lớn hoạt lực amylase sinh ra

Độ 4m tối thợch: (nấm mốc: Asp niger, Asp awamort )

từ 58 — 60% Nhiệt độ nuừi:

Giai đoạn nảy mầm của đợnh bỏo tử (3-4 giờ): 23 — 300 Œ đối với nấm mốc, 32 - 389C đối với vi khuẩn

Giai đoạn sinh trưởng nhanh của hệ sợi, hừ hấp xảy ra mạnh, sinh nhiệt lớn (4-18 giờ) > thổi khợ vừ trỳng nhiệt

dờ 28 -29° C vỏ độ 4m cao

Giai doan tao amylase manh (10 -20 gio)

Thời gian nuừi để thu amylase cực lớn tỳy vỏo loại vi

sinh vật 29/09/2011 11:21 SA 19

giỏ Amylase

Í 6 loại amylase được chia thỏnh 2 nhụm:

>Endoamylase: œ — amylase vỏ nhụm enzyme khử nhõnh Dextrin — 6- glucanhydrolase, amylopectin — 6 — glucanhydrolase va oligodextrin — 6 — glucanhydrolase (dextrinaxe)

> Exoamylase: B — amylase, y — amylase

- Amylase từ cõc nguồn khõc nhau cụ thỏnh phần, tinh

chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu, cõc đặc điểm thủy phón khõc nhau

@& = Thu nhan amylase tv vi sinh vật * Phan lap, chon gidng vi sinh vat

-Ổ Chọn cơ chất cảm ứng, thỏnh phần mừi trường nuừi cấy thợch hợp

° Tiởu chuẩn hụa cõc điều kiện nuừi cấy: nhiệt độ nuừi, pH, độ 4m ban đầu, độ thoõng khi

gm Nudi vi sinh vat tao amylase bang

“~ phương phõp bề sóu

- Mừi trường dinh dưỡng: nguồn nguyởn liệu giỏu tinh bột, chất cảm ứng cho sinh trường vi sinh vật tạo

amylase Tỳy loại vi sinh vật, người ta cụ thể bỗ sung

thởm 1 số loại muừi vừ cơ, trong đụ cõc muỗi nitrate được vỉ sinh vật sử dụng như nguồn nitơ

Nhiệt độ nuừi: 30 -3209 C đối với nấm sợi; 370 C đối với

Bacillus subtilis Nhiệt độ nuừi ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của amylase tạo thỏnh

Sục khợ vỏ khuấy trộn: phần lớn vi sinh vật tạo amylase lỏ vi sinh vật hiếu khợ, cần oxy húa tan trong mừi trường đề tăng trưởng

Nguyễn Hữu Trợ Oo

29/09/2011 11:21 SA 180

Trang 31

giỏ Cellulase

* Trong thiởn nhiởn cellulose bị phón hủy bơi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khợ vỏ yếm khợ

Í Qũ trớnh phón hủy nỏy được xỷc tõc bởi enzyme cellulase

- VI sinh vật trong tự nhiởn cụ khả năng sinh tổng hợp

cellulase: nam sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn

- Đụng vai trú quan trong chuyển hụa vật chất trong tự

nhiởn vỏ cả trong cừng nghiệp thực phẩm, mừi trường

29/09/2011 11:21 SA 183 Nguyễn Hữu Trợ a

P|

đi Lactose

-Ổ Một số người khừng thờ hap thu được lactose ở trong sữa tuy nhiền lactose vẫn ở trong hệ tiởu hụa vỏ được lởn men bởi vị khyan Hau qua lỏ lỏm cho cơ thở buừn nừn, co rỷt, sinh hơi, vỏ tiởu chảy sau khoảng Ò 4 giờ sau khi sử dụng sản phóm sữa

+ Lactase tiởu hụa duoc lactose trong thực phẩm

+ Vớ vậy cõc sản phẩm s sữa khừng chứa lactose rất cần thiết

29/09/2011 11:21 SA 185 Nguyễn Hữu Tợ PS

Ẫ 2006 Paul Billiet wg] Pectinase &

Enzyme xỷc tõc sự phón hủy của cõc polymer pectin

Trong tự nhiởn, hiện tượng nỏy thương xảy ra khi trai cay chin

Ưng dụng trong thực phẩm, giỷp lỏm trong nước rau quả

Kiếm soõt hoạt động pectinase giỷp điều chỉnh độ nhớt sản phẩm

Pectinase được phón loại dựa trởn cơ chế tõc

dụng của chỷng

29/09/2011 11:21 SA 182 Nguyờn Hờu Tri a

giỏ Lipase

Lipase lỏ enzyme tham gia thủy phan glyceride tao monoglyceride vỏ cõc acid bờo

Phón loại:

Pancreatic lipase thu từ tuyến tụy của heo Enzyme

nỏy tham gia thủy phón triglyceride, dầu, chất bờo,

acid bờo đơn giản

Pregastric lipase: enzyme được sản xuất từ động vật Enzyme tham gia thủy phón acid bờo chuỗi ngắn trong chất bờo của sữa

Lipase tir vi sinh vat: sử dụng nắm sợi va vi khuẩn

sản xuất lipase theo qui mừ cừng nghiệp

Nguyễn Hữu Tợ PS 29/09/2011 11:21 SA 184

giỏ Lactase

Enzyme lactase (B-galactosidase) thu được từ nấm mốc

Trang 32

giỏ Amylase

Ure + tesxtuetul tor amylase lewets

- +

Fedtsale t4! W$õi ý Male urmary

system aysrem

= mee

she

Urine serge tohewn =

— FADAM 187 Nguyờn Hin Ti A * L5 P| 29/09/2011 11:21 SA Pectinase đỏ =

Thanh phan Prozyme:

Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Pectinase, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, Vitamin

K3, Stay C rất cần thiết cho

sự tiởu hụa vỏ tăng trọng của từm

29/09/2011 11:21 SA 189 Nguyễn Hữu Trợ @ấê-=

ad - Pectinase Bảo quản thực phẩm :

Phối hợp với catalase —› kờo dỏi thời gian bảo quản của bột trứng, sữa khừ, lỏm 6n định bia

Chống rỉ cõc bao bớ đựng nước giải khõt CO; ( do đuổi O,

ra khỏi sản phẩm khi thởm nước vỏo )

Nguyễn Hữu Trợ L5 | 29/09/2011 11:21 SA 191 giỏ Amylase _ oS _ am

Dệt: rủ bỏ hồ vải (tầng lớp hồ để mặt vải trở nởn mịn, dờ 29/09/2011 11:21 SA 188

bắt mỏu) Nguyễn Hữu Trợ “3 Yl đỏ = Pectinase

Pectinase cụ khả nắng thủy phón pectin

Sản xuất nước quả từ nguyởn liệu quả nhờ cơ chế phõ vỡ protopectin (chất lỏm liởn kết tế bỏo), thủy phón protein, phõ vỡ nguyởn sinh chất của tế bỏo —› vỡ tế bỏo — nước

chảy ra, hiệu suất tăng Lỏm trong nước quả ờp (bia, rượu) Nguyễn Hữu Trợ „ YI 29/09/2011 11:21 SA 190

Ẩá Chiến lược sản xuất enzyme tẫy rửa của Novo Nordisk A/S

“ * — oye eet oF ee eee

- a -Gene enzyme lipolase

wee vey pe Ậeee Humicola — lanuginosa

‘ được chuyển vừ

-_Ắ sec te Aspergillus oryzae

| ' thợch hợp cho mục đợch

tHaoaiasen a 2š 5/25 thương mại hơn

` + : -Enzyme lỏm tang

hiệu quả ở cõc điều kiện giặt tay

^^ S9 nmnszrrr ee err re

TH -n định với nhiệt vỏ

pH liởn quan tới giặt

tay

Nguyễn Hữu Trợ

ê]

18 Oe Hemmer en Ẫ owe

Cha (eg eh weeny %Ẳ* 192 wre

Trang 33

&

Định dạng
Số trang	33
Dung lượng	4,64 MB

Công nghệ ENZYME ENZYME TECHNOLOGY

Tỉnh sạch bằng phương pháp thẩm tích