Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không ở tỉnh bà rịa – vũng tàu

Phương pháp xác định, định danh các cấu tử, thành phần hóa học có trong tinh dầu lá Trầu không...40 2.9.. Kết quả xác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã được tối ư

VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN

NCKH ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG NĂM 20

1 Tên đề tài: ………

………

………

………

2 Mục tiêu, nội dung chính: TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ………

HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU LÁ ………

TRẦU KHÔNG Ở BÀ RỊA – VŨNG TÀU ………

………

3 Kết quả, sản phẩm dự kiến: ………

………Chủnhiệm:PhạmMinhTú ………Hướngdẫnkhoahọc:ThS.VũThịHồngPhượng ………

BÀ RỊA-VŨNG TÀU _ NĂM HỌC 2018- 2019

4 Nhu cầu kinh phí dự kiến:

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ iii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 3

1.1 Khái quát về họ Hồ tiêu [1] 3

1.1.1 Phân loại khoa học [1] 3

1.1.2 Phân bố [1] 3

1.1.3 Đặc tính thực vật [1] 4

1.1.4 Thành phần hóa học của lá trầu [1] 4

1.1.5 Lợi ích của cây trầu [14] 4

1.2 Tổng quan về tinh dầu [5] 5

1.2.1 Khái niệm [5] 5

1.2.2 Phân loại tinh dầu [5] 5

1.2.3 Tính chất vật lí và thành phần hóa học của tinh dầu [5] 6

1.2.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu [5] 6

1.2.3.2 Các thành phần hóa học trong tinh dầu [5] 6

1.2.4 Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật [5] 9

1.3 Tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không 9

1.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu Trầu không [15] 9

1.3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không [1], [2], [3] 10

1.3.3 Ứng dụng của tinh dầu Trầu không [14] 12

1.4 Các phương pháp chiết tách tinh dầu [5] 12

1.4.1 Phương pháp chưng cất hơi nước [18] 13

1.4.1.1 Chưng cất bằng nước [18] 15

1.4.1.2 Chưng cất bằng nước và hơi nước [18] 15

1.4.1.3 Chưng cất bằng hơi nước [18] 16

1.6 Các phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để

xác định thành phần trong tinh dầu [5] 17

1.6.1 Phương pháp sắc ký khí (GC) [5] 17

1.6.2 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [5] 19

1.7 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [17] 21

1.7.1 Phương pháp khuếch tán đĩa 21

1.8 Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16] 22

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 30

2.1 Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu 30

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.2 Dụng cụ thiết bị và hóa chất 30

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2 Xử lý nguyên liệu 31

2.3 Dự kiến quy trình chiết xuất tinh dầu trầu không 32

2.4 Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tinh dầu 33

2.4.1 Khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu 33

2.4.2 Khảo sát thời gian ngâm hỗn hợp 35

2.4.3 Khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp 36

2.5 Phương pháp xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không 37 2.5.1 Đánh giá cảm quan 37

2.5.2 Xác định tỷ trọng 37

2.6 Phương pháp định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không 38 2.7 Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu [5] 39

2.8 Phương pháp xác định, định danh các cấu tử, thành phần hóa học có trong tinh dầu lá Trầu không 40

2.9 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [7] 40

2.10 Phương pháp xử lí số liệu 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 43

3.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu 43

3.1.3 Kết quả xác định thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu 45

3.2 Đề xuất quy trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không 47

3.3 Kết quả xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không 48

3.3.1 Đánh giá cảm quan 48

3.3.2 Tỷ trọng 48

3.4 Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không 49

3.5 Kết quả xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu 51

3.6 Kết quả xác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS 52

3.6.1 Sắc ký đồ tinh dầu lá Trầu không 52

3.6.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu không 53

3.6.3 So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa với một số vùng khác đã công bố ở Việt Nam 54

3.7 Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

VPC: Vapour Phase Chromatography

TSB: Tryptic Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB

MHA: Mueller Hinton Agar – Môi trường dinh dưỡng MHA

PDA: Potato dextrose agar (PDA) – Môi trường dinh dưỡng PDA

MHB: Mueller Hinton Broth (MHB – Môi trường dinh dưỡng MHB

XLD: Xylose Lysine Deoxycholate – Môi trường dinh dưỡng XLD

MYP: Mannitol Egg Yolk Polymixin – Môi trường dinh dưỡng MYP

EMB: Eosin Methylene Blue – Môi trường dinh dưỡng EMB

DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức

(CH3)2SO

DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt

động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật

và nhiều loài virus

STEC: Shiga toxin-producing E coli – Một số E coli sản sinh ra độc tố có tên là

độc tố Shiga gây tiêu chảy

CFU/ml: Colony Forming Unit/ đơn vị hình thành khuẩn lạc

v/w: Volume/weight (Thể tích/ Khối lượng)

w/w: Weight/weight (Khối lượng/ Khối lượng)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu 3

Hình 1 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography) 18

Hình 1 3: Sắc ký đồ 19

Hình 1 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 20

Hình 1 5: Vi khuẩn Bacilus cereus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MP 22

Hình 1 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MSA 24

Hình 1 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB 26 Hình 1 8: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi và trên môi trường XLD 27

Hình 1 9: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi và trên môi trường MP 28 Hình 2 1: Lá Trầu không 30

Hình 2 2: Hệ thống chưng cất tinh dầu lá Trầu không tại phòng thí nghiệm 33

Hình 2 3: Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009) 42

Hình 3 1: Mẫu tinh dầu chiết được tại phòng thí nghiệm 48

Hình 3 2: Sắc ký đồ của tinh dầu lá Trầu không 52

Hình 3 3: Khả năng kháng B cereus của tinh dầu lá Trầu không 56

Hình 3 4: Khả năng kháng E Coli của tinh dầu Trầu không 56

Hình 3 5: Khả năng kháng S typhi của tinh dầu lá Trầu không 57

Hình 3 6: Khả năng kháng S aureus của tinh dầu lá Trầu không 57

Hình 3 7: Khả năng kháng P aeruginosa của tinh dầu lá Trầu không 58

Bảng 2 1: Bảng dụng cụ thiết bị 30

Bảng 3 1: Các thông số sử dụng để khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu 43

Bảng 3 2: Kết quả khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 43

Bảng 3 3: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian ngâm 44

Bảng 3 4: Kết quả khảo sát thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 44

Bảng 3 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất 45

Bảng 3 6: Kết quả khảo sát thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 45

Bảng 3 7: Kết quả trung bình cộng của ba lần cân ống tiêm để đo tỷ trọng tinh dầu 48

Bảng 3 8: Kết quả định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không 49

Bảng 3 9: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu không 53

Bảng 3 10: So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng khác ở Việt Nam 54

Bảng 3 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm) 55

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2 1: Quy trình công nghệ chiết tách tinh dầu lá Trầu không 32

Sơ đồ 2 2: Quy trình chiết tách xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu 34

Sơ đồ 2 3: Quy trình chiết tách xác định thời gian ngâm 35

Sơ đồ 2 4: Quy trình chiết tách xác định thời gian chưng cất 36

Sơ đồ 3 1: Quy trình hoàn thiện chiết tách tinh dầu lá Trầu không 47

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3 1: Thể hiện tinh dầu thu được phụ thuộc vào tỷ lệ nước/nguyên liệu 43

Biểu đồ 3 2: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm 45

Biểu đồ 3 3: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian chưng cất 46

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay khi mà xã hội không ngừng phát triển, đời sống vật chất tinh thần củacon người ngày một nâng cao, vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con ngườingày càng được chú trọng Với việc ứng dụng những tiến bộ khoa học vào lĩnh vực yhọc con người đã nghiên cứu tổng hợp và điều chế được nhiều loại dược phẩm cónguồn gốc thiên nhiên Các dược liệu có hợp chất tự nhiên ngoài tác dụng chữa bệnhcòn bổ sung cho cơ thể các dưỡng chất, không độc hại, cơ thể hấp thụ tốt và khônggây ra các tác dụng phụ Do đó, việc phát hiện và đi sâu nghiên cứu các hợp chất cótrong thảo dược luôn được chú trọng Việt Nam ta là một trong những nước nhiệt đới,nóng, ẩm và mưa nhiều, có nguồn dược liệu rất phong phú lên đến 12000 loài, đa dạng

và một nền y học dân tộc phát triển lâu đời Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụngnhiều loại thảo dược trong việc dưỡng thương, trị bệnh và bồi bổ cơ thể Những nămgần đây, thuốc tân dược của nền y học hiện đại được sử dụng một cách rộng rãi nhưngnhững vị thuốc dân gian đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày củacon người, đã có rất nhiều bệnh tật được chữa khỏi nhờ các loại thảo

Lá Trầu không rất quen thuộc với chúng ta, trong dân gian được sử dụng xônghơi cho phụ nữ sau sinh, tắm cho trẻ sơ sinh Trong y học cổ truyền, lá trầu không có

vị nồng, hơi cay, tính ấm, công dụng ôn trung (làm ấm bụng), tán hàn (trừ lạnh) Sovới nhiều loại cây dược liệu khác các thông tin khoa học về lá trầu không vẫn chưarộng rãi Trên tinh thần mong muốn đóng góp phần tìm hiểu mối quan hệ giữa thànhphần hóa học của cây với công dụng dược tính đã được sử dụng em chọn đề tài:

“Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầukhông

- Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, từ đó xây dựng quy trình chiết tinh dầu

- Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của lá trầu không

3 Đối tượng nghiên cứu

Lá Trầu không được sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại xã Nghĩa

Thành, huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết xuất tinh dầu, xác định thành phần hóa học trong tinhdầu lá Trầu không

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tinh dầu

6 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu

- Phương pháp phân tích, đánh giá tài liệu

- Phương pháp xử lý số liệu

7 Các kết quả đạt được của đề tài

- Trích ly được tinh dầu với phương pháp và điều kiện tối ưu nhất

- Xác định được tỷ trọng, màu sắc, mùi vị của tinh dầu lá Trầu không

- Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không hiệu quả trên 5 chủng

vi khuẩn

8 Cấu trúc của đồ án

Cấu trúc bài báo cáo gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan lý thuyết Chương 2: Thực nghiệm

Chương 3: Kết quả thực nghiệmChương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Khái quát về họ Hồ tiêu [1]

Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là một họ thực vật chứa trên 2.000 loài, được nhóm

trong 9 chi Chúng là các loại cây bụi hay dây leo ở khu vực nhiệt đới Các loài của họnày nói chung có hoa được chia thành chuỗi, thông thường có mùi thơm rất mạnh, caynồng Quan trọng nhất về mặt kinh tế trong họ này bao gồm các loại cây ăn hạt, lá nhưtiêu, trầu, lá lốt, xem hình 1.1

Hình 1 1:Một số loài cây thuộc họ hồ tiêu

1.1.1 Phân loại khoa học [1]

Tên khoa học của cây trầu là Piper betle Cây trầu còn được gọi là trầu không,betel Baum (Đức), árbol de betel (Tây Ban Nha), arbre de betel (Pháp), pokok sirih(Malaisia), Betel Boom (Hà Lan)

1.1.2 Phân bố [1]

Loài này có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á và được trồng ở Ấn Độ, Indonesia, SriLanka, Việt Nam, Malaysia Lá trầu loại tốt nhất thuộc về giống "Magahi" (từ vùngMagadha) sinh trưởng ở gần Patna tại Bihar, Ấn Độ Ở nước ta, cây trầu được trồng khắpcác vùng miền với quy mô lớn nhỏ khác nhau Có thể trồng từng cây riêng lẻ ở từng hộ

gia đình hoặc trồng thành vườn.

1.1.3 Đặc tính thực vật [1]

Cây trầu hay trầu không là một cây gia vị, cây thuốc Đây là loại cây thường cómàu xanh, dây leo, sống lâu năm, lá hình trái tim có mặt bóng và các hoa đuôi sóc màutrắng

1.1.4 Thành phần hóa học của lá trầu [1]

Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá trầu chứa các thành phầnsau:

- Lá trầu chứa tinh dầu gồm 23 thành phần, trong đó chủ yếu: 3-Allyl- 6-methoxyphenylacetate (14,95%); 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene (8,98%); Chavicol (4,57%); Eugenol(9,03%); Beta-caryophyllene (7,06%); Linalool (1,55%) Tinh dầu của nó có màu vàngnhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay

- Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho biết lá trầu còn chứa cả chất tanin, đường khử, pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, axit hữu cơ

1.1.5 Lợi ích của cây trầu [14]

- Lá dùng để xông hơi giúp phụ nữ sau sinh kháng khuẩn vùng kín

- Lá dùng để hơ trẻ sơ sinh giúp khử trùng tự nhiên và kháng các chủng vi khuẩn gâybệnh cho trẻ, chữa phát ban, chữa ho, mát xa bằng lá trầu giảm chướng bụng, khó tiêu

- Tại Thái Lan và Trung Quốc chúng được dùng để làm dịu bệnh đau răng Lá trầu nhai với vôi giúp sát trùng răng miệng, chữa viêm mũ chân răng, giúp răng chắc khỏe

- Ăn trầu giúp không bị bệnh đường tiêu hóa, kí sinh trùng ở ruột

- Nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm

- Lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt chữa viêm kết mạc

- Các lá trầu không cũng được sử dụng như là chất kích thích, chất khử trùng và chấtlàm sạch hơi thở Trong y học Ayurveda, chúng còn được sử dụng như là thuốc kíchdục

- Tại Malaysia chúng được sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp và các thương tổn khớp

-Tại Indonesia chúng được uống như một loại trà và sử dụng như là thuốc kháng sinh.Chúng cũng được sử dụng trong trà để điều trị chứng khó tiêu, cũng như trong thuốc mỡhay thuốc hít để điều trị đau đầu, cũng như trong điều trị chứng táo bón, cũng như có

tác dụng thông mũi và hỗ trợ tiết sữa.

- Người Việt Nam từ hàng ngàn năm nay đã sử dụng Trầu Không + Cau để sáng tạolên một món ăn truyền thống mang ý nghĩa nhân văn và văn hóa của người Việt Nam "miếng trầu là đầu câu chuyện"

1.2 Tổng quan về tinh dầu [5]

Tinh dầu từ lâu đã được loài người biết đến, ngay từ thời thượng cổ người ta biếtđến và sử dụng các loại cây có tinh dầu ở dạng phơi khô, thời kỳ trung cổ khoảng thế

kỷ thứ 15 tinh dầu ngày càng phổ biến, từ thế kỷ thứ 15 đến thế kỷ thứ 17 tinh dầu đãđược sử dụng để làm thơm cho tóc và da mặt, dùng để chữa bệnh và dùng trong đờisống hàng ngày của con người Từ thế kỷ thứ 17 đến thế kỷ thứ 19, tinh dầu được dùngnhiều để trang điểm, làm thuốc và dùng trong công nghiệp với phạm vi rộng hơn

Từ thế kỷ 20 đến những năm đầu của thế kỷ 21, cùng với sự tiến bộ của nhân loại

và sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nghành công nghiệp sản xuất tinh dầu đã dần pháttriển, tinh dầu đã trở thành một sản phẩm không thể thiếu trong đời sống của conngười và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: hương liệu, thựcphẩm, mỹ phẩm, dược phẩm

1.2.1 Khái niệm [5]

Tinh dầu là hỗn hợp nhiều cấu tử dễ bay hơi, có mùi thơm hay mùi hắc khó chịuđược tách ra từ các bộ phận của thực vật, là sản phẩm của quá trình chưng cất và chiếtnguyên liệu

Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất và không được sửdụng lại trong hoạt động sống của cây Mỗi loại tinh dầu được lấy từ các nguồnnguyên liệu khác nhau sẽ có mùi vị khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của các hợpchất có trong đó Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3000 loài, trong đó có 150 – 200 loài

có ý nghĩa công nghiệp như làm xà phòng, hương liệu trong bánh kẹo, nước giải khát;trong ngành y học cũng có nhiều đóng góp như giảm stress, tá dược trong thuốc…

1.2.2 Phân loại tinh dầu [5]

Có hai loại tinh dầu: tinh dầu nguyên chất và tinh dầu không nguyên chất:

+ Tinh dầu nguyên chất: Hoàn toàn không có độc tố, không có chất bảo quản hóa học nên rất an toàn cho người sử dụng và mang kết quả nhanh khi điều trị

+Tinh dầu không nguyên chất: Là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất với các

chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu.

1.2.3 Tính chất vật lí và thành phần hóa học của tinh dầu [5]

1.2.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu [5]

- Tinh dầu thường tồn tại dạng thể lỏng ở nhiệt độ thường, mùi thơm nhẹ, ít khi

có màu trừ tinh dầu chứa aluzen có màu xanh, tinh dầu có tỉ trọng nhỏ hơn tỉ trọng củanước nên nhẹ hơn nước, chỉ số khúc xạ cao Tinh dầu bay hơi được, tinh dầu ít tantrong nước nhưng làm cho nước có mùi thơm, tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt

độ sôi nhất định, tinh dầu tan tốt trong cồn, ete, dung môi hữu cơ và các chất béo

- Để xác định tính chất vật lý của tinh dầu, thông thường người ta tiến hành xácđịnh các chỉ số như tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan trong cồn 900C ở 2500C, nhiệt độ sôi, năng suất quay cực, màu sắc

- Hầu hết tỷ trọng các loại tinh dầu thường nhỏ hơn 1, do vậy chúng thường nhẹnước Tùy nhiên, cũng có một vài tinh dầu có khối lượng riêng lớn hơn nước (như tinhdầu quế, tinh dầu đinh hương, )

- Tinh dầu không tan hoặc ít tan trong nước nhưng chúng hòa tan tốt trong đa sốcác dung môi hữu cơ như este, cồn, Mặc dù thành phần hóa học của mỗi loại tinhdầu là khác nhau, nhưng nhìn chung chúng có nhiệt độ sôi khoảng 800C – 1500C, dễbay hơi và có mùi thơm

- Về màu sắc, tinh dầu thường không màu hoặc có màu vàng nhạt Một số ít tinhdầu có màu (ví dụ: tinh dầu ngải cứu có màu xanh lơ, tinh dầu quế có màu sẵm) là do

sự có mặt của các hợp chất có màu được lôi kéo theo tinh dầu trong quá trình chiếtxuất (ví dụ: màu xanh do có chlorophyll, màu vàng do có carotenoid, ) Còn mùi và

vị của tinh dầu chủ yếu gây ra do các cấu tử bị oxy hóa

1.2.3.2 Các thành phần hóa học trong tinh dầu [5]

- Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cáchchưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc nhữngthành phần khác của thực vật Tinh dầu đưọc ví như là nhựa sống của cây, vì vậy đãmang sức sống, năng lượng và mạnh hơn 100 lần các loại thảo dược sấy khô

- Hidrocacbon: Các hidrocacbon thường gặp trong tinh dầu là những terpen (C10H16)n mạch hở hoặc mạch vòng

Bất kỳ một loại tinh dầu nào cũng đều có những thành phần sau:

 Monoterpenes: Được tìm thấy trong hầu hết các loại tinh dầu, Monoterpenes có

công thức phân tử là C10H16 mạch hở Tiêu biểu như là miaxene, oximene có trongtinh dầu hoa nguyệt quế

- Monoterpenes là chất khử trùng và thuốc bổ trong tự nhiên, chúng được lọc không khí tốt và có mặt trong hầu hết các loại tinh dầu

 Sesquiterpene: Mặc dù không phải là dễ bay hơi như Monoterpenes, các

Sesquiterpene mạch thẳng và vòng tiêu biểu là Farnesene, Zingiberene

- Các chất khử trùng hầu hết hóa chất có trong thực vật, kích thích cơ thể, phenol

có tác dụng khi sử dụng với liều lượng nhỏ Tuy nhiên, liều lớn có thể là một chất độccho hệ thần kinh và có thể gây kích ứng da

• Ancol: Một số ancol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như: Menthol, α –

Terpincol, Geraniol,

- Rất nhiều ancol cũng có mặt trong các loại tinh dầu Làm chất sát trùng, khángkhuẩn, chống nấm rượu và thuốc kháng sinh, thuốc bổ rất tốt cho hệ thần kinh và kíchthích phản ứng miễn dịch trong cơ thể

 Este: Các este bốc hơi nhanh và tạo độ ngát cho hương Một số este có trong tinh

dầu: etyl anthranilate, benzyl axetat,

- Este có tính chất chống co thắt, kháng khuẩn và chống viêm, dùng ete nhẹ nhàngtrên da và giúp đỡ trong việc tái cân bằng của hệ thần kinh có hiệu quả

 Aldehyt: Trong tinh dầu có rất nhiềualdehyt, song hiện nay các andehit đều thu

được qua tổng hợp hóa học Chỉ có các aldehyt như Aldehyt Cuminic, Citral và

Citronellal được trích ly từ nguyên liệu tự nhiên

(E) – Citral (geranial) Citronellal

- Aldehyt chống viêm, có tính chất tương tự như Xeton và Ancol Tuy nhiên, lượng Aldehyt có thể gây ra kích thích lớn cho da và các màng nhầy

 Các hợp chất khác: Ngoài các hợp chất nói trên, trong các loại tinh dầu còn có

các hợp chất thuốc nhóm oxit như: (eucalyptus) và các aminoaxit (axit antranilic), cáclacton (coumarin, ambretolit), các hợp chất có lưu huỳnh như: (anlylisosulfocyannat),hợp chất có nitơ (metyl antranilat)

1.2.4 Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật [5]

Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới rấtnhiều trong công trình nghiên cứu Theo quan niệm được trình bày trong các côngtrình khác nhau, vai trò của tinh dầu được quy tụ trong các nội dung sau đây:

 Bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh

 Che phủ các vết thương ở cây gỗ

 Ngăn chặn các bệnh do nấm

 Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tănghiệu quả của các phản ứng enzym

1.3 Tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không

1.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu Trầu không [15]

Tinh dầu Trầu không là dạng chất lỏng trong suốt, thơm mùi đặc trưng, màu vàngđến nâu sẫm Các thông số vật lí như sau:

Bảng 1.1: Thông số vật lý của tinh dầu lá Trầu không ở 30 0 C

Tỷ trọng (g/cm3) 1,044 – 1,054

Chỉ số khúc xạ (n) 1,5 – 1,524

Góc quay cực (0) -1,5 – -4

1.3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không [1], [2], [3]

 Chavicol: hoặc p -allylphenol, là một phenylpropene tự nhiên, một loại hợp

nhóm hydroxy và nhóm propenyl Nó là một chất lỏng không màu được tìm thấy cùngvới terpen trong tinh dầu trầu

 Eugenol: là một guaiacol thay thế chuỗi allyl, một thành viên của lớp hợp chất

hóa học allylbenzene Nó là một chất lỏng nhờn không màu đến màu vàng nhạt, thơmđược chiết xuất từ một số loại tinh dầu đặc biệt là từ dầu đinh hương, nhục đậu khấu,quế, húng quế và lá nguyệt quế Nó hiện diện ở nồng độ 80% ngọn, 90% trong dầu nụđinh hương và ở 82% trong dầu lá đinh hương Eugenol có mùi hương dễ chịu, cay,giống như đinh hương

 Beta-caryophyllene: làmộtsesquiterpene (làmột lớp terpenbao gồm bađơnvị

isopren và thường có công thức phân tử C15H24 Giống như monoterpen, sesquiterpen cóthể có dạng vòng hoặc chứa các vòng Sesquiterpenes được tìm thấy tự nhiên trong

thực vật và côn trùng, dưới dạng hóa học, ví dụ như các tác nhân phòng thủ hoặcpheromone.) tự nhiên là thành phần của nhiều loại tinh dầu, đặc biệt là dầu đinh hương,

tinh dầu từ hoa Syzygium aromaticum (đinh hương), tinh dầu của Cannabis sativa (hương thảo) Nó thường được tìm thấy dưới dạng hỗn hợp với isocaryophyllene (đồng

phân liên kết đôi cis) và α-humulene (tên lỗi thời: α-caryophyllene), một đồng phân mở

vòng Caryophyllene đáng chú ý vì có một vòng cyclobutane, cũng như một liên kết

ngang trong một vòng 9 nhóm, cả hai hiếm có trong tự nhiên Caryophyllene là một trongnhững hợp chất hóa học góp phần tạo nên mùi thơm của hạt tiêu đen

 Công thức: C15H24

 Khối lượng phân tử: 204,357 g/mol

 Tỉ trọng: 0,9052 g/cm³

 Điểm sôi: 1300C

 Linalool: là một chất lỏng không màu, có mùi nhẹ Nó xuất hiện trong nhiều loại

tinh dầu, chẳng hạn như quýt, cây bạc hà, hoa hồng, cây bách, chanh, quế Linaloolcòn được tìm thấy ở một số loại nấm Nó được sử dụng nhiều trong thương mại, phần lớn trong số đó dựa trên hương thơm dễ chịu của nó

 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene: hay còn gọi là Methyleugenol là một hợp chất

hóa học tự nhiên được phân loại là phenylpropene, một loại phenylpropanoid Nó là

methyl ether của eugenol và rất quan trọng đối với hành vi và sự thụ phấn của côn trùng.

Nó được tìm thấy trong cấc loại tinh dầu khác nhau

1.3.3 Ứng dụng của tinh dầu Trầu không [14]

- Tinh dầu lá Trầu không có hoạt tính kháng sinh mạnh, ức chế nhiều chủng vikhuẩn như: Tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, trực khuẩn coli, trực khuẩn lị, phẩy khuẩntả và có tác dụng kháng nấm mạnh đối với nhiều chủng loại nấm

- Tinh dầu trầu: xoa bóp khi đau nhức xương khớp, xông đèn tinh dầu giải stress, giảm đau đầu

- Trong lĩnh vực chăm sóc sắc đẹp tinh dầu dùng làm tinh chất trị mụn trong kem

- Trong dược phẩm tinh dầu được dùng làm nước súc miệng

- Trong ngành y học tinh dầu Trầu không còn được ứng dụng sản xuất các sản phẩm dung dịch vệ sinh phụ nữ đang rất được quan tâm và phát triển

1.4 Các phương pháp chiết tách tinh dầu [5]

- Dựa trên cách thực hành, người ta chia các phương pháp sản xuất tinh dầu ra làmbốn loại: cơ tiến hành theo bất cứ phương pháp nào, quy trình sản xuất đều có nhữngđiểm chung sau đây:

 Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

 Quy trình khai thác phải phù hợp nguyên liệu

 Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu với chi phí thấp nhất

- Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như:

 Dễ bay hơi

 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 1000C

 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.

 Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí

1.4.1 Phương pháp chưng cất hơi nước [18]

Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơinước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơinước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng

do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định

Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì khichưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm

áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn

 Lý thuyết chưng cất:

Định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựatrên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cấtmột hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suất hơi tổng cộng là tổngcủa hai áp suất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với ápsuất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần bách phân của hỗn hợp,miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại Nếu vẽ đường cong áp suất hơi của từngchất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng với một áp suất, ta

dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là nhiệt độ sôi của hỗnhợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất Thí dụ, ở áp suất 760 mmHgnước sôi ở 1000C và benzen sôi ở 800C và chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau.Nếu đun hỗn hợp này dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 690C cho đến khi nào cònhỗn hợp hai pha lỏng với bất kì tỉ lệ nào Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại

690C, áp suất hơi của nước là 225 mmHg và benzen là 535 mmHg

Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cấthơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật

 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước:

 Sự khuếch tán:

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ vàcho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu còn lại trongcác mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm

thấu Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòatan vào lượng nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các môthoát ra ngoài hết.

Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất

sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô Nhưng nếu lượngnước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu cóchứa những cấu phần tan dễ trong nước

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớpnguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồngđều và dễ dàng

Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trêncho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước

 Sự thủy giải:

Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcolkhi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sựchưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

 Nhiệt độ:

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quánhiệt (trên 1000C) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất,sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầu đềukém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ caocủa tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng cóliên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, sự khuếch tánthẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng tăngtheo

 Ưu và nhược điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước:

 Ưu điểm:

- Phương pháp này đơn giản, dễ làm

- Thiết bị rẻ tiền, gọn và dễ chế tạo

- Phù hợp với những cơ sở sản xuất nhỏ, vốn đầu tư ít

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản.

- Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp phụ

- Thời gian chưng cất tương đối nhanh

 Nhược điểm:

- Hiệu suất thấp

- Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật như tốc độ, nhiệt độ chưng cất

- Không hiệu quả với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

 Chưng cất bằng nước và hơi nước

 Chưng cất bằng hơi nước

1.4.1.1 Chưng cất bằng nước [18]

Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu nhưng phải chừa một khoảngkhông gian tương đối lớn phía trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chấtnạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun bằng củi lửa, bếp gia nhiệt Trongtrường hợp chất nạp quá mịn lắng xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu

ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị các cánh khuấy để trộn đều nguyênliệu trong lúc chưng cất Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu

dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này.Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khốilượng lớn nước phủ đầy khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này

1.4.1.2 Chưng cất bằng nước và hơi nước [18]

Trong trường hợp này, nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổsao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp, hoặcdùng hơi nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Có thể coi phươngpháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơinước ở áp suất thường Như vậy chưng cất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn làtrường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước

quá nhiệt Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so vớiphương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp bằng cách xuyên qua nó nên phảisắp xếp thế nào để chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốn vậy,chất nạp phải có kích thước đồng đều, không sai lệch nhau quá Nếu chất nạp được nghiềnquá mịn nó sẽ dễ bị vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi nước tựphá xuyên lên Như vậy, phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước Ngoài ra,luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vàolớp nước nằm bên dưới gây hư hỏng thất thoát Tốc độ chưng cất trong trường hợp nàykhông quan trọng như chưng cất bằng nước tuy nhiên, tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngănđược tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất Về sản lượng tinh dầumỗi giờ, người ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn kém hơnphương pháp chưng cất bằng hơi nước sẽ đề cập sau So với phương pháp chưng cất bằngnước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩm phân hủy Do đó, dù với thiết bị nào đi nữa, taphải đảm bảo chỉ có phần đáy nồi được đốt nóng và giữ cho phần vỉ không tiếp xúc vớinước sôi Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường, nên cấuphần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn; nhưvậy sẽ tốn rất nhiều thời gian Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng cất, nước ở bên dưới

vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi

1.4.1.3 Chưng cất bằng hơi nước [18]

Hơi nước tạo ra từ lò hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng vàobình chưng cất Điểm ưu việc của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh được ápsuất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ ở nhiệt độ nhất định

để tinh dầu không bị phân hủy Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào nhữngđiều kiện hạn chế như đã trình bày ở hai phương pháp chưng cất nói trên cộng thêm haiyếu tố nữa là yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phânhủy những cấu phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô lại khiến quá trình thẩmthấu không xảy ra Do đó trong thực hành, nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại quá sớm,người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong thời gian cho đến khi sự khuếchtán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới dùng hơi nước quá nhiệt Còn trong trường hợphơi nước quá ẩm, sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt,người ta sẽ phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi

Trong công nghiệp, hơi nước trước khi đưa vào bình chưng cất phải đi qua bộphận tách nước với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng,nên tốt nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khikết thúc Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì chất nạp đòi hỏimột kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộcvào đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất.

1.5 Phương pháp định tính thành phần trong dịch chiết lá Trầu không bằng các phản ứng và thuốc thử

Tiến hành định tính một số thành phần hoá học trong dịch chiết lá Trầu không:

- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger

- Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann – Burchard, Rosenthaler,

- Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner

- Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc

- Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt

- Định tính nhóm tanin bằng: dung dịch FeCl3

1.6 Các phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để xác định thành phần trong tinh dầu [5]

nhau – gọi là thời gian lưu của hợp chất Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ đượcphát hiện và xác định bằng điện tử Ngoài ra, một số thông số khác có thể được sửdụng để thay đổi thứ tự hoặc khoảng thời gian lưu: tốc độ dòng khí mang, chiều dài cột

và nhiệt độ Phân tích bằng sắc ký khí dựa trên việc so sánh thời gian lưu này

- Trên sắc ký đồ ta thu được các tính hiệu tương ứng với các cấu tử cần tách gọi làpeak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trong cho chất cần tách (định tính) Còndiện tích của peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu.

 Điểm khác nhau giữa sắc ký khí và các phương pháp dùng sắc ký khác (sắc

ký cột, HPLC, TLC):

- Quá trình tách các hợp chất trong một hỗn hợp được tiến hành giữa một phalỏng tĩnh và một pha khí động, trong khí đó ở sắc ký cột pha tĩnh ở dạng rắn và phađộng ở dạng lỏng

- Cột mà pha khí đi qua được đặt trong lò cột có thể điều chỉnh được nhiệt độ khí, trong khí đó ở sắc ký cột (điển hình) không có sự điều chỉnh nhiệt độ đó

- Nồng độ của một hợp chất ở pha khí chỉ phụ thuộc vào áp suất bay hơi của khí

 So sánh Sắc ký khí với chưng cất phân đoạn:

 Giống nhau: cả hai quá trình này đều tách các hợp chất từ một hỗn hợp

chủ yếu dựa vào sự khác biệt của điểm sôi (hoặc áp suất bay hơi)

 Khác nhau: chưng cất phân đoạn thường được dùng để tách các hợp chất

từ một hỗn hợp ở qui mô lớn còn sắc ký khí được sử dụng ở qui mô nhỏ hơn nhiều (tức

là mức độ vi lượng)

Sắc ký khí đôi khi còn được hiểu là sắc ký pha hơi (VPC) hoặc sắc ký phân đoạnkhí – lỏng (GLPC) Nói một cách chính xác, GLPC là thuật ngữ chính xác nhất và dovậy được nhiều tác giả sử dụng

Các thành phần của máy sắc ký khí:

Hình 1 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography)

 Nguyên lý hoạt động:

- Nhờ có khí mang trong chứa trong bơm khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồngbay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buông điều nhiệt quá trình sắc ký xảy ra tạiđây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vàodetector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện tín hiệu này được khuyến đạirồi chuyển sang bộ ghi, tính phân kế hoặc máy vi tính Các tín hiệu được xử lý ở đó rồichuyển sang bộ phận in và lưu kết quả Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứngvới các cấu tử được tách gọi là peak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng chochất cần phân tích diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợpcần nghiên cứu

- Sắc ký đồ là tập hợp tất cả các peak, mỗi peak đại diện cho mỗi chất Dựa vàothời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi peak ta xác địnhđược thành phần mỗi chất trong hỗn hợp

Hình 1 3: Sắc ký đồ

 Ứng dụng: chủ yếu của sắc ký khí bao gồm kiểm tra độ tinh sạch của một chất

cụ thể, hay tách các chất khác nhau ra khỏi một hỗn hợp (khối lượng của các chất nàycũng có thể được xác đinh một cách tương đối) Trong một số trường hợp, kỹ thuật sắc

ký khí có thể dùng để xác định một hợp chất nào đó Trong sắc ký điều chế, phươngpháp ký khí được sử dụng để tinh chế các hợp chất từ một hỗn hợp

hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.

 GC – MS bao gồm:

 Sắc ký khí (GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các

chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.

 Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét

nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10 –6mmHg) Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một

điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và

điện tích của chúng và được ghi nhận theo cường độ của các hạt đó Dùng để

xác định định tính và định lượng

Hình 1 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)

 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:

- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ đượctiêm vào hệ thống ở cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường làhelium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí

- Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt Nhiệt độ của lònày dao động từ 40 – 320o

C

- Cột (cloumn):

 Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặttrong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này

 Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ ở đâychúng bị ion hóa Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc

lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng Thông tinnày sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ Khối phổ làmột biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.

- Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp vàđưa ra kết quả khối phổ

 Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ:

- Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trong phổ đồ

- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân

tử cũng như ion mảng

- Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định

1.7 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [17]

1.7.1 Phương pháp khuếch tán đĩa

Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al(2000) Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LBđặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ởnhiệt độ 370C Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200μL dịch khuẩn,L dịch khuẩn,nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LBđặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6mm sao cho mỗi giếng cách nhau2-3 cm Chuẩn bị tinh dầu thử bằng cách hòa tan tinh dầu trong Dimethyl Sulfoxide(DMSO 2%), TWEEN 80 0,2% thành các nồng độ theo yêu cầu Bổ sung 50μL dịch khuẩn,L dịchchiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòngtrong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vikhuẩn; sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ Đối chứng dương là dung dịchkháng sinh ( Ampicilin 10 g/ml, Tetracyclin 30 g/ml, Amoxilin 10 g/ml); đối chứng

âm là DMSO 2% và TWEEN 80 0,2% Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằngcách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong

đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch (giếng) Thínghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình

1.8 Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16]

Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình

ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thựcphẩm vào năm 1955 Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc

thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh

thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều

Theo phân loại khoa học, Bacillus cereus thuộc:

– Giới (Kingdom): Bacteria

– Ngành (Division): Firmicutes

– Lớp (Class): Bacilli

– Bộ (Order): Bacillales

– Họ (Family): Bacillaceae

– Giống (Genus): Bacillus

– Loài (Species): Bacillus cereus

Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử Kích thước 0,5 - 1,5 µm x 2 - 4 µm Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động

Hình 1 5: Vi khuẩn Bacilus cereus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MP

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức

ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm

 Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi,

sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 0C, tối ưu 35 – 40 0C, độ pH 4,5 - 9,3, thích hợp 7 - 7,2

+ Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.+ Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng

+ Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng

+ Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng.

+ Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn

 Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố

+ Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc tố trênthịt, rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruộtgây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng

+ Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơmnguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phânhủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày

b) Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập

từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầucủa lịch sử ngành vi sinh vật học

Phân loại khoa học:

– Giới (Kingdom): Eu bacteria

– Ngành (Division): Firmicutes

– Lớp (Class): Bacilli

– Bộ (Order): Bacillales

– Họ (Family): Staphylococcaceae

– Giống (Genus): Staphylococcus

– Loài (Species): Staphylococcus aureus

- Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò

trong y học:

+ Staphylococcus aureus (S aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh + Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).

+ Staphylococcus saprophyticus.

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể

sinh trưởng ở nhiệt độ thấp Theo Mc Landsborough L (2005), nhiệt độ sinh trưởng

hay kỵ khí tuỳ ý Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục

rõ Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có thể có màu vàng đậm,

màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ Ngoài ra S aureus có thể

sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môitrường có nồng độ muối cao

Hình 1 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MSA

Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ

Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống, thường sống ký sinh vô

hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA) xâm

nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳnghạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong

 Tính chất sinh hoá và đề kháng:

+ Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầuvàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác

+ S aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) chuyển hoá hydrogen peroxit thành

nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol,

trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA Tất cả các dòng S.

aureus đều mẫn cảm với novobiocine.

có nhiệt độ trên 150C hơn cả vi khuẩn Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S aureus là

+ Các enzyme ngoại bào:

• Protease phân giải protein của tế bào chủ

• Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo(FAME)

c) Escherichia coli

Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quátrình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885 Vì loài này kí

sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi

khuẩn coli) Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mìnhnhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học.Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề

"Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung".Phân loại khoa học:

– Giới (Kingdom): Bacteria

– Ngành (Division): Proteobacteria

– Lớp (Class): Gammaproteobacteria

– Bộ (Order): Enterobacteriales

– Họ (Family): Enterobacteriaceae

– Giống (Genus): Escherichia

– Loài (Species): E.coli

Escherichia coli là một loại vi khuẩn gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi khuẩn

có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng.Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy vànhiễm trùng sinh mủ

Hình 1 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB

Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn Ecoli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μL dịch khuẩn,m đến 5 μL dịch khuẩn,m Một số loài có thể

di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động Chúngkhông thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác

Sinh trưởng ở 15 – 40 0C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH từ 6,4 – 7,4 Mọc tốt trên môi trường thạch EMB, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn,ướt, hồng tím khoảng 2 – 3 mm

 Tính chất sinh hóa và đề kháng:

+ Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic

+ Hầu hết các loại vi khuẩn E coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi.

+ Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 1000C trong 2 giờ

+ Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%

+ Bị hủy bởi formol 5%

+ Rất độc, chỉ cần 0,05mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ

thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng.

+ Các loại E coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ

phận khác trong cơ thể

Được phân lập lần đầu vào năm 1880 bới Karl J Erberth, S typhi là một mầmbệnh đa cơ quan sinh sống ở các mô tuyến giao cảm của ruột non, gan, lá lách và máucủa người nhiễm bệnh

Phân loại khoa học:

– Giới (Kingdom): Bacteria

– Ngành (Division): Proteobacteria

– Lớp (Class): Gammaproteobacteria

– Bộ (Order): Enterobacteriales

– Họ (Family): Enterobacteriaceae

– Giống (Genus): Salmonella enterica typhi

Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi,

không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường

Hình 1 8: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi và trên môi trường XLD