Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma co 60 để chế tạo b glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thành Long NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TAN TRONG NƢỚC CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ BÃ MEN BIA Chun ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Lê Quang Luân Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Luận án “Nghiên cứu ứng dụng xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lƣợng phân tử thấp tan nƣớ oạt t n in ọ từ n ia” thực từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019 Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Viện Sinh học Nhiệt đới Tính cấp thiết β-glucan biết đến rộng rãi chất kích thích miễn dịch mạnh, làm giảm cholesterol chất béo trung tính, điều hòa lượng đường máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa da, v.v βglucan có tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch hạn chế phát triển khối u người nên có hoạt tính phòng chống mạnh mẽ khối u giúp nâng cao hiệu điều trị ung thư, làm giảm tác dụng phụ hóa trị, v.v Trong chăn ni, β-glucan có tác dụng làm tăng cường hệ thống miễn dịch, giúp vật ni kháng số bệnh, từ làm tăng suất chất lượng sản sản phẩm mà khơng cần phải dùng đến kháng sinh chất kích thích Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao khó hòa tan nên hấp thu nên gặp số trở ngại ứng dụng thực tiễn Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp có hiệu ứng sinh học tốt β-glucan β-glucan tan nước có Mw khoảng từ 1-30 kDa cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao so với β-glucan có Mw cao β-glucan Mw thấp tan nước phân tử β-glucan dễ tan nước nên dễ dàng hấp thu có hoạt tính sinh học cao sử dụng hiệu Để có β-glucan Mw thấp tan nước cắt mạch phương pháp chiếu xạ chứng minh hiệu với ưu điểm bật thời gian ngắn, quy trình đơn giản, điều chỉnh liều xạ để thu β-glucan có Mw mong muốn, sản phẩm có độ tinh khiết cao, không cần tinh chế lại thân thiện với môi trường β-glucan hợp chất cấu tạo nên thành tế bào nấm men bia nước có 300 sở sản xuất bia với cơng suất thiết kế 1,7 tỷ lít/năm, lượng bã nấm men ~1% Bã thải sử dụng phần số lại xử lý thải mơi trường Chính vậy, việc sử dụng nguồn bã thải nấm men bia để tách tạo β-glucan làm nguyên liệu để chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp tan nước có hoạt tính sinh học cao hiệu thiết thực nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo sản phẩm có giá trị cao góp phần giảm thiểu nguồn gây ô nhiễm môi trường Luận án nghiên cứu hồn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào bã nấm men bia thiết lập quy trình cơng nghệ chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp tan nước phương pháp chiếu xạ đồng thời nghiên cứu hiệu ứng sinh học β-glucan sau cắt mạch phương pháp chiếu xạ điều kiện in vitro in vivo động vật (gà chuột) nhằm tạo chế phẩm β-glucan có Mw thích hợp cho hiệu ứng sinh học cao phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức chế phẩm bổ sung chăn nuôi Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng thành cơng quy trình cơng nghệ chế tạo chế phẩm βglucan Mw thấp tan nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm men nhà máy sản xuất bia phương pháp chiếu xạ Các nội dung nghiên cứu luận án - Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia - Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 - Xác định hoạt tính sinh học β-glucan cắt mạch phương pháp chiếu xạ - Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan nước phương pháp chiếu xạ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan β-glucan Phần giới thiệu tổng quan đặc trưng cấu trúc nguồn thu nhận β-glucan 1.2 Sơ lƣợc nấm men Saccharomyces cerevisiae Phần tổng quan tế bào nấm men S cerevisiae cấu trúc thành tế bào, nhấn mạnh β-glucan 1.3 P ƣơng p áp t u n ận thành tế bào từ nấm men bia Phần trình bày phương pháp thông dụng sử dụng để phá vỡ tế bào nấm men Saccharomyces thu nhận thành tế bào 1.4 P ƣơng p áp tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bia Phần trình bày phương pháp phổ biến phá vỡ tế bào, chiết protein tinh chế để thu nhận β-glucan 1.5 Các p ƣơng p áp cắt mạch β-glucan Phần trình bày phương pháp thông dụng sử dụng để cắt mạch β-glucan 1.6 Hoạt tính sinh học β-glucan Trình bày đặc tính sinh học chế tác động β-glucan 1.7 Ứng dụng β-glucan Trình bày ứng dụng β-glucan lĩnh vực khác 1.8 Ứng dụng β-glucan Mw thấp Trình bày ứng dụng β-glucan Mw thấp tan nước lĩnh vực khác CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu - Bã men bia (nhà máy bia Sài Gòn Bình Dương), mẫu chuẩn β-glucan nấm men (Sigma, Mỹ), KIT xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan (Megazyme) hóa chất tinh khiết khác (Meck) - Gà Lương phượng (Gallus gallus domesticus) (Đại học Nơng Lâm Tp.HCM) chuột nhắt trắng dòng Swiss (Viện Pasteur Tp.HCM), kháng thể sơ cấp Anti-mouse IgG produced in goat thứ cấp Anti-goat IgG-Alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich, Mỹ) đĩa ELISA 96 giếng (Santa Cruz Biotechnology, Canada) 2.2 Nội dung p ƣơng p áp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia 2.2.1.1 Thu nhận thành tế bào nấm men Saccharomyces: Bã tế bào nấm men bia ly tâm 5000 vòng/phút, rửa tiến hành tự phân 20 50oC Ly tâm thu nhận phần không tan 2.2.1.2 Tách chiết β-glucan tổng số a Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ: Tiến hành 70, 90 100oC 400 g thành tế bào khuấy với 2000 mL NaOH 3%, đun ly tâm thu nhận phần rắn Phần rắn tiếp tục chiết lần với 2000 mL dung dịch HCl có nồng độ 2,45; 1,75 0,94 M 750C Ly tâm 7000 vòng/phút thu phần khơng tan, rửa lần với cồn tuyệt đối chiết lần với diethyl ether Sấy khơ tính sau: 𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝛽 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑎𝑛 𝑡ℎ𝑢 đượ𝑐 Hàm lượng β-glucan (%) = 𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝑡ℎà𝑛ℎ 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑛ấ𝑚 𝑚𝑒𝑛 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 x100 Mẫu β-glucan sau kiểm tra hàm lượng protein (theo phương pháp AOAC 987.04-1997) β-glucan (bằng kít K-YBGL) b Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH: Các bước tiến hành tương tự mục a nồng độ NaOH thay đổi 1, 2, 4% c Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết: Được tiến hành tương tự mục a sử dụng nồng độ NaOH tối ưu từ mục b thời gian chiết khảo sát 3, 4, 6, 12 d Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ mẫu/dung môi: Các bước tiến hành tương tự mục a thể tích dung dịch NaOH có nồng độ tối ưu (từ mục b) sử dụng 1200, 2000 2800 mL, với nhiệt độ thời gian phản ứng tối ưu xác định tương ứng mục a c 2.2.1.3 Đo phổ hồng ngoại: Mẫu β-glucan nghiền nhỏ, trộn với KBr ép tạo viên nén Tiến hành đo mẫu máy quang phổ hồng ngoại model FT/IR-4700 (Jasco, Nhật Bản) 2.2.2 Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ tia gamma 2.2.2.1 Chuẩn bị mẫu chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp tan nước: Hòa 100 g β-glucan 100 mL nước cất để tạo hỗn hợp huyền phù β-glucan 10% (w/v) Chiếu xạ liều khác nguồn xạ gamma Co-60 với xuất liều kGy/h 2.2.2.2 Xác định hiệu suất β-glucan tan nước sau chiếu xạ: Mẫu βglucan sau chiếu xạ ly tâm 11000 vòng/phút để thu dịch Tủa dịch với ethanol với tỷ lệ 1/9 (v/v), ly tâm thu tủa sấy khô Hàm lượng β-glucan tan nước tính theo cơng thức: KL 𝛽 − glucan tan Hàm lượng β-glucan tan nước (%) = KL 𝛽 − glucan sấy khô ban đầu x100 2.2.2.3 Đo phổ UV-vis β-glucan tan nước: Mẫu β-glucan đo máy quang phổ tử ngoại GENESY 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ) nồng độ 0,025% bước sóng từ 200-600 nm 2.2.2.4 Xác định khối lượng phân tử β-glucan: Mw mẫu βglucan 0,1% (20 µL) đo hệ máy GPC e2695 sử dụng cột Ultrahydrogel (Water, Mỹ) 40oC tốc độ bơm mL/phút 2.2.2.4 Đo phổ hồng ngoại: Thực mục 2.1.2.3 2.2.2.5 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H- 13C-NMR βglucan đo máy Utrashield 500 plus (Brucker, USA) tầng số 500 MHz 125 MHz sử dụng D2O (Cambridge, USA) với nồng độ mẫu mg/L 2.2.3 Xác định hoạt tính sinh học β-glucan cắt mạch phương pháp chiếu xạ 2.2.3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa in vitro: Cho 1,5 mL dung dịch β-glucan 100 ppm phản ứng với 1,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM Lắc để tối 30 phút Đo OD bước sóng 517 nm (mẫu chứng nước cất) Hoạt tính bắt gốc tự tính sau: H (%) = (1 – A/Ao) x 100 Trong đó: A OD mẫu thử, Ao OD mẫu đối chứng 517 nm 2.2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vivo chuột: Chuột chia thành hai nhóm (mỗi nhóm 45 gồm NT, NT lặp lại lần): Nhóm bình thường khơng tiêm CCl4 nhóm gây độc gan tiêm phúc mô lần CCl4 với liều 10 mL/kg thể trọng chuột (cho nhịn đói 15 trước tiêm cách ngày) Sau tiêm 60 phút, cho uống β-glucan (2 mg/con) liên tục tuần Chuột ĐC cho uống nước cất Sau ngày, lấy máu để định lượng AST ALT máy sinh hóa BioSystem A15 (Bỉ) 2.2.3.3 Khảo sát cơng thức máu miễn dịch chuột: Gồm NT, lặp lại lần Hàng ngày chuột cho uống 100 µL dung dịch β-glucan 2% (2 mg/con) Sau 28 ngày, lấy máu để xét nghiệm công thức máu (hồng cầu, bạch cầu tổng số (BCTS), bạch cầu trung tính (BCTT) lympho bào), IgG IgM 2.2.3.4 Khảo sát hoạt tính giảm lipid glucose máu a Tạo chuột béo phì thực nghiệm: Nhóm ni béo ăn thức ăn giàu chất béo (HFD-high fat diet) nhóm ăn thường cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (ND-normal diet) tuần, sau lấy máu xét nghiệm số glucose, cholesterol, triglycerid LDL b Khảo sát số sinh hóa mơ hình chuột béo phì thực nghiệm: Chuột béo phì cho chuột uống hàng ngày với 100 µL β-glucan 2% Đối chứng cho uống nước cất Theo dõi, lấy máu, kiểm tra số sinh hóa giai đoạn (Giai đoạn 1: Sau 20 cho uống β-glucan 20 ngày cho ăn giàu chất béo; Giai đoạn 2: Tiếp tục cho uống thêm β-glucan 20 ngày (sau 40 ngày); Giai đoạn 3: Ngừng cho chuột uống β-glucan 20 ngày (sau 60 ngày) Các số theo dõi: Cholesterol, triglycerid, LDL glucose máu 2.2.3.5 Khảo sát hiệu ứng tăng trưởng miễn dịch gà: Gồm NT, NT 18 lặp lại lần Gà cho ăn thức ăn có bổ sung 500 ppm β-glucan có Mw khác Các tiêu theo dõi gồm: Trọng lượng bình quân (TLBQ), mức tăng trọng tuyệt đối, hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR), tỷ lệ ni sống tích lũy, tiêu sinh hóa (BCTS/1 mm3, tỷ lệ bạch cầu lympho BCTT), hiệu giá kháng thể (HGKH) (kháng lại bệnh gumboro, bệnh viêm khí quản truyền nhiễm newcastle), chất lượng thịt (tỷ lệ móc hàm, tỷ lệ quầy thịt, tỷ lệ ức tỷ lệ đùi) 2.2.4 Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan nước khoảng liều 100 kGy 2.2.4.1 Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ pH khác nhau: Điều chỉnh pH hỗn hợp β-glucan 10% 3, 5, trước chiếu xạ mục 2.2.2.1 2.2.4.2 Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ điều kiện có H2O2: Được tiến hành mục 2.2.4.1 nồng độ hỗn hợp huyền phù β-glucan 5, 10 15% (w/v) 1% H2O2 2.2.4.3 Đo giản đồ nhiễu xạ tia X: Giản đồ nhiễu xạ tia X mẫu βglucan đo máy D8 Advance ECO (Bruker, Đức) sử dụng ống phát xạ CuKα (lq= 1.5406 Å, U= 40 kV, I= 25 mA) góc từ 30100o (2θ) với kích thước bước 0,05o (2θ) thời gian đếm 0,5/s 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Kết xử lý phần mềm Excel thống kê theo phần mềm SPSS 16.0 Dữ liệu phân tích cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai chiều (ANOVA) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia 3.1.1 Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy bia A B C D Hình 3.1 Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau rửa (C) ảnh SEM tế bào nấm men sau rửa (D) Bã nấm men sau thu nhận ly tâm 5000 vòng/phút để thu nhận tủa, rửa ly thu nhận phần tế bào mấm men (hình 3.1) 3.1.2 Tách thu nhận thành tế bào nấm men A B C Tế bào nấm men sau tự phân tâm thu phần khơng tan chủ yếu thành tế bào có màu trắng Hình 3.2 Sản phẩm thành tế bào nấm men trước (A) sau ly tâm (B) ảnh SEM (C) ngà (hình 3.2) 3.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết βglucan từ thành tế bào nấm men Saccharomyces 3.1.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Nhiệt độ (oC) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 70 17,11 ± 0,22 85,31 2,28 90 16,13 ± 0,11 90,89 1,41 100 14,28 ± 0,16 91,12 1,08 Kết bảng 3.1 cho thấy nhiệt độ tăng hiệu suất thu nhận sản phẩm β-glucan tách chiết giảm Ở 70oC hiệu suất thu sản phẩm β-glucan cao với 17,11% 100C hiệu suất sản phẩm thấp với 14,28% Tuy nhiên thấy nhiệt độ phản ứng cao hàm lượng protein lại sản phẩm thấp độ tinh khiết sản phẩm cao nhiệt độ chiết 90oC thích hợp 3.1.3.2 Ảnh hưởng nồng độ NaOH: Kết bảng 3.2 cho thấy hiệu suất sản phẩm β-glucan thu giảm tăng nồng độ NaOH, hiệu suất 17,55% tăng nồng độ NaOH lên 3% thấp (16,82%) sử dụng 4% NaOH Ngoài NT xử lý NaOH với nồng độ 2% hàm lượng protein cao (trên 2%) độ tinh khiết thấp (85,11%) Trong đó, NT xử lý NaOH với nồng độ 4%, hàm lượng protein thấp độ tinh khiết cao hiệu suất giảm mạnh Do để tách chiết β-glucan đạt hiệu suất cao, hàm lượng protein thấp độ tinh khiết sản phẩm cao NaOH 3% lựa chọn tối ưu Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan Nồng độ NaOH (%) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 18,68 ± 0,29 84,98 2,30 18,14 ± 0,14 85,11 2,00 17,55 ± 0,11 91,13 1,75 16,82 ± 0,22 91,99 1,73 3.1.3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết: Kết bảng 3.3 cho thấy, hiệu suất thu nhận β-glucan giảm dần theo thời gian phản ứng Khi chiết 3-12 hiệu suất tách chiết giảm 3%, NT 12 hiệu suất thu giảm đáng kể Ngồi ra, hàm lượng protein lại β-glucan tách chiết thời gian từ 3-12 2% độ tinh khiết sản phẩm xử lý 9-12 cao Kết cho thấy thời gian chiết hiệu Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Thời gian chiết (giờ) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 17,97 ± 0,30 84,96 1,93 17,12 ± 0,30 86,15 1,49 16,13 ± 0,11 91,52 1,41 12 14,97 ± 0,10 92,08 1,34 3.1.3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ mẫu/dung môi: Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất β-glucan giảm tỉ lệ chiết tăng Hàm lượng β-glucan thu xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/3 cao so với tỉ lệ 1/5 1/7 Ở NT xử lý với tỉ lệ 1/7, hàm lượng β-glucan thu tương đương với NT xử lý với Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Tỉ lệ mẫu/dung môi (g/mL) Tỷ lệ β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) HL protein (%) 1/3 17,42 ± 0,14 85,19 1,90 1/5 16,13 ± 0,11 92,01 1,41 1/7 16,15 ± 0,08 92,98 1,34 13 thị cho nguyên tử C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 C-6 quan sát 102,55; 72,32; 84,12; 68,14; 75,56 Hình 3.12 Phổ NMR- 1H (a) 13C (b) β-glucan tan nước có Mw~25 kDa 60,73 ppm Kết cho thấy thành phần mẫu βglucan 3.2.6 P ân t lƣợng β-glucan Bảng 3.8 Hàm lượng loại glucan mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa Loại glucan Glucan tổng số α-glucan β-glucan Hà lƣợng mẫu (%) Trƣớc chiếu xạ Sau chiếu xạ 93,34 ± 0,41 97,88 ± 0,89 1,56 ± 0,07 0,91 ± 0,36 91,78 ± 0,34 96,97 ± 0,25 Kết bảng 3.8 cho thấy, so với mẫu khơng chiếu xạ hàm lượng glucan tổng số sau chiếu xạ tăng nhẹ (lên ~97,88%) 3.3 Hoạt tính sinh học β-glucan tan nƣớc chế tạo p ƣơng pháp chiếu xạ Hoạt tính kháng oxy hố, % 3.3.1 Hoạt tính kháng oxi hóa β-glucan chiếu xạ điều kiện in vitro 70 Kết hình 3.13 cho thấy hoạt tính 60 kháng oxi hóa β-glucan tăng Mw 50 β-glucan giảm Ở nồng độ 100 40 30 ppm, hoạt tính kháng bắt gốc tự DPPH 20 mẫu β-glucan có Mw > 64, 48, 25 10 11 kDa đạt 5,2; 47,6; 58,2 0 10 20 30 40 50 60 70 60,7% Mẫu β-glucan không chiếu xạ (Mw Mw, kDa > 64 kDa) có hoạt tính kháng oxy hóa thấp Hình 3.13 Hoạt tính kháng oxi β-glucan có Mw khác 9-12 lần so với β-glucan cắt mạch xạ 3.3.2 Khả bảo vệ gan β-glucan chiếu xạ điều kiện in vivo 14 3.3.2.1 Ảnh hưởng β-glucan chiếu xạ lên số men gan AST chuột gây tổn thương gan: 200 (a) Chuột thường ĐC 160 120 80 40 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 >64 Mw, kDa 48 25 11 Mức thay đổi SVĐC, % Chỉ số AST, U/L Chuột gây độc gan -20 -40 -60 Chuột thường Chuột gây độc gan (b) -80 Hình 3.14 Chỉ số AST nghiệm thức (a) mức thay đổi số SVĐC (b) nhóm chuột thường (khơng tiêm CCl4) chuột gây độc gan cho uống β-glucan có Mw khác Hình 3.14a cho thấy số AST máu chuột nghiệm thức không gây độc 58,47-84,24 U/L Chỉ số AST máu chuột cho uống β-glucan chiếu xạ có khác biệt có ý nghĩa Chuột cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 11 kDa có số AST giảm mạnh (hình 3.14b) β-glucan tan nước có Mw~25 có tác dụng làm giảm số AST máu chuột thấp với 61,81 U/L (tương đương nhóm ĐC không gây độc gan) 3.3.2.2 Ảnh hưởng β-glucan chiếu xạ lên số men gan ALT chuột gây tổn thương gan: Kết hình 3.15a cho thấy β-glucan chiếu xạ làm hạ số ALT nhóm cho uống β-glucan có Mw~25 kDa có số thấp Ở nhóm gây độc gan, kết từ hình 3.15b cho thấy số ALT có xu hướng giảm tỷ lệ thuận với Mw β-glucan NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 11 kDa có số ALT thấp tương đương với nhóm chuột ĐC khơng gây độc gan 130 Chuột thường ĐC 90 70 50 30 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 >64 Mw, kDa 48 25 11 Chuột gây độc gan Mức thay đổi SVĐC, % Chỉ số ALT, U/L (a) 110 -10 -20 -30 -40 -50 Chuột thường Chuột gây độc gan (b) -60 Hình 3.15 Chỉ số AST nghiệm thức (a) mức thay đổi số SVĐC (b) nhóm chuột thường (không tiêm CCl4) chuột gây độc gan cho uống β-glucan có Mw khác 3.3.3 Ảnh hưởng β-glucan chiếu xạ đến số miễn dịch chuột 15 3.3.3.1 Công thức máu tế bào miễn dịch: Bảng 3.9 Số lượng hồng cầu, bạch cầu tổng số, lympho bào bạch cầu trung tính máu chuột cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác Mw β-glucan Hồng cầu (106 tế BCTS 103 tế bào Lympho bào (%) BCTT (%) (kDa) bào/mm3) /mm3) b ĐC 5,44±0,22 4,95 ±0,18 57,23b±2,18 10,08b±1,04 > 64 5,46±0,12 5,05ab±0,13 59,92ab±1,91 14,70a±0,52 48 5,64±0,24 5,20ab±0,12 62,55ab±0,98 15,73a±1,43 25 5,6±0,28 5,50a±0,15 65,97a±1,84 16,37a±0,66 11 5,48±0,28 5,40b±0,16 64,42a±2,86 15,22a±0,67 ns    Trong cột với chữ khác khác biệt có ý nghĩa thống kê : P64 48 Mw, kDa 25 11 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 Hình 3.16 Hàm lượng IgG (a) IgM (b) trong máu chuột cho uống bổ sung β-glucan 3.3.4 Khả hạ mỡ máu đường huyết β-glucan chiếu xạ điều kiện in vivo chuột 3.3.4.1 Tạo mơ hình chuột béo phì thực nghiệm Bảng 3.10 Thể trọng nhóm chuột sau tuần ni theo chế độ dinh dưỡng khác Tuần (g/con) Tuần (g/con) Mức tăng trọng lượng (%) Mức tăng nhóm HFD (%) Nhóm ND Nhóm HFD 19,45 ± 0,28 19,54 ± 0,23 32,53 ± 0,95 48,87 ± 0,71 ↑ 67,23 ↑ 150,15 ↑ 124,24 Bảng 3.11 Một số số sinh hóa chuột sau tuần ni Chỉ số Cholesterol tồn phần (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Nhóm ND 78,79±4,21 71,85±3,04 20,28±1,32 Nhóm HFD 145,04±6,21 121,78±6,27 31,73±2,69 Mứ tăng nhóm HFD (%) ↑ 84,08 ↑ 69,48 ↑ 56,49 16 Glucose (mg/dL) 102,79±8,86 165,46±7,39 ↑ 60,97 Kết từ bảng 3.10 hình 3.17 cho thấy nhóm chuột HFD có trọng lượng tăng 29,33 g/con (150,15%) lớn chuột nuôi thường 16,34 g/con (tăng 124,24%) Kết xác định tiêu lipid máu cholesterol tổng số, triglyceride, LDL glucose máu chuột bảng 3.11 cho thấy lơ chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao có số lipid máu cao hẳn lơ chuột ăn thức ăn bình thường Hình 3.17 Nhóm chuột HFD (A) Cụ thể nồng độ cholesterol máu tăng84,1%, ND (B) sau tuần nuôi triglyceride máu tăng 69,5%, LDL tăng 56,5% glucose máu tăng 61% 3.3.4.2 Ảnh hưởng β-glucan chiếu xạ lên thể trọng số lipid glucose: Kết bảng 3.12 cho thấy sau 20 ngày thử nghiệm Bảng 3.12 Trọng lượng chuột trước sau 20 ngày cho uống β-glucan có Mw khác Mw β-glucan (kDa) Trƣớc thử nghiệm (g/con) Sau 20 ngày (g/con) Mứ t ay đổi (%) ĐC1 33,41 ± 0,71 34,84a ± 0,77 ↑ 4,35a c ĐC2 45,12 ± 1,43 51,73 ± 1,03 ↑ 15,17b > 64 44,51 ± 1,01 47,51b ± 1,34 ↑ 6,72a b 48 44,85 ± 1,07 47,48 ± 0,7 ↑ 6,14a 25 45,10 ± 0,78 47,16b ± 1,06 ↑ 4,53a 11 44,71 ± 1,21 46,51b ± 1,02 ↑ 4,22a ns   β-glucan chiếu xạ cho ăn theo chế độ béo khối lượng chuột tất nghiệm thức tăng so với ban đầu Tuy nhiên mức thay đổi trọng lượng chuột nghiệm thức uống β-glucan thấp nhiều so với NT ĐC2 (chuột béo phì) Kết bảng 3.13 cho thấy số mỡ máu nhóm chuột ĐC2 tăng đáng kể cholesterol lên đến 198,15 mg/dL, nhóm chuột cho uống β-glucan Bảng 3.13 Các số lipid glucose máu chuột sau 20 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác Sau 20 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) ĐC1 89,18a ± 5,44 85,27a±3,86 23,85ab±1,55 126,01b±6,92 d b c ĐC2 198,15 ±5,46 164,82 ±6,32 38,53 ±2,80 212,31c±6,44 > 64 129,05c±2,96 90,16a±4,00 28,9b±2,82 139,74b±4,56 17 103,64b±4,01 79,62a±4,95 20,68a±2,06 124,72b±7,19 89,79a±3,54 83,10a±4,80 18,9a±1,69 106,8a ± 2,17 109,28b±4,29 88,68a ± 4,40 26,35ab±3,23 127,66b±6,63     ĐC1: Chuột thường khơng cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì khơng cho uống β-glucan 48 25 11 89,79-129,05 mg/dL Chuột NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa cho số cholesterol thấp gần so với chuột Bảng 3.14 Các số lipid glucose máu chuột sau 40 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác Sau 40 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) ĐC1 88,14ab ± 5,62 86,67b ± 4,10 ĐC2 > 64 48 25 11 d c 210,74 ± 9,05 119,54c ± 4,55 91,5ab ± 3,26 75,97a ± 2,36 96,08b ± 6,28  190,41 ±10,79 78,85ab ± 4,12 69,53a ± 1,77 62,58a ± 3,15 77,77ab ± 3,01  22,76b ± 1,62 c 38,48 ± 1,14 22,06b ± 1,56 19,09ab ± 1,23 17,25a ± 0,79 21,31ab ± 1,63  127,28c ± 7,77 239,74d±13,02 134,11c ± 6,03 97,98ab ± 2,42 86,13a ± 2,94 114,25bc ± 3,43  Mức thay đổi số cholesterol, % thường Kết hình 3.18 bảng 3.14 cho thấy NT sử dụng βglucan có Mw~25 kDa cho kết giảm 45 20 ngày 40 ngày 60 ngày cholesterol tốt sau 40 ngày thử 25 nghiệm ngang với số cholesterol chuột thường.ước có -15 Mw~25 kDa cho số cholesterol thấp gần so với chuột -35 thường Kết hình 3.18 bảng -55 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 Mw, kDa 3.14 cho thấy NT sử dụng βHình 3.18 Mức thay đổi số cholesterol glucan có Mw~25 kDa cho kết máu chuột so với trước cho uống bổ giảm cholesterol tốt sau 40 sung β-glucan có Mw khác ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột ngày thử nghiệm ngang với số béo phì khơng cho uống β-glucan cholesterol chuột thường Bảng 3.15 Các số lipid glucose máu chuột sau 60 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác Sau 60 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) a ĐC1 93,83 ± 3,87 98,61b ± 2,94 24,55b ± 2,49 135,24b ± 3,04 c c c ĐC2 212,92 ± 7,71 195,43 ± 8,66 41,38 ± 1,03 245,39c ± 9,07 > 64 122,79b ± 3,80 82,79a ± 2,91 24,04ab ± 2,61 137,54b ± 3,68 48 99,78a ± 3,53 77,73a ± 3,74 19,76ab ± 1,46 110,81a ± 4,12 18 25 11 89,67a ± 3,18 103,95a±5,14  70,59a ± 3,17 79,52a ± 3,96  18,85a ± 0,92 21,82ab ± 1,16  105,90a ± 2,71 119,81a ± 3,01  Mức thay đổi số LDL, % Mức thay đổi số triglyceride, % Sau 20 ngày tiếp theo, ngừng cho uống β-glucan (chỉ cho uống nước cất) kết từ hình 3.18 bảng 3.15 cho thấy sau 60 ngày, NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa cho hiệu tốt nhất, cholesterol 89,67 mg/dL Bảng 3.13 hình 3.19 cho thấy, sau 20 ngày, số triglyceride NT cho uống β- glucan giảm 25,2733,14%, nghiệm thức ĐC uống nước cất tăng18,62% lô chuột thường 35,84% lơ chuột béo phì Sau 40 ngày, số triglyceride giảm đáng kể Chuột uống nước cất, số cholesterol cao lần so với NT cho uống β- glucan Sau 60 ngày, số triglyceride 70,59-82,79 mg/dL NT thử nghiệm với β-glucan Qua cho thấy dù ngưng cho uống β-glucan hiệu hạ triglyceride trì Trong giai đoạn thử nghiệm, số triglyceride giảm nhiều NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa Đối với số LDL, sau 20 ngày, NT cho uống β-glucan có Mw~48 25 kDa cho khả giảm số LDL tốt Chỉ số 20 ngày 40 ngày 60 ngày 60 LDL NT thử nghiệm với glucan 40 18,9-28,9 md/dL, NT 20 ĐC2 số tăng tới 38,53 mg/dL -20 Sau 40 ngày, số LDL NT -40 cho uống β-glucan tiếp tục giảm gần -60 so với chuột thường Khi ngừng ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 Mw, kDa cho uống β-glucan 20 ngày Hình 3.19 Mức thay đổi số triglyceride kết thu hiệu máu chuột so với trước cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác (bảng 3.15) Mức giảm LDL tốt 40 20 ngày 40 ngày 60 ngày quan sát nghiệm thức cho 20 uống β-glucan với Mw~48 25 kDa (hình 3.20) Kết bảng 3.13 hình 3.21 nhóm cho -20 uống bổ sung β-glucan, nồng độ -40 glucose máu chuột giảm15,62-60 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 34,12% so với trước thử nghiệm Mw, kDa Trong đó, NT sử dụng β-glucan tan Hình 3.20 Mức thay đổi số LDL 19 Mức thay đổi số glucose, % máu chuột so với trước cho uống bổ nước có Mw~25 kDa cho khả sung β-glucan có Mw khác giảm số glucose máu cao 80 20 ngày 40 ngày 60 ngày (34,12%) không khác biệt so với 60 NT sử dụng β-glucan có Mw~11 48 40 20 kDa Sau 40 ngày sau thử nghiệm, số tiếp tục giảm lô cho uống -20 β-glucan, NT ĐC2, số -40 tăng cao đạt 239,74 mg/dL Ở giai đoạn -60 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 60 ngày sau thử nghiệm, số glucose Mw, kDa tăng nhẹ so với 40 ngày đạt 105,9 - Hình 3.21 Mức thay đổi số glucose máu chuột so với trước cho uống bổ sung β137,54 mg/dL nghiệm thức cho glucan có Mw khác uống β-glucan có Mw khác 3.3.5 Hiệu ứng β-glucan chiếu xạ lên tăng trưởng miễn dịch gà Lương phượng Bảng 3.16 cho thấy TLBQ lơ có bổ sung β-glucan tan nước có Mw~11-25 kDa đạt cao (1260 & 1256 g/con) lô ĐC thấp với 1013 g/con Mức tăng trọng tuyệt đối gà ni có bổ sung βglucan tan nước có Mw~11-25 kDa đạt cao Lượng thức ăn tiêu thụ hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) lô bổ sung β-glucan tan nước có Mw~25 kDa thấp chất lượng thịt lại đạt cao (hình 3.22) Bảng 3.16 Ảnh hưởng β-glucan có Mw khác lên tăng trọng chất lượng thịt gà sau tuần cho ăn bổ sung Chỉ số ĐC > 64 kDa 49 kDa 25 kDa 11 kDa Tỷ lệ sống (%) 61,1b ± 3,2 66,7b±6,4 72,2b ± 5,5 94,4a ± 5,6 94,4a ± 5,6  Mức tăng trọng tuyệt đối 16,3d±0,5 17,8cd±0,3 18,8bc±0,2 20,6ab±0,7 20,7± 0,9  Lượng thức ăn sử dụng 491,1a±5,4 508,3a±1,7 480,4ab±9,2 453,3b±4,4 479ab±15,7  FCR (kg thức ăn/kg tăng trọng) 4,8b±0,7 3,8ab±0,4 3,7ab±0,2 3,1a±0,2 3,4a±0,2  Thể trọng (g/con) 1012,7d±10,3 1096c±6,7 1152,3b±17,1 1255,7a±5,7 1259,7a±21,1  Trong hàng, chữ khác khác biệt có ý nghĩa thống kê với P 64 kDa 49 kDa 25 kDa 11 kDa BCTS (103/mm3) 29,3 ± 0,3 30,4 ± 0,1 30,4 ± 0,5 30,9 ± 0,3 31,1 ± 0,5 BCTT (%) 62,3 ± 1,2 61,0 ± 1,2 63,0 ± 1,2 63,7 ± 63 ± 1,2 Lymphocyte (%) 25 ± 1,2 28,7 ± 25,3 ± 30,7 ± 3,7 29,7 ± 2,2 HGKT Gumboro (Unit) 7980±12 13366±14 11903±35 14770±35 5613±22 HGKT viêm khí quản 131,5±33,6 151,7±33,3 175,8±56,5 181,9 ± 7,3 156 ± 47,9 truyền nhiễm (Unit) HGKT Newcastle (Unit) 13,3 ± 2,7 21,3 ± 5,3 21,3 ± 5,3 26,7 ± 5,3 21,3 ± 5,3 20 Tỷ lệ ni sống tích lũy lô ĐC thấp với 61,1%, cao lơ bổ sung β-glucan chiếu xạ có Mw ≤ 25 kDa với 94,4% Kết bảng 3.17 cho thấy số lượng BCTS gà cho ăn bổ sung β-glucan tan nước có Mw≤25 kDa 30,931,1x103/mm3, lơ ĐC 29,3x103/mm3 Ngồi lơ có bổ sung β-glucan có Mw~25 kDa cho giá trị cao tỷ lệ lympho bào (30,7%) hiệu giá kháng thể Hình 3.22 Ảnh hưởng β-glucan có Mw khác đến quầy thịt gà (HGKT) bệnh gumboro, bệnh viêm khí quản truyền nhiễm bệnh newcastle 10 80 60 Độ tan, % Độ trương nước bảo hồ, g/g 3.4 Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan nƣớc khoảng liều xạ thấp Từ kết thử nghiệm nêu chuột gà cho thấy cho chế phẩm β-glucan tan nước có Mw~25 kDa thể hoạt tính sinh học cao in vitro in vivo Để chế tạo β-glucan tan nước có Mw~25 kDa từ mẫu β-glucan khơng tan nước tách chiết có pH thấp (~3) liều xạ cần thiết để tạo chế phẩm cao (200 kGy) cần phải giảm liều cho hiệu 3.4.1 Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ điều kiện pH khác 40 20 3 pH 10 pH 10 Hình 3.23 Độ trương nước bảo hòa độ tan mẫu β-glucan điều kiện pH khác Kết từ hình 3.23 cho thấy, β-glucan thu hồn tồn khơng tan nước pH~3 có độ trương thấp tan nhẹ độ trương tăng 21 70 100 pH ~ pH ~ pH ~ pH ~ Hàm lượng β-glucan tan , % 50 Mw, kDa pH ~ 90 60 40 30 20 10 pH ~ pH ~ pH ~ 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50 100 150 200 250 300 Liều xạ, kGy Hình 3.24 Sự suy giảm Mw β-glucan liều xạ điều kiện pH khác 50 100 150 200 Liều xạ, kGy 250 300 Hình 3.25 Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10% điều kiện pH khác pH tăng Hình 3.24 cho thấy pH~3 để có 25,9 - 66,7% lượng β-glucan tan nước cần chiếu xạ từ 100 - 300 kGy Khi gia tăng pH lên hàm lượng βglucan tan tăng đáng kể pH~9 hiệu suất tạo β-glucan tan tăng mạnh đạt 70% với liều 40 kGy Kết nhận từ hình 3.25 cho Hình 3.26 Phổ IR β-glucan tan nước có điều kiện pH khác thấy chiếu xạ mẫu điều kiện pH Mw~25 kDa chiếu xạnhau cao suy giảm Mw mẫu βglucan nhanh pH~9 suy giảm Mw tốt (Mw~25 kDa với liều 40 kGy) Hình 3.26 cho thấy khơng có thay đổi đỉnh đặc trưng phổ đo từ mẫu sau chiếu xạ pH khác 3.4.2 Cắt mạch β-glucan phương pháp chiếu xạ điều kiện hiệu chỉnh pH có H2O2 Kết hình 3.27 cho thấy chiếu xạ mẫu β-glucan có nồng độ khác điều kiện pH~9 kết hợp xử lý 1% H2O2 hàm lượng β-glucan tan nước tăng lên theo liều xạ Điều có lẽ ứng cộng hợp tạo q trình chiếu xạ Có thể thấy từ hình 3.28 để thu mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa cần chiếu xạ liều 10 kGy với mẫu β-glucan 5% 1% H2O2 Kết phân tích phổ FTIR (hình 3.29) giản đồ XRD (hình 3.30) cho thấy mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa thu chiếu xạ 10 kGy hỗn hợp 5% β-glucan 22 pH~9 1% H2O2 không khác biệt so với mẫu không chiếu xạ chiếu xạ điều kiện khác 100 70 5% 10% 15% 60 80 50 70 Mw, kDa Hàm lượng β-glucan tan, % 90 60 50 40 30 40 30 20 20 5% 10 10% 10 15% 0 20 40 60 Liều xạ, kGy 80 100 Hình 3.27 Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ khác điều kiện pH~9 1% H2O2 20 40 60 Liều xạ, kGy 80 100 Hình 3.28 Sự suy giảm Mw β-glucan chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ khác điều kiện pH~9 1% H2O2 Hình 3.29 Phổ IR β-glucan tan nước có Hình 3.30 Giản đồ XRD β-glucan tan nước Mw~25 kDa chiếu xạ điều kiện pH khác có Mw~25 kDa chiếu xạ điều kiện pH khác kết hợp xử lý H2O2 kết hợp xử lý H2O2 23 β-glucan dạng bột Ngâm trương dung dịch H2O2 1% để tạo hỗn hợp βglucan 5% (w/v) điều chỉnh pH~9 NaOH β-glucan dạng dịch huyền phù 5% Cho vào chai thủy tinh chiếu xạ nguồn Gamma Co-60 liều xạ 10 kGy Dung dịch β-glucan cắt mạch xạ Ly tâm với tốc độ 11000 vòng/phút 20 phút thu nhận phần dung dịch nổi, điều chỉnh pH~7 HCl Dung dịch β-glucan tan có Mw thấp tan nƣớc Tủa ethanol với tỷ lệ 9V ethanol/1V dịch nổi, ly tâm với tốc độ 11000 vòng/phút 20 phút, thu nhận tủa, rửa tủa lần với ethanol 90o, sấy khơ 60oC, nghiền nhỏ Chế phẩm β-glucan có Mw thấp tan nƣớc có Mw~25 kDa Hình 3.31 Sơ đồ khối quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan nước phương pháp chiếu xạ điều kiện hiệu chỉnh pH có H2O2 quy mơ lít/mẻ Quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan nước với Mw~25 kDa có hoạt tính sinh học cao phương pháp chiếu xạ điều kiện hiệu chỉnh pH có H2O2 thiết lập hình 3.31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nhận được, số kết luận rút sau: - Đã xây hồn thiện quy trình chế tạo β-glucan từ thành tế bào nấm men từ bã thải nấm men bia quy mơ 500 lít/mẻ - Sản phẩm -glucan chế tạo có hàm lượng  -glucan cao (~91,8%), khơng tan nước, có khối lượng phân tử Mw lớn 64 kDa Đặc trưng phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) phổ hồng ngoại (FTIR) sản phẩm  -glucan chế tạo không khác biệt so với mẫu chuẩn dạng hãng Sigma 24 - Bức xạ gamma Co-60 phương pháp hiệu để cắt mạch tạo βglucan có Mw thấp tan nước Việc gia tăng độ pH (pH kiềm) hỗn hợp  -glucan không tan trước chiếu xạ làm gia tăng đáng kể hàm lượng  -glucan tan nước Phương pháp chiếu xạ hỗn hợp -glucan không tan hiệu chỉnh pH, hiệu chỉnh pH bổ sung H2O2 trước chiếu xạ hàm lương  -glucan tan nước khác biệt không đáng kể, bổ sung H2O2 làm giảm khối lượng phân tử  -glucan tan nước liều xạ xử lý, đặc biệt khoảng liều xạ thấp 50 kGy - Kết phân tích phổ FTIR, giản đồ XRD cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy mẫu β-glucan tan nước có Mw < 50 kDa Mw chế tạo phương pháp chiếu xạ điều kiện pH khác có kết hợp xử lý H2O2 nồng độ 1% có đặc trưng cấu khơng khác biệt so với mẫu β-glucan trước chiếu xạ, ngoại trừ khối lượng phân tử - β-glucan chiếu xạ có Mw thấp tan nước có khả bắt gốc tự DPPH cao β-glucan có Mw thấp khả bắt gốc tự cao - Sản phẩm β-glucan chiếu xạ có khả bảo vệ gan chuột gây độc gan CCl4 Chỉ số AST ALT máu chuột cho uống chế phẩm có xu hướng giảm dần Mw β-glucan giảm Chuột cho uống β-glucan chiếu xạ có Mw~25 kDa giảm 68% số AST 48% ALT chuột gây độc gan - Chế phẩm có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính lympho bào yếu tố miễn dịch dịch thể IgG IgM - β-glucan tan nước có Mw~25 kDa thích hợp cho mục đích làm giảm mỡ máu với khả giảm 38% cholesterol, 33% triglyceride, 39% LDL 34% glucose sau thử nghiệm 20 ngày Các số tiếp tục giảm kéo dài trình thử nghiệm 40 ngày Khả giảm mỡ máu đường huyết β-glucan tốt kể ngừng cho uống chế phẩm 20 ngày với mức giảm 38% cholesterol, 41% triglyceride, 40% lượng LDL 36% glucose máu chuột 25 - Chế phẩm β-glucan chiếu xạ cho ăn bổ sung có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ ni sống hoạt tính miễn dịch gà So với đối chứng, β-glucan tan nước có Mw~25 kDa có hiệu ứng tối ưu mức độ tăng trọng bình quân (tăng 23,63%); tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) gia tăng chất lượng quầy thịt, bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính lympho bào; tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, viêm khí quản truyền nhiễm newcastle Chế phẩm βglucan Mw thấp tan nước (Mw~25 kDa) có nguồn gốc tự nhiên chế tạo phương pháp chiếu xạ hứa hẹn hoạt chất bổ sung tốt, hiệu quả, an toàn đáp ứng nhu cầu nuôi gà không sử dụng kháng sinh - Đã xây dựng thành cơng quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan nước với Mw~25 kDa có hoạt tính sinh học cao phương pháp chiếu xạ hỗn hợp  -glucan không tan nước kết hợp với hiệu chỉnh pH kiềm bổ sung H2O2 trước chiếu xạ Chế phẩm có triển vọng ứng dụng cao cho mục đích làm thực phẩm chức tăng cường miễn dịch hỗ trợ điều trị bệnh mỡ máu, chống oxi hóa giải độc gan Đề nghị - Nghiên cứu khả giải độc gan β-glucan chiếu xạ đối tượng ngộ độc gan mãn tính Đồng thời, đánh giá thêm khả bảo vệ gan chế phẩm dựa xét nghiệm tiêu men gan khác quan sát hình thái học mơ gan - Nghiên cứu hoạt tính sinh học khác hoạt tính chống ung thư, điều trị bệnh tiểu đường, v.v β-glucan chiếu xạ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài thực theo hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ cao để tạo sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có độ tinh khiết có hoạt tính sinh học cao Luận án cơng trình nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 để cắt mạch β-glucan tạo chế phẩm β-glucan tan nước có Mw thấp khảo sát hoạt tính sinh học chúng động vật thí nghiệm (gà chuột) Những đóng góp đề tài: 26 - Đã hồn thiện quy trình tách chiết thành cơng β-glucan có độ tinh khiết cao (đạt khoảng 91,8%) từ thành tế bào nấm men bã men bia Đây quy trình xây dựng nước tạo sản phẩm có đặc trưng cấu trúc không khác biệt so với mẫu chuẩn dạng hãng Sigma - Đã xây dựng thành cơng quy trình chế tạo β-glucan tan nước có Mw~25 kDa có hoạt tính sinh học cao phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 mẫu β-glucan nấm men khơng tan nước Đây quy trình xây dựng giới - β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chế tạo phương pháp chiếu xạ có hoạt tính kháng oxi hố cao nhiều so với β-glucan không chiếu xạ - β-glucan chiếu xạ có khả bảo vệ gan chuột gây độc gan CCl4 chuột cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa giảm 68% số AST 48% ALT so với chuột gây độc gan cho uống nước cất - Chế phẩm làm giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 33% triglyceride, 39% lượng LDL 34% lượng glucose máu chuột béo phì sau 20 ngày uống - β-glucan chiếu xạ có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính lympho bào yếu tố miễn dịch IgG IgM - Ở gà, chế phẩm β-glucan tan nước có Mw~25 kDa làm tăng trọng bình quân (tăng 23,63%), tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) chất lượng quầy thịt; tăng số lượng bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính lympho bào; tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, bệnh viêm khí quản truyền nhiễm bệnh newcastle DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyen Thanh Long, Le Quang Luan Study on the immuno stimulation of radiation degraded β-glucan in swiss mice Nuclear Science and Technology, 5(4), 9-15, 2015 Nguyễn Thành Long, Dương Hoa Xô, Lê Quang Luân Nghiên cứu tác động β-glucan cắt mạch phương pháp xạ lên số tăng trọng sinh hóa máu chuột nhắt Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 14(3), 419-426, 2016 Nguyễn Thành Long, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, Lê Quang Luân Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt β-glucan xử lý cắt mạch tia gamma Co60 Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 15(3A), 47-53, 2017 Nguyen Thanh Long, Tran Le Truc Ha, Hoang Nghia Son, Le Quang Luan Radiation degradation of β-glucan extrated from brewer’s yeast for enhancing growth promoter and immumostimulant activities on broilers International Journal of Polymer Science 2019, pages, 2019 (IF: 1,89, SCIE, Q2, doi.org/10.1155/2019/8901824) Nguyen Thanh Long, Nguyen Thị Ngọc Anh, Hoang Nghia Son, Le Quang Luan Radiation degradation of β-glucan with a potential for reduction of lipids and glucose in the blood of mice Polymers, 11, 955, 2019 (IF: 3.16, SCIE, Q1, doi:10.3390/polym11060955) ... b thải nấm men bia để tách tạo β -glucan làm nguyên liệu để chế tạo chế phẩm β -glucan Mw thấp tan nước có hoạt tính sinh học cao hiệu thiết thực nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo sản phẩm có. .. trình chế tạo β -glucan từ thành tế b o nấm men từ b thải nấm men bia quy mơ 500 lít/mẻ - Sản phẩm  -glucan chế tạo có hàm lượng  -glucan cao (~91,8%), khơng tan nước, có khối lượng phân tử Mw... Trình b y đặc tính sinh học chế tác động β -glucan 1.7 Ứng dụng β -glucan Trình b y ứng dụng β -glucan lĩnh vực khác 1.8 Ứng dụng β -glucan Mw thấp Trình b y ứng dụng β -glucan Mw thấp tan nước lĩnh