ghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Các Elicitor, Hệ Thống Led Cải Tiến, Môi Trường Hai Lớp Đến Quá Trình Nhân Giống, Tạo Củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MƠI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN Q TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực MSSV: 1411100609 : Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 14DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hệ thống LED lên q trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Trịnh Thị Lan Anh Những số liệu kết nghiên cứu đề tài trung thực chưa công bố hình thức khơng trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn thơng tin trích dẫn đề tài ghi rõ nguồn gốc Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Ngân ii LỜI CẢM ƠN Warren Buffett nói rằng: “Nếu muốn nhanh mình, muốn xa nhau” Câu nói thật khơng sai, suốt q trình hồn thành đề tài mình, em quan tâm chăm sóc dạy dỗ từ Cơ TS Trịnh Thị Lan Anh Em xin chân thành trân trọng cảm ơn ân cần dạy bảo yêu thương mà cô dành cho em, hệ sinh viên Cảm ơn khơng người giảng viên đầy tâm huyết cho em hành trang kiến thức vững vàng để vững bước đường nghiên cứu khoa học, mà yêu thương em người thân gia đình, quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn với tuổi đôi mươi giảng đường đại học Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cơ, Anh Chị nhân viên phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện hỗ trợ cho em suốt q trình hồn thành đề tài Có người nói: “Đời cho ta bao lần đôi mươi” Tuổi đôi mươi lứa tuổi đẹp người Tuổi đôi mươi em thật đẹp sinh viên ngành Công nghệ sinh học Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ HUTECH Trong suốt trình học tập rèn luyện giảng đường đại học dạy tận tình hỗ trợ nhiệt tình từ thầy cơ, em học tập cháy với lứa tuổi đơi mươi trog hoạt động Viện, Trường Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo em Hải hỗ trợ tận tình giúp đỡ em người thân gia đình Và để có thành cơng ngày hơm nay, có em ngày hơm khơng thể khơng nhắc đến tình u thương ủng hộ từ phía gia đình Gia đình hậu phương vững cho vượt qua khó khăn, thử thách sống tiếp thêm nghị lực cho Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ Cậu dạy dỗ, dìu dắt từ chập chững bước lớn khôn thành người, cho điều tốt Công ơn trời biển tình u thương vơ bờ bến gia đình quà lớn quý giá mà nhận Con xin biết ơn gia đình bên cạnh, ủng hộ động viên bước đường mà chọn iii Vì kiến thức thân hạn chế, q trình thực tập, hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ q thầy TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Ngân iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Tầm quan trọng đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Lý chọn đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Tình hình nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Giới thiệu vi nhân giống elicitor 10 1.1.1 Khái niệm vi nhân giống 10 1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor 10 1.1.2.1 Than hoạt tính 11 1.1.2.2 Saccharose 12 1.1.2.3 Bạc nitrate 13 1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc 13 1.1.4 Vai trò ánh sáng vi nhân giống 15 1.1.4.1 Vai trò ánh sáng trình quang hợp thực vật 15 v 1.1.4.2 Vai trò ánh sáng trình sinh trưởng phát triển thực vật 16 1.1.4.3 Vai trò ánh sáng nhân giống in vitro 18 1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng nuôi cấy in vitro 19 1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode) 22 1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED 22 1.1.5.2 Ưu, nhược điểm đèn LED 23 1.1.5.3 Một số thành tựu giới Việt Nam sử dụng nguồn sáng LED nuôi cấy in vitro 24 1.1.5.4 Hướng phát triển ứng dụng đèn LED nuôi cấy in vitro Việt Nam 27 1.1.6 Ánh sáng thực vật 28 1.1.6.1 Vai trò số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật 28 1.1.6.2 Vai trò ánh sáng đến q trình tích lũy chất hữu thực vật 30 1.2 Phương pháp định tính định lượng saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 33 1.2.1 Định tính saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lớp mỏng 33 1.2.2 Định lượng saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu cao 34 1.3 Sơ lược Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.1 Giới thiệu sơ lược Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.2 Đặc điểm hình thái 38 1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng phát triển 39 1.3.4 Đặc điểm phân bố 40 1.3.5 Nhân giống Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 40 1.3.5.1 Nhân giống từ hạt 40 1.3.5.2 Nhân giống in vitro 42 1.3.6 Thành phần hóa học tác dụng dược lý Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 42 1.3.6.1 Thành phần hóa học 42 1.3.6.2 Tác dụng dược lý 43 vi 1.3.7 Một số nghiên cứu nhân giống bảo tồn Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 45 1.3.7.1 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) giới 45 1.3.7.2 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Việt Nam 46 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 50 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 50 2.1.1 Địa điểm 50 2.1.2 Thời gian 50 2.2 Vật liệu 50 2.2.1 Nguồn mẫu 50 2.2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 50 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 51 2.3 Phương pháp nghiên cứu 51 2.3.1 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn 53 2.3.2 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp 54 2.4 Bố trí thí nghiệm 55 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng saccharose đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng bạc nitrate (AgNO3) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57 2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏvàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58 vii 2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nuôi cấy lỏng tĩnh lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả tăng trưởng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 59 2.4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng môi trường hai lớp (kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy) đến khả tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 60 2.5 Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 62 2.6 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm q trình ni cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) môi trường hai lớp 62 2.6.1 Định tính saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lớp mỏng 62 2.6.2 Định lượng saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 63 2.7 Chỉ tiêu theo dõi 64 2.8 Thống kê xử lý số liệu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng elicitor than hoạt tính đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 65 3.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng elicitor saccharose đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 68 3.3 Thí nghiệm Ảnh hưởng elicitor AgNO3 đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 71 3.4 Thí nghiệm Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 74 3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 76 3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nuôi cấy lỏng tĩnh lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả tăng trưởng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 80 3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng kiểu bổ sung thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro tích lũy saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 82 viii 3.8 Hình thái Giải phẫu củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 88 3.9 Định tính saponin sắc ký lớp mỏng 90 3.10 Định lượng saponin củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 90 KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Than hoạt tính BA Benzyladenine BAP 6-Benzyl Amino Purin DNA Deoxyribonucleic Acid GA3 Acid gibberellic HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng cao áp IAA Acid b-Indolyacetic IBA Acid b-Indolybutyric IFR Cường độ ánh sáng đỏ xa IR Cường độ ánh sáng đỏ KH2PO4 Monopotassium phosphate KH&CN Khoa học công nghệ Kin Kinetin LED Light-Emmitting Diode MS Murashige Skoog, 1962 NAA Acid a-naphtaleneacetic NaClO Sodium hypocloride SH Schenk Hildebrandt (1972) TDZ Thidiazuron TLC Sắc ký lớp mỏng UFLC Sắc ký lỏng hiệu cao siêu nhanh WPM Woody Plant Medium 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid ... u cầu cấp thiết chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến q trình nhân giống, tạo củ tích lũy saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis... Grushv.)  Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến trình sinh trưởng tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): + Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng LED đơn cải tiến đến trình. .. Grushv.) + Nghiên cứu ảnh hưởng saccharose đến trình sinh trưởng tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) + Nghiên cứu ảnh hưởng bạc nitrate đến trình sinh trưởng tạo củ in