Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong sâm ngọc linh (panax

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MƠI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN Q TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực MSSV: 1411100609 : Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 14DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hệ thống LED lên q trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Trịnh Thị Lan Anh Những số liệu kết nghiên cứu đề tài trung thực chưa công bố hình thức khơng trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn thơng tin trích dẫn đề tài ghi rõ nguồn gốc Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Ngân ii LỜI CẢM ƠN Warren Buffett nói rằng: “Nếu muốn nhanh mình, muốn xa nhau” Câu nói thật khơng sai, suốt q trình hồn thành đề tài mình, em quan tâm chăm sóc dạy dỗ từ Cơ TS Trịnh Thị Lan Anh Em xin chân thành trân trọng cảm ơn ân cần dạy bảo yêu thương mà cô dành cho em, hệ sinh viên Cảm ơn khơng người giảng viên đầy tâm huyết cho em hành trang kiến thức vững vàng để vững bước đường nghiên cứu khoa học, mà yêu thương em người thân gia đình, quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn với tuổi đôi mươi giảng đường đại học Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cơ, Anh Chị nhân viên phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện hỗ trợ cho em suốt q trình hồn thành đề tài Có người nói: “Đời cho ta bao lần đôi mươi” Tuổi đôi mươi lứa tuổi đẹp người Tuổi đôi mươi em thật đẹp sinh viên ngành Công nghệ sinh học Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ HUTECH Trong suốt trình học tập rèn luyện giảng đường đại học dạy tận tình hỗ trợ nhiệt tình từ thầy cơ, em học tập cháy với lứa tuổi đơi mươi trog hoạt động Viện, Trường Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo em Hải hỗ trợ tận tình giúp đỡ em người thân gia đình Và để có thành cơng ngày hơm nay, có em ngày hơm khơng thể khơng nhắc đến tình u thương ủng hộ từ phía gia đình Gia đình hậu phương vững cho vượt qua khó khăn, thử thách sống tiếp thêm nghị lực cho Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ Cậu dạy dỗ, dìu dắt từ chập chững bước lớn khôn thành người, cho điều tốt Công ơn trời biển tình u thương vơ bờ bến gia đình quà lớn quý giá mà nhận Con xin biết ơn gia đình bên cạnh, ủng hộ động viên bước đường mà chọn iii Vì kiến thức thân hạn chế, q trình thực tập, hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ q thầy TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Kim Ngân iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Tầm quan trọng đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Lý chọn đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Tình hình nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Giới thiệu vi nhân giống elicitor 10 1.1.1 Khái niệm vi nhân giống 10 1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor 10 1.1.2.1 Than hoạt tính 11 1.1.2.2 Saccharose 12 1.1.2.3 Bạc nitrate 13 1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc 13 1.1.4 Vai trò ánh sáng vi nhân giống 15 1.1.4.1 Vai trò ánh sáng trình quang hợp thực vật 15 v 1.1.4.2 Vai trò ánh sáng trình sinh trưởng phát triển thực vật 16 1.1.4.3 Vai trò ánh sáng nhân giống in vitro 18 1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng nuôi cấy in vitro 19 1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode) 22 1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED 22 1.1.5.2 Ưu, nhược điểm đèn LED 23 1.1.5.3 Một số thành tựu giới Việt Nam sử dụng nguồn sáng LED nuôi cấy in vitro 24 1.1.5.4 Hướng phát triển ứng dụng đèn LED nuôi cấy in vitro Việt Nam .27 1.1.6 Ánh sáng thực vật 28 1.1.6.1 Vai trò số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật 28 1.1.6.2 Vai trò ánh sáng đến q trình tích lũy chất hữu thực vật 30 1.2 Phương pháp định tính định lượng saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 33 1.2.1 Định tính saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lớp mỏng 33 1.2.2 Định lượng saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu cao 34 1.3 Sơ lược Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.1 Giới thiệu sơ lược Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.2 Đặc điểm hình thái 38 1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng phát triển 39 1.3.4 Đặc điểm phân bố 40 1.3.5 Nhân giống Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 40 1.3.5.1 Nhân giống từ hạt 40 1.3.5.2 Nhân giống in vitro 42 1.3.6 Thành phần hóa học tác dụng dược lý Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 42 1.3.6.1 Thành phần hóa học 42 1.3.6.2 Tác dụng dược lý 43 vi 1.3.7 Một số nghiên cứu nhân giống bảo tồn Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 45 1.3.7.1 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) giới 45 1.3.7.2 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Việt Nam 46 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 50 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 50 2.1.1 Địa điểm 50 2.1.2 Thời gian 50 2.2 Vật liệu 50 2.2.1 Nguồn mẫu 50 2.2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 50 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 51 2.3 Phương pháp nghiên cứu 51 2.3.1 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn 53 2.3.2 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp 54 2.4 Bố trí thí nghiệm 55 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng saccharose đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng bạc nitrate (AgNO 3) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57 2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏvàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58 vii 2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nuôi cấy lỏng tĩnh lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả tăng trưởng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 59 2.4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng môi trường hai lớp (kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy) đến khả tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 60 2.5 Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 62 2.6 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm q trình ni cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) môi trường hai lớp 62 2.6.1 Định tính saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lớp mỏng 62 2.6.2 Định lượng saponin triterpenoid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 63 2.7 Chỉ tiêu theo dõi 64 2.8 Thống kê xử lý số liệu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng elicitor than hoạt tính đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 65 3.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng elicitor saccharose đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 68 3.3 Thí nghiệm Ảnh hưởng elicitor AgNO3 đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 71 3.4 Thí nghiệm Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 74 3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 76 3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng ni cấy lỏng tĩnh lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả tăng trưởng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .80 3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng kiểu bổ sung thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro tích lũy saponin Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 82 viii 3.8 Hình thái Giải phẫu củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 88 3.9 Định tính saponin sắc ký lớp mỏng 90 3.10 Định lượng saponin củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 90 KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Than hoạt tính BA Benzyladenine BAP 6-Benzyl Amino Purin DNA Deoxyribonucleic Acid GA3 Acid gibberellic HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng cao áp IAA Acid b-Indolyacetic IBA Acid b-Indolybutyric IFR Cường độ ánh sáng đỏ xa IR Cường độ ánh sáng đỏ KH2PO4 Monopotassium phosphate KH&CN Khoa học công nghệ Kin Kinetin LED Light-Emmitting Diode MS Murashige Skoog, 1962 NAA Acid a-naphtaleneacetic NaClO Sodium hypocloride SH Schenk Hildebrandt (1972) TDZ Thidiazuron TLC Sắc ký lớp mỏng UFLC Sắc ký lỏng hiệu cao siêu nhanh WPM Woody Plant Medium 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid 11 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.00014 Critical Value of t 3.35539 Least Significant 0.0324 Difference t Grouping Mean N A 0.812667 30 Sum of Source DF Model SỐ CHỒI Squares Mean Square 3.77777778 11.33333333 Error Source Corrected Total RSquare 0.809524 DF NT 11 Coeff Var F Value 11.33333333 CHIỀU CAO CHỒI 0.003 0.33333333 2.666666 67 14.00000000 Mean 0.577350 2.000000 Mean F Value Square 3.7777777 11.33 0.05 Mean N NT A B A B C DF Error 3.3333 A 2.3333 B 1.6667 C 0.6667 Sum of Squares 1.94590000 Corrected Total R-Square Coeff Var 0.990431 2.700657 Source NT DF Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.00235 Critical Value of t 3.35539 Least Significant 0.1328 Difference t Grouping Mean N A 2.39000 30 B 1.93667 30 C 1.46667 30 C C 1.38667 30 Sum of Source DF Squares Model 8.66666667 SỐ LÁ Error B C Source C NT 0.759333Corrected30Total G0 0.433333R-Square 30 CoeffG3 Var C 0.812500 21.42857 0.412667 DF Alpha 30 AnovaG SS 8.66666667 Pr > F 0.0030 0.333333 2.30600 1.0871 C Source Model Pr > F 11.33 Root MSE 28.86751 Anova SS Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference t Grouping NT G2 Anova SS 1.9459000 30 G2 30 G0 30 G3 30 G1 Mean Square F Value Pr > F 0.64863333 276.01 F 0.64863333 276.01 F Square 2.8888888 11.56 0.0028 2.000000 0.25000000 00 11 10.66666667 Root MSE Mean 0.500000 2.33333 F Value Mean Square 2.88888889 0.05 11.56 Pr > F 0.002 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference t Grouping A B C B C 0.25 2.30600 0.9414 Mean 3.6667 2.3333 B 2.0000 C 1.3333 N 30 30 NT G2 G0 30 G3 30 G1 ĐƯỜNG KÍNH TÁN LÁ CHÉT Source Model DF Error Source Corrected Total RSquare 0.992112 DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 1.2074000 0.40246667 335.39 F 12 NT 1.2074000 0.4024666 0.01 Alph a Error Degrees of Freedom Error Mean 0.0012 Square Critical Value of t 3.35539 Least Significant 0.0949 Difference t Grouping Mean N A 1.87667 30 B 1.41000 30 C 1.20667 30 D 1.02667 30 SỐ CỦ 335.39 F 6.91666667 2.3055555 9.22 0.0056 Erro 2.0000000 0.25000000 r Corrected 11 8.9166666 Total R-Square Coeff Var Root Mean MSE 0.775701 35.29412 0.500000 1.416667 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 6.91666667 2.3055555 9.22 0.0056 Alph 0.05 a Error Degrees of Freedom Error Mean 0.25 Square Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.9414 t Grouping Mean N NT A 2.3333 30 G0 A A 30 G2 2.0000 B 0.6667 30 G1 B B 30 G3 0.6667 Sum of Source Model Source NT DF Erro r Corrected Total R-Square Square s 0.00101825 Mean Square F Value Pr > F 0.00033942 9.15 0.0058 0.0002966 0.00003708 11 0.0013149 Coeff Var Root Mean MSE 0.774384 3.478120 0.006090 0.175083 DF Anova SS Mean F Pr > Square Value F 0.00101825 0.00033942 9.15 0.0058 Alph 0.05 a Error Degrees of Freedom Error Mean 0.000037 Square Critical Value of t 2.30600 Least Significant 0.0115 Difference t Grouping Mean N NT A 0.187667 30 G2 A B A 0.178667 30 G0 B B C 0.171333 30 G3 C C 0.162667 30 G1 CHIỀU DÀI CỦ Source DF Squares Model 0.00129892 Erro r Corrected Total Sum of Mean Square F Value 0.0004329 8.0 7 0.0004293 11 0.0017282 Pr > F 0.0084 0.00005367 R-Square Coeff Var Root Mean MSE 2.112690 0.007326 0.346750 Anova SS Mean Square F Value 0.00129892 0.00043297 8.07 0.05 0.751579 DF Pr > F 0.0084 Alph a Error Degrees of Freedom Error Mean 0.000054 Square Critical Value of t 2.30600 Least Significant 0.0138 Difference t Grouping Mean N NT A 0.360333 30 G2 A B A 0.352000 30 G0 B B C 0.342000 30 G3 C C 0.332667 30 G1 Thí nghiệm Ảnh hưởng nuôi cấy lỏng tĩnh lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả tăng trưởng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRỌNG LƯỢNG TƯƠI Sum of Source Squares Mean Square F Value Pr > F D F Model 0.135901 0.135901 695.15 F 0.13590150 0.13590150 695.15 F Square 0.0775206 180.42 0.0002 0.00171867 0.000429 67 0.07923933 Root MSE Mean 0.020728 Mean Square 0.07752067 0.01 0.72966 F Value 0.07752067 180.42 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.00043 Critical Value of t 4.60409 Least Significant 0.0779 Difference t Mean N NT Grouping A 0.8433 30 L2 B 0.6160 30 L0 Sum of Pr > F 0.0002 DF Square Mean Square F Value Pr > F s 24.0000000 24.0000000 72.00 0.001 0 MeanErr N 1.3333333 0.33333333 NT or 1.50100Corrected30Total 25.33333333 L2 1.20000 30 L0 Root MSE Mean 0.947368 15.74592 0.577350 3.66666 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 24.000000 24.0000000 72.00 00 Alpha 0.05 R-Square Coeff Var Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.77645 Least Significant 1.3088 Difference t Mean N NT Grouping A 5.6667 30 L2 B 1.6667 30 L0 Thí nghiệm Ảnh hưởng kiểu bổ sung thành phần môi trường nuôi cấy đến khả tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRỌNG LƯỢNG TƯƠI Sum of Source DF Squares Model 2.1795626 Error Corrected Total R-Square Coeff Var 0.99229 1.90971 Mean Square F Pr > F Value 294.20 F 2.5883819 0.36976885 358.85 F Square 0.3697688 358.85 F 2.0714285 5.52 0.002 16 6.00000000 0.3750000 23 20.5000000 Root MSE Mean 0.612372 2.250000 Mean Square F Value 2.071428 57 0.05 16 5.52 Pr > F 0.0023 0.375 2.11991 1.06 Mean 3.6667 A 2.6667 B A 2.6667 B 2.3333 B C 2.3333 B C 2.0000 C D 1.3333 D 1.0000 N 30 NT E8 30 E6 30 E7 30 E5 30 E3 30 E4 30 E2 30 E1 CHIỀU CAO CHỒI Source Sum of F Pr > F Value 3.02018333 0.43145476 122.25 F SS 3.02018333 0.43145476 122.25 F 2.07142857 5.52 0.002 6.00000000 23 20.50000000 0.3750000 15 R-Square Source NT 0.707317 DF Coeff Var 27.21655 Anova SS 14.500000 00 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference t Grouping A B A B A B C B C B C C D D Root MSE Mean 0.612372 Mean Square 2.0714285 0.05 16 2.250000 F Pr > Value F 5.52 0.002 0.375 2.11991 1.06 Mean 3.6667 A 2.6667 B A 2.6667 B 2.3333 B C 2.3333 B C D 2.0000 C D 1.3333 D 1.0000 N 30 NT E8 30 E6 30 E7 30 E5 30 E3 30 E4 30 E2 30 E1 ĐƯỜNG KÍNH TÁN LÁ CHÉT Source Model Source NT SỐ CỦ Source Model Source NT DF Sum of Squares Mean F Pr > F Square Value 0.70942917 0.1013470 22.82 F Square 0.70942917 0.10134702 22.82 F Square Value 0.01561462 0.0022306 23.92 F Square 0.01561462 0.00223066 23.92 F Square Value 0.0012177 75.33 F Square 0.00852429 0.00121776 75.33 F Square Value 0.0124293 0.0017756 43.00 F Square 0.01242933 0.00177562 43.00