Tìm hiểu về quá trình tách chiết DNA và một số ứng dụng trong thực tiễn si01

Nhằmgiúp các em học sinh nâng cao hiểu biết và có thêm hứng thú về sinh học phân tửcũng như tách chiết DNA kèm theo ứng dụng của chúng trong thực tiễn, chuyên đề “ Tìm hiểu về quá trình

CHUYÊN ĐỀ TÌM HIỂU VỀ TÁCH CHIẾT DNA VÀ MỘT

SỐ ỨNG DỤNG TRONG

THỰC TIỄN

Tháng 8 năm 2019

MỤC LỤ

MỤC LỤC i

A MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 1

B NỘI DUNG 2

I KIẾN THỨC CƠ BẢN VỀ NUCLEIC ACID 2

1.1 Nucleic acid 2

1.2 DNA (Desoxyribonucleic acid) 2

1.2.1 Khái niệm và đặc điểm của DNA 2

1.2.2 DNA của Prokaryotae 3

1.2.3 DNA của Eukaryotae 4

1.2.4 Chức năng của DNA 4

1.3 RNA (Ribonucleic acid) 5

1.3.1 Khái niệm và đặc điểm của RNA 5

1.3.2 Các loại RNA 5

II CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID –PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CƠ BẢN 7

1.1 Vai trò của việc tách chiết nucleic acid 7

1.2 Phương pháp tách chiết DNA 7

1.2.1 Yêu cầu 7

1.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 7

1.3 Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA 9

1.3.1 Yêu cầu 9

1.3.2 Phương pháp tách chiết RNA 10

1.3.3 Phân lập các loại RNA sau tách chiết 10

1.4 Siêu li tâm 11

1.5 Phương pháp sắc kí 11

1.6 Các phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid 12

1.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế 12

1.6.2 Phương pháp điện di 12

III MỘT SỐ VI DỤ TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ ỨNG DỤNG 15

1.1 Tách DNA từ lá tươi và lá khô của cây Terminalia arjuna 15

1.2 Ứng dụng của tách chiết DNA 17

1.2.1 Chuẩn đoán các bệnh, rối loạn di truyền 17

1.2.2 Sản xuất các chất phòng và chữa bệnh 17

1.2.3 Liệu pháp gen 18

1.2.4 Pháp y 18

1.2.5 Xác định chủng loại, tính đa dạng di truyền 18

1.2.6 Chọn giống cây trồng vật nuôi 18

C CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP VẬN DỤNG 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23

Kết luận 23

Kiến nghị 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

A MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành kinh tế - xã hội, khoa họccông nghệ đã và đang đạt được những thành tựu đáng kể Trong đó, các hướngnghiên cứu khoa học về DNA và nhiễm sắc thể luôn được các nhà khoa học đặc biệtquan tâm

DNA có vai trò thiết yếu trong hệ thống sống, quy định đặc tính di truyền,lưu trữ và truyền đạt thông tin, điều hòa hoạt động gene, Việc tìm ra biên pháptách DNA ra khỏi tế bào sinh vật có ý nghĩa vô cùng to lớn, góp phần nghiên cứusâu hơn về cấu trúc DNA, đặc điểm thông tin di truyền của các loài, hướng tới sảnxuất các chế phẩm sinh học hay phương pháp điều trị bệnh mới dựa trên nguyên lýhoạt động gene cũng như ứng dụng vào thực tiễn đời sống

Trong chương trình sinh học phổ thông, các kiến thức về DNA khá trừutượng, chủ yếu cung cấp khái quát về cấu trúc, chưa đi sâu vào ứng dụng Nhằmgiúp các em học sinh nâng cao hiểu biết và có thêm hứng thú về sinh học phân tửcũng như tách chiết DNA kèm theo ứng dụng của chúng trong thực tiễn, chuyên đề

“ Tìm hiểu về quá trình tách chiết DNA và một số ứng dụng trong thực tiễn”

Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau làdesoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA).

1.2 DNA (Desoxyribonucleic acid)

1.2.1 Khái niệm và đặc điểm của DNA

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đối song song, mỗi mạch

là một chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm một nhóm phosphate, 1 gốc đườngdesoxyribose và một trong bốn base (adenine, cytosine, guanine và thymine) Haimạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hyđro hình thành giữa các base bổ sungnằm trên hai mạch: A liên lết bổ sung với T bằng hai liên kết hyđro, G liên kết bổsung với C bằng ba liên kết hyđro Mạch dù, các liên kết hyđro là các liên kết yếunhưng phân tử DNA gồm rất nhiều đơn phân nên số lượng liên kết hydro là cực kỳlớn làm cho DNA vừa có tính bền vững, vừa có tính linh hoạt

Một đặc điểm của DNA là tính đối song Mỗi mạch đơn là một trình tự có địnhhướng với một đầu mang nhóm phosphate (P) tự do gắn vào C5 của đườngdesoxyribose nên gọi là đầu 5’P, đầu kia mang nhóm hydroxyl (OH) tự do ở vị trí

C3 nên gọi là đầu 3’OH, hướng quy ước là 5’  3’ và đầu 5’P của mạch này đốidiện với đầu 3’OH của mạch bổ sung.

Hai chuỗi polynucleotide của phân tử DNA không chỉ liên kết với nhau bằngliên kết hydro mà chúng còn xoắn lại quang một trục tưởng tượng tạo nên chuỗixoắn kép đều đặn như một cầu thang xoắn Trong đó, các bậc thang là các base nito,còn thành và tay vịnh là các phân tử đường và các nhóm phosphate

Hai mạch của phân tử DNA gắn với nhau nhờ liên kết hydro, nếu có các tácđộng nào đó làm đứt các liên kết này thì hai mạch sẽ tách rời nhau Khi đun nóngphân tử DNA vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80 – 900C), các liên kết hydro giữahai mạch bị đứt và chúng tách rời nhau, được gọi là hiện tượng biến tính DNA.Nhiệt độ làm hai mạch DNA tách rời gọi là điểm chảy

Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ thuộc vào số lượng các liên kếthydro DNA có tỷ lệ G – C cao sẽ có điểm chảy cao hơn DNA có 60% G – C thì cóđiểm chảy khoảng 950C Đoạn DNA càng dài sẽ dẫn đến số lượng liên kết hydrotăng do đó điểm chảy cũng tăng

Sự biến tính của DNA có thể thuận nghịch, nếu DNA đã bị biến tính được hạnhiệt độ từ từ trở lại bình thường chúng có thể gắn lại với nhau tạo thành mạch kép,

đó được gọi là hiện tượng hồi tính DNA Đây là một đặc điểm quan trọng làm cơ sởcho kỹ thuật lai acid nucleic và tách chiết DNA

1.2.2 DNA của Prokaryotae

Bộ gene của đa số Prokaryotae là một phân tử DNA có dạng vòng tròn vàkhông gắn với protein

DNA có thể ở 3 dạng cấu trúc (topological structure):

+ Dạng thứ nhất: siêu xoắn, khi mạch kép vặng xoắn hình số 8 Đây là dạng

tự nhiên trong tế bào vi khuẩn

+ Dạng thứ hai: vòng tròn, khi sợi DNA căng tròn Dạng này có được doDNA siêu xoắn bị cắt đứt 1 trong 2 mạch kép

+ Dạng thứ ba: thẳng, khi DNA bị đứt cả hai mạch

Thường trong tế bào prokaryotae, DNA ở dạng siêu xoắn

1.2.3 DNA của Eukaryotae

Phần lớn DNA trong tế bào Eukaryotae có dạng thẳng mạch xoắn kép và gắnvới nhiều loại protein Trong số đó, protein histone giữ vai trò cốt lõi trong việccuộn lại và điều hòa hoạt tính của DNA Các histone là những protein nhỏ chứanhiều amino acid mang điện tích dương nên gắn chắc với DNA mang điện tích âm.DNA Eukaryotae có kích thước rất lớn nên tế bào cần giải quyết được vấn đềnén chặt phân tử này vào thể tích rất hạn chế của nhân Việc nén được thực hiện quanhiều mức độ, thấp chất là nucleosome và cao nhất là cấu trúc chất nhiễm sắc Sựhình thành nhiễm sắc thể kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấutrúc sau:

+ Nucleosome là đơn vị cấu trúc của nhiễm sắc thể được tạo nên do sợi DNAdài quấn quanh các protein histone, hình thành sơi 11nm Đơn vị này là phức hợpgồm 146 cặp base của DNA quấn quanh 8 phân tử histone (2 H2A, 2 H2B, 2 H3 và

2 H4) Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histone trung gian (H1).+ Sợi chromatin dày 30nm gồm các nucleosome xếp khít nhau tạo thành phứchợp nucleoprotein

+ Vùng xếp cuộn dày 300nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúctạo nên

+ Chất dị nhiễm sắc 700nm

Cuối cùng khi chất nhiễm sắc đạt độ nén chặt cực đại, nó trở thành nhiễm sắcthể (1400nm) Đó là khi tế bào phân chia

1.2.4 Chức năng của DNA

Mỗi một tế bào trên hành tinh chúng ta đều lưu trữ thông tin di truyền trongcùng một dạng hóa chất, đó là DNA mạch kép Tuy cấu trúc của DNA đơn giản hơnnhiều so với protein nhưng nó thỏa mãn đầy đủ các chức năng cả vật chất di truyền

DNA có khả năng mang thông tin di truyền Phân tử DNA có chiều nganggiới hạn nhưng chiều dài không hạn chế, trình tự các nucleotide sắp xếp theo chiềudài có thể phản ánh những thông tin nhất định Tuy DNA chỉ gồm 4 loại nucleotide

(A, T, G, C) nhưng số loại tổ hợp trình tự khác nhau là một con số khổng lồ Khảnăng chứa thông tin đó làm cho DNA là phân tử dài nhất trong tự nhiên, chứa cảchương trình phát triển của mỗi tế bào Đặc biệt 64 bộ ba mã hóa cho tổng hợpprotein cũng giống nhau ở tất cả các tế bào của tất cả sinh vật từ vi khuẩn đến conngười Ngoài việc chứa thông tin theo chiều dài, khả năng này còn được mở rộng docác thay đổi cấu trúc: gãy nối lại tạo các xen đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn,

DNA có khả năng tự sao chép chính xác làm cơ sở cho quá trình sinh sản nốitiếp các thế hệ, đảm bảo duy trì bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của loài Chuỗi xoắnkép gồm hai mạch bắt bổ sung A –T, G – C, làm cho phân tử có khả năng bắt cặpchính xác và sửa sai ngay trên chính phân tử đó Mỗi mạch có thể làm khuôn đểtổng hợp lại mạch còn lại tạo ra phân tử DNA giống hệt ban đầu

DNA còn có khả năng tự sửa sai nhờ đó thông tin di truyền có tính ổn địnhrất cao Có thể nói DNA là hợp chất kỳ diệu nhất trong thiên nhiên

1.3 RNA (Ribonucleic acid)

1.3.1 Khái niệm và đặc điểm của RNA

Các RNA giữ vai trò trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp protein Tất

cả chúng đều được tổng hợp từ các gen tương ứng trên DNA Phân tử RNA có cấutrúc tương tự DNA với ba điểm khác biệt sau:

+ Phân tử RNA là chuỗi đơn

+ Pentose của phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose

+ Thymine, một trong bốn loại base hình thành nên phân tử DNA, được thaythế bằng uracil trong phân tử RNA

1.3.2 Các loại RNA

1.3.2.1 RNA ribosome

rRNA là thành phần cấu tạo, chiếm phân nửa khối lượng ribosome nênrRNA chiếm tỷ lệ cao, có thể đến 75% của tổng RNA Các loại phân tử RNA khác

nhau được đánh giá và đặt tên theo hệ số lắng khi siêu li tâm là S S càng lớn RNAcàng dài.

Các ribosome của lục lạp, ty thể và vi khuẩn có hệ số lắng là 70S gồm haitiểu đơn vị:

+ Tiểu đơn vị lớn 50S có 1 rRNA 23S và 1rRNA 5S

+ Tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ có 1 rRNA 16S

Các ribosome của sinh vật nhân thcuwj thuộc loại 80S, gồm hai tiểu đơn vị:+ Tiểu đơn vị lớn 60S có 1 rRNA 28S, 1 rRNA 5,8S và 1 rRNA 5S

+ Tiểu đơn vị nhỏ 40S chỉ có 1 rRNA 18S

1.3.2.2 Các tRNA vận chuyển (transfer RNA)

Trong quá trình dịch mã, trước khi tạo thành chuỗi polypeptide, các aminoacid phải được gắn với một chất trung gian, chất này phải đặc hiệu với các báe trênmRNA Chất trung gian này được gọi làd tRNA Mỗi phân tử tRNA gắn với mộtamino acid và mang đến ribosome

tRNA có một số đặc tính chung: chiều dài khoảng từ 73 đến 93 nucleotide,cấutrúc gồm một mạch cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử vàđầu mút 3’ có trình tự kết thúc CCA Amino acid luôn gắn vào đầu CCA

Mỗi amino acid có một codon là trình tự 3 nucleotide trên mRNA Mỗi tRNA

có ở vị trí nhô ra một bộ ba không bắt cặp của các base gọi là anticodon, mà bộ banày bổ sung với trình tự codon trên mRNA tưng ứng với một amino acid đặc hiệu

1.3.2.2 Các mRNA thông tin

ARN thông tin được phiên mã từ các gen trong DNA, có cấu trúc chuỗi đơn,

độ dài thay đổi tùy theo độ dài của gen tương ứng mà chúng đucợ phiên mã

mRNA thường chứa trình tự nucleotide nhiều hơn số dùng mã hóa choprotein Đầu 5’ có mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã.Đuôi 3’ sau tín hiệu kết thúc có đoạn 3’ không mã hóa là nơi gắn đuôi poly–A, độdài của đoạn poly-A phản ánh tuổi thọ của chuỗi mRNA

II CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID –PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CƠ BẢN

1.1 Vai trò của việc tách chiết nucleic acid

Tất cả các nghiên cứu và ứng dụng về sinh học phân tử chỉ được tiến hành khi

có được một lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh sạch

Tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu về sinh học phân tử, phân loại và

đa dạng di truyền

1.2 Phương pháp tách chiết DNA

1.2.1 Yêu cầu

 Thu nhận lượng DNA đủ lớn và tinh sạch

 Các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi cáctác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủygiải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ

 Tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của cácenzyme nội bào

 Phân tử DNA có kích thước lớn do đó trong thao tác cần tránh mọi tácnhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này

1.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào eukaryote).

SDS (sodium dodecyl sulfate): Chất tẩy rửa, làm gãy các liên kết không cộnghóa trị.

Sarkosyl: Hòa tan các protein màng

Proteinase K: Enzyme phân cắt protein (protease)

Đối với vi khuẩn: thường dùng lysozyme và EDTA để phân giải màng.EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acid): Các acid nội bào thủy phân nucleic acidcần có các ion hóa trị như Mg2+, Ca2+ để hoạt động EDTA liên kết với các ion hóatrị trên  ức chế hoạt động của nucleic acid

Đối với thực vật: do có vỏ cellulose, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng ở

196oC, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệDNA phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein

Mục đích: Loại bỏ các thành phần không phải là DNA

Dùng dung dịch phenol:chloroform làm biến tính protein

Phenol-Chloroform không tan trong nước và làm biến tính protein Protein sẽ

bị tủa khi gặp phenol DNA thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước

Sau li tâm, thu được phần nước phía trên ống nghiệm chứa DNA hòa tan,phần giữa là protein kết tủa, phần dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn khác

 Bước 3: Tủa nucleic acid

Mục đích:

+ Thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc

+ Bảo quản tránh tác dụng của các enzyme phân huỷ nucleic acid

+ Hòa tan nucleic acid lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

 Tủa trong ethanol (ethylic alcohol)

Điều kiện:

+ Môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao)

+ Vethanol : V mẫu = 2,5 : 1 Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn DNA.+ Nhiệt độ thấp. Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo kết tủa.

 Tủa trong isopropanol

Sau khi tạo tủa từ 2 phương pháp trên, đem dung dịch li tâm thu đượcDNA cô đặc (pellet)

Lưu ý: Cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặccác dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu

1.3 Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA

1.3.1 Yêu cầu

Các phân tử RNA không bên và dễ bị phân hủy bởi các enzyme làribonuclease Các enzyme này lại có mặt ở khắp nơi, ngay cả trên đầu ngón tay củangười thao tác, có hoạt tính rất cao và bên vững với các tác nhân thường dùng đểloại bỏ enzyme

1.3.2 Phương pháp tách chiết RNA

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân

Tế bào, mô được nghiền trong dung dịch gồm:

+ Chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao

+ Tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate)

Các protein được loại ra khỏi mẫu qua xử lí phenol chloroform và li tâm

 Bước 3: Tủa nucleic acid

RNA hòa tan trong nước được tủa bằng ethanol và được thu nhận lại qua litâm

RNA được bảo quản trong dung dịch ethanol dưới dạng tủa hoặc đông lạnh ở-700C trong nước có chứa Rnasine (một chất ức chế RNase)

1.3.3 Phân lập các loại RNA sau tách chiết

rRNA và tRNA có kích thước và trình tự xác định nên có thể tách riêng dễdàng bằng phương pháp li tâm, điện di,

mRNA có kích thước và trình tự vô cùng đa dạng Tuy nhiên chúng có điểmchung là cấu trúc đuôi poly-A Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-

T của nucleic acid, người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trêncột oligodT-cellulose Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qualiên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này sẽ được thu nhận lại qua li tâm vàmRNA sẽ được tách khỏi các viên bi và được giữa lại

Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid được tinh sạch bằng siêu li tâm, sắc

ký hay điện di