Tìm hiểu về quá trình tách chiết DNA và một số ứng dụng trong thực tiễn si01

CHUYÊN ĐỀ TÌM HIỂU VỀ TÁCH CHIẾT DNA VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG THỰC TIỄN Tháng năm 2019 MỤC LỤC A MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cùng với phát triển mạnh mẽ ngành kinh tế - xã hội, khoa học công nghệ đạt thành tựu đáng kể Trong đó, hướng nghiên cứu khoa học DNA nhiễm sắc thể nhà khoa học đặc biệt quan tâm DNA có vai trò thiết yếu hệ thống sống, quy định đặc tính di truyền, lưu trữ truyền đạt thơng tin, điều hòa hoạt động gene, Việc tìm biên pháp tách DNA khỏi tế bào sinh vật có ý nghĩa vơ to lớn, góp phần nghiên cứu sâu cấu trúc DNA, đặc điểm thông tin di truyền loài, hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học hay phương pháp điều trị bệnh dựa nguyên lý hoạt động gene ứng dụng vào thực tiễn đời sống Trong chương trình sinh học phổ thơng, kiến thức DNA trừu tượng, chủ yếu cung cấp khái quát cấu trúc, chưa sâu vào ứng dụng Nhằm giúp em học sinh nâng cao hiểu biết có thêm hứng thú sinh học phân tử tách chiết DNA kèm theo ứng dụng chúng thực tiễn, chuyên đề “ Tìm hiểu trình tách chiết DNA số ứng dụng thực tiễn” thực Mục đích đề tài Tổng hợp số kiến thức chung DNA, qua nêu bật lên đặc điểm, chức chế hoạt động DNA Quy trình, phương pháp tách chiết DNA kèm theo ưu, nhược điểm phương pháp Chỉ số ứng dụng thực tiễn Giới thiệu số câu hỏi, tập vận dụng chuyên sâu B NỘI DUNG I KIẾN THỨC CƠ BẢN VỀ NUCLEIC ACID 1.1 Nucleic acid Nucleic acid – vật chất mang thông tin di truyền hệ thống sống, polymer hình thành từ monomer nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (5C) base hữu (vì nucleotide khác base nên người ta thường dùng từ base thay cho nucleotide) Các base hữu thuộc hai nhóm: purin gồm adenine guanine, pyrimidine gồm thymine, cytosine uracil Các nucleotide đucợ nối với liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo giống desoxyribonucleic acid (DNA) ribonucleic acid (RNA) 1.2 DNA (Desoxyribonucleic acid) 1.2.1 Khái niệm đặc điểm DNA Phân tử DNA chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đối song song, mạch chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, gốc đường desoxyribose bốn base (adenine, cytosine, guanine thymine) Hai mạch đơn kết hợp với nhờ liên kết hyđro hình thành base bổ sung nằm hai mạch: A liên lết bổ sung với T hai liên kết hyđro, G liên kết bổ sung với C ba liên kết hyđro Mạch dù, liên kết hyđro liên kết yếu phân tử DNA gồm nhiều đơn phân nên số lượng liên kết hydro lớn làm cho DNA vừa có tính bền vững, vừa có tính linh hoạt Một đặc điểm DNA tính đối song Mỗi mạch đơn trình tự có định hướng với đầu mang nhóm phosphate (P) tự gắn vào C đường desoxyribose nên gọi đầu 5’P, đầu mang nhóm hydroxyl (OH) tự vị trí C3 nên gọi đầu 3’OH, hướng quy ước 5’  3’ đầu 5’P mạch đối diện với đầu 3’OH mạch bổ sung Hai chuỗi polynucleotide phân tử DNA không liên kết với liên kết hydro mà chúng xoắn lại quang trục tưởng tượng tạo nên chuỗi xoắn kép đặn cầu thang xoắn Trong đó, bậc thang base nito, thành tay vịnh phân tử đường nhóm phosphate Hai mạch phân tử DNA gắn với nhờ liên kết hydro, có tác động làm đứt liên kết hai mạch tách rời Khi đun nóng phân tử DNA vượt nhiệt độ sinh lý (khoảng 80 – 90 0C), liên kết hydro hai mạch bị đứt chúng tách rời nhau, gọi tượng biến tính DNA Nhiệt độ làm hai mạch DNA tách rời gọi điểm chảy Nhiệt độ đặc trưng cho loại DNA, phụ thuộc vào số lượng liên kết hydro DNA có tỷ lệ G – C cao có điểm chảy cao DNA có 60% G – C có điểm chảy khoảng 950C Đoạn DNA dài dẫn đến số lượng liên kết hydro tăng điểm chảy tăng Sự biến tính DNA thuận nghịch, DNA bị biến tính hạ nhiệt độ từ từ trở lại bình thường chúng gắn lại với tạo thành mạch kép, gọi tượng hồi tính DNA Đây đặc điểm quan trọng làm sở cho kỹ thuật lai acid nucleic tách chiết DNA 1.2.2 DNA Prokaryotae Bộ gene đa số Prokaryotae phân tử DNA có dạng vòng tròn khơng gắn với protein DNA dạng cấu trúc (topological structure): + Dạng thứ nhất: siêu xoắn, mạch kép vặng xoắn hình số Đây dạng tự nhiên tế bào vi khuẩn + Dạng thứ hai: vòng tròn, sợi DNA căng tròn Dạng có DNA siêu xoắn bị cắt đứt mạch kép + Dạng thứ ba: thẳng, DNA bị đứt hai mạch Thường tế bào prokaryotae, DNA dạng siêu xoắn 1.2.3 DNA Eukaryotae Phần lớn DNA tế bào Eukaryotae có dạng thẳng mạch xoắn kép gắn với nhiều loại protein Trong số đó, protein histone giữ vai trò cốt lõi việc cuộn lại điều hòa hoạt tính DNA Các histone protein nhỏ chứa nhiều amino acid mang điện tích dương nên gắn với DNA mang điện tích âm DNA Eukaryotae có kích thước lớn nên tế bào cần giải vấn đề nén chặt phân tử vào thể tích hạn chế nhân Việc nén thực qua nhiều mức độ, thấp chất nucleosome cao cấu trúc chất nhiễm sắc Sự hình thành nhiễm sắc thể kỳ từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống bậc cấu trúc sau: + Nucleosome đơn vị cấu trúc nhiễm sắc thể tạo nên sợi DNA dài quấn quanh protein histone, hình thành sơi 11nm Đơn vị phức hợp gồm 146 cặp base DNA quấn quanh phân tử histone (2 H2A, H2B, H3 H4) Các nucleosome kề nối qua phân tử histone trung gian (H1) + Sợi chromatin dày 30nm gồm nucleosome xếp khít tạo thành phức hợp nucleoprotein + Vùng xếp cuộn dày 300nm sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên + Chất dị nhiễm sắc 700nm Cuối chất nhiễm sắc đạt độ nén chặt cực đại, trở thành nhiễm sắc thể (1400nm) Đó tế bào phân chia 1.2.4 Chức DNA Mỗi tế bào hành tinh lưu trữ thơng tin di truyền dạng hóa chất, DNA mạch kép Tuy cấu trúc DNA đơn giản nhiều so với protein thỏa mãn đầy đủ chức vật chất di truyền DNA có khả mang thơng tin di truyền Phân tử DNA có chiều ngang giới hạn chiều dài khơng hạn chế, trình tự nucleotide xếp theo chiều dài phản ánh thơng tin định Tuy DNA gồm loại nucleotide (A, T, G, C) số loại tổ hợp trình tự khác số khổng lồ Khả chứa thơng tin làm cho DNA phân tử dài tự nhiên, chứa chương trình phát triển tế bào Đặc biệt 64 ba mã hóa cho tổng hợp protein giống tất tế bào tất sinh vật từ vi khuẩn đến người Ngồi việc chứa thơng tin theo chiều dài, khả mở rộng thay đổi cấu trúc: gãy nối lại tạo xen đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, DNA có khả tự chép xác làm sở cho trình sinh sản nối tiếp hệ, đảm bảo trì nhiễm sắc thể đặc trưng loài Chuỗi xoắn kép gồm hai mạch bắt bổ sung A –T, G – C, làm cho phân tử có khả bắt cặp xác sửa sai phân tử Mỗi mạch làm khn để tổng hợp lại mạch lại tạo phân tử DNA giống hệt ban đầu DNA có khả tự sửa sai nhờ thơng tin di truyền có tính ổn định cao Có thể nói DNA hợp chất kỳ diệu thiên nhiên 1.3 RNA (Ribonucleic acid) 1.3.1 Khái niệm đặc điểm RNA Các RNA giữ vai trò trung gian quan trọng sinh tổng hợp protein Tất chúng tổng hợp từ gen tương ứng DNA Phân tử RNA có cấu trúc tương tự DNA với ba điểm khác biệt sau: + Phân tử RNA chuỗi đơn + Pentose phân tử RNA ribose thay deoxyribose + Thymine, bốn loại base hình thành nên phân tử DNA, thay uracil phân tử RNA 1.3.2 Các loại RNA 1.3.2.1 RNA ribosome rRNA thành phần cấu tạo, chiếm phân nửa khối lượng ribosome nên rRNA chiếm tỷ lệ cao, đến 75% tổng RNA Các loại phân tử RNA khác đánh giá đặt tên theo hệ số lắng siêu li tâm S S lớn RNA dài Các ribosome lục lạp, ty thể vi khuẩn có hệ số lắng 70S gồm hai tiểu đơn vị: + Tiểu đơn vị lớn 50S có rRNA 23S 1rRNA 5S + Tiểu đơn vị nhỏ 30S có rRNA 16S Các ribosome sinh vật nhân thcuwj thuộc loại 80S, gồm hai tiểu đơn vị: + Tiểu đơn vị lớn 60S có rRNA 28S, rRNA 5,8S rRNA 5S + Tiểu đơn vị nhỏ 40S có rRNA 18S 1.3.2.2 Các tRNA vận chuyển (transfer RNA) Trong trình dịch mã, trước tạo thành chuỗi polypeptide, amino acid phải gắn với chất trung gian, chất phải đặc hiệu với báe mRNA Chất trung gian gọi làd tRNA Mỗi phân tử tRNA gắn với amino acid mang đến ribosome tRNA có số đặc tính chung: chiều dài khoảng từ 73 đến 93 nucleotide,cấu trúc gồm mạch cuộn lại hình chẻ ba nhờ bắt cặp bên phân tử đầu mút 3’ có trình tự kết thúc CCA Amino acid ln gắn vào đầu CCA Mỗi amino acid có codon trình tự nucleotide mRNA Mỗi tRNA có vị trí nhơ ba không bắt cặp base gọi anticodon, mà ba bổ sung với trình tự codon mRNA tưng ứng với amino acid đặc hiệu 1.3.2.2 Các mRNA thông tin ARN thông tin phiên mã từ gen DNA, có cấu trúc chuỗi đơn, độ dài thay đổi tùy theo độ dài gen tương ứng mà chúng đucợ phiên mã mRNA thường chứa trình tự nucleotide nhiều số dùng mã hóa cho protein Đầu 5’ có mang tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã Đuôi 3’ sau tín hiệu kết thúc có đoạn 3’ khơng mã hóa nơi gắn đuôi poly–A, độ dài đoạn poly-A phản ánh tuổi thọ chuỗi mRNA II CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID –PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CƠ BẢN 1.1 Vai trò việc tách chiết nucleic acid Tất nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử tiến hành có lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh Tạo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu sinh học phân tử, phân loại đa dạng di truyền 1.2 Phương pháp tách chiết DNA 1.2.1 Yêu cầu − Thu nhận lượng DNA đủ lớn tinh − Các phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học (phân tử bị gãy nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ − Tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào − Phân tử DNA có kích thước lớn thao tác cần tránh tác nhân học hay hóa học mạnh làm đứt gãy phân tử 1.2.2 Phương pháp tách chiết DNA  Bước 1: Phá màng tế bào màng nhân (tế bào eukaryote) Mục đích: Phá màng TB màng nhân Phá vỡ tế bào phương pháp vật lí hay hóa học tùy loại tế bào Phương pháp: + Nghiền TB hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarkosyl) proteinase (proteinase K) + Phá vỡ màng TB màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA SDS (sodium dodecyl sulfate): Chất tẩy rửa, làm gãy liên kết khơng cộng hóa trị Sarkosyl: Hòa tan protein màng Proteinase K: Enzyme phân cắt protein (protease) Đối với vi khuẩn: thường dùng lysozyme EDTA để phân giải màng EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acid): Các acid nội bào thủy phân nucleic acid cần có ion hóa trị Mg2+, Ca2+ để hoạt động EDTA liên kết với ion hóa trị  ức chế hoạt động nucleic acid Đối với thực vật: có vỏ cellulose, nên phải nghiền nitơ lỏng 196oC, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ DNA phóng thích từ nhân khơng bị tiêu hủy protease tế bào  Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein Mục đích: Loại bỏ thành phần DNA Dùng dung dịch phenol:chloroform làm biến tính protein Phenol-Chloroform khơng tan nước làm biến tính protein Protein bị tủa gặp phenol DNA khơng bị tủa phenol nên tan nước Sau li tâm, thu phần nước phía ống nghiệm chứa DNA hòa tan, phần protein kết tủa, phần đáy ống nghiệm tạp chất lẫn khác  Bước 3: Tủa nucleic acid Mục đích: + Thu nhận nucleic acid dạng đặc + Bảo quản tránh tác dụng enzyme phân huỷ nucleic acid + Hòa tan nucleic acid lại dung dịch theo nồng độ mong muốn − Tủa ethanol (ethylic alcohol) Điều kiện: + Mơi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) + Vethanol : V mẫu = 2,5 : 1 Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn DNA + Nhiệt độ thấp. Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo kết tủa − Tủa isopropanol Điều kiện: + Không cần diện muối + Visopropanol : Vmẫu = 1:1  Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein Các protein loại khỏi mẫu qua xử lí phenol chloroform li tâm  Bước 3: Tủa nucleic acid RNA hòa tan nước tủa ethanol thu nhận lại qua li tâm RNA bảo quản dung dịch ethanol dạng tủa đông lạnh -700C nước có chứa Rnasine (một chất ức chế RNase) 1.3.3 Phân lập loại RNA sau tách chiết rRNA tRNA có kích thước trình tự xác định nên tách riêng dễ dàng phương pháp li tâm, điện di, mRNA có kích thước trình tự vơ đa dạng Tuy nhiên chúng có điểm chung cấu trúc poly-A Dựa vào cấu trúc đặc tính liên kết bổ sung AT nucleic acid, người ta tách mRNA khỏi mẫu sắc ký lực cột oligodT-cellulose Sau mRNA bám lên bề mặt viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, viên bi thu nhận lại qua li tâm mRNA tách khỏi viên bi lại Sau trình tách chiết, nucleic acid tinh siêu li tâm, sắc ký hay điện di 1.4 Siêu li tâm  Siêu li tâm đệm CsCl liên tục: Siêu li tâm gradient liên tục CsCl Dung dịch CsCl đậm đặc ống li tâm tự động hình thành gradient tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy Các nucleotide di chuyển ống tác động lực li tâm, đến vị trí có tỉ trọng tỉ trọng lớp cố định ống Lớp thu nhận lại sau li tâm Kỹ thuật ứng dụng để tinh sách plasmid phage  Siêu li tâm đệm CsCl khơng liên tục: Hỗn hợp nhiều nucleic acid có tỉ trọng biết trước khác đặt lớp CsCl đệm Trong trình li tâm phân tử có tỉ trọng cao tỉ trọng lớp đệm di chuyển xuyên qua lớp đệm Thông thường, ống li tâm gồm nhiều lớp đệm có tỉ trọng tăng dần từ miệng đến đáy ống nghiệm Nucleic acid cần tinh nằm mặt phân cách hai lớp đệm Kỹ thuật sử dụng để tinh lượng lớn phage  Siêu li tâm gradient saccharose Dùng để phân tách thơ hỗn hợp có kích thước chênh lêch nhiều kb Ứng dụng chọn lọc đoạn DNA có kích thước xác định dùng việc thiết lập ngân hàng gen 1.5 Phương pháp sắc kí Sắc kí lực: dùng để tinh mRNA Sắc kí lọc gel: dùng để phân tách nucleic acid nucleotide tự sau q trình tạo mẫu dò đánh dấu Sắc kí trao đổi ion vi cột: để thu hồi lượng nhỏ DNA Sắc kí lỏng hiệu suất cao: dùng tinh oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách đoạn DNA 1.6 Các phương pháp phân tích định tính định lượng thô nucleic acid 1.6.1 Phương pháp định lượng quang phổ kế Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có mẫu Nguyên tắc: Dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm base purin pyrimidine Các bước phương pháp định lượng quang phổ kế: - Đo giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (OD260nm) mẫu đo Xác định nồng độ nucleic acid mẫu dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ là: + 50 µg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi (do mật độ base dày so với cấu trúc sợi đơn) + 40 µg/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn VD: Giá trị OD260nm = 0,9 tương ứng + dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg/ml + dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 0,9 x 40 = 3,6 µg/ml Điều kiện: Chỉ dùng với dung dịch nucleic acid Lưu ý: Để kiểm tra độ dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD 280nm (OD280nm) bước sóng này, protein có mức hấp thụ cao Ngoài ra, protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm nucleic acid làm sai lệch giá trị thật nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid xem (không tạp nhiễm protein) tỷ số: OD 260nm/OD280nm nằm khoảng 1.8 – 1.6.2 Phương pháp điện di Sử dụng phân tích định tính Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc nucleic acid Nucleic acid tích điện âm (do có H3PO4) nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Khả di chuyển (tính linh động) phân tử phụ thuộc vào: + Khối lượng phân tử (số lượng nucleotide hay cặp nucleotide) + Nồng độ chất tạo gel (Kích thước đoạn cần phân tách lớn, nồng độ gel nhỏ) Việc chọn loại gel nồng độ tùy thuộc kích thước trung bình đoạn nucleic acid cần phân tách  Bằng gel agarose Thông dụng nhất, thường dùng phân tách đoạn có kích thước khoảng 0,5 – 20 kb Gel đổ giá thể nằm ngang, điện di thực theo phương nằm ngang Các nucleic acid gel hình tia UV nhờ ethidium bromide Chất gắn xen vào base nucleic acid, tác dụng tia UV phát huỳnh quang Sau điện di, gel hiếu sáng tia UV (ʎ ≈ 300nm), nucleic acid hình dạng vạch đỏ cam Để ước lượng kích thước tình tự nucleic acid gel agarose, người ta sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”:là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết (thang DNA) Người ta thường sử dụng thang DNA thực khuẩn thể lamda thuỷ giải enzyme giới hạn HindIII Quy trình chuẩn bị gel agarose: + Đổ dung dịch agarose đun tan, để nguội vào giá có lắp lược + Rút lược sau gel đặc + Đặt gel vào buồng điện di chứa dung dịch điện di + Buồng điện di nối với nguồn điện  Bằng gel polyacrylamide Dùng tách đoạn có kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base) Thao tác phức tạp agarose Các ứng dụng chủ yếu: + Tinh oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ có chiều dài 500 cặp base Gel đổ thủy tinh, phương điện di phương thẳng đứng  Điện di trường xung Thực khi: + Tách phân tử DNA lớn (>50kb) + Không phân tách gel agarose dù nồng độ tối thiểu 0,4% Nguyên tắc: Dựa vào thay đổi hướng điện trường trình điện di Mỗi lần hướng điện trường thay đổi phân tử DNA phải định hướng lại.Thời gian cần cho việc tự định hướng tùy thuộc kích thước phân tử (phân tử dài  thời gian định hướng lại lớn  di chuyển chậm  Cách thu nhận mẫu sau điện di Phần agarose chứa vạch cắt DNA thu nhận sau khuếch tán từ gel agarose vào dung dịch đệm thích hợp Một “giếng” nhỏ khoét agarose trước vạch DNA “Giếng” bơm đầy dung dịch đệm điện trường tái lập DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dịch đệm thu nhận lại Điện di thực gel agarose đặc biệt (Nusieve hay Seaplaque) có điểm nóng chảy thấp (65oC).Sau điện di, vạch DNA cắt ra, ủ dung dịch đệm nhiệt độ 65oC Khi agarose hoàn toàn tan chảy, DNA thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết tủa III MỘT SỐ VI DỤ TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ ỨNG DỤNG 1.1 Tách DNA từ tươi khơ Terminalia arjuna T Arjuna có chứa hàm lượng cao polysaccharide dính polyphenolcó tác dụng chất ức chế trình phân lập DNA Những chất ức chế kết tủa với DNA, làm giảm chất lượng hiệu suất DNA Vì vậy, DNA phân tách từ phương pháp cũ bị nhiễm vàng, dính nhớt  Cần thêm bước để loại hai chất Bước 1: Phá màng TB màng nhân cách nghiền nitơ lỏng Bước 2: Chuyển phần nghiền vào ống li tâm thêm vào dung dịch đệm rửa (có tác dụng loại polyphenol) Lắc mẫu, quay li tâm, thu phần kết tủa phía + Phần phía polyphenols cần loại bỏ - Thêm dung dịch đệm tách chiết vào, quay li tâm Loại bỏ phần + Dung dịch đệm tách chiết làm biến tính protein (cắt cầu nối disulfite)  protein lên phía  loại bỏ + Dung dịch đệm tách chiết bảo vệ DNA khơng bị biến tính - Thêm dung dịch đệm hòa tan, SDS vào kết tủa + Dung dịch đệm hòa tan giúp DNA khơng bị cắt enzyme giải phóng từ TB - Thêm dung dịch Ammonium acetate 7.5 M Quay li tâm + Ammonium acetate loại bỏ oligonuleotitde ngắnvà nucleotide tự khác (dNTPs) Thu DNA tổng + Tạo tủa protein, giúp loại bỏ protein bám xung quanh DNA - Chuyển lớp dịch phía (chứa nucleic acid) sang ống Bước 3: Bổ sung isopropanol lạnh, quay li tâm Loại dung dịch phía trên, thu acid nucleic kết tủa + Làm kết tủa acid nucleic hàm lượng cao + Ở điều kiện nhiều protein chất khác bị kết tủa DNA nên mẫu bị lẫn tạp -Rửa phần acid nucleic kết tủa lần với ethanol 70% loại bỏ muối, làm phần tủa - Sấy khô nucleic acid cô đặc làm tan dung dịch đệm bảo quản + Dung dịch đệm bảo quản bất hoạt enzyme nuclease, bảo vệ DNA mẫu -Thêm RNaseA ủ 37oC + RNase cắt RNA thành mảnh vụn + RNase có nhiệt độ tối ưu 37oC - Tách chiết với chloroform:isoamyl (24:1) Quay ly tâm Chuyển lớp dịch phía (có chứa DNA) vào ống + Cloroform:isoamyl làm tủa RNA, protein, polysaccharide phức hợp (Chloroform làm biến tính protein, Isoamylalcohol làm giảm bọt, ổn định dung dịch sau ly tâm) + Sau li tâm, dung dịch chia thành lớp: lớp thứ phần dịch có chứa DNA, lớp thứ hai lớp protein, lớp có chứa chloroform tất thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…) -Thêm lần thể tích dịch ethanol lạnh vào ống chứa DNA Quay ly tâm Thu DNA cô đặc + Ethanol lạnh giúp tủa acid nucleic nồng độ cao Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn DNA - Rửa DNA cô đặc với 70% ethanol - Làm khơ DNA (cơ đặc) chân khơng hòa tan dung dịch đệm bảo quản nước cất lần, bảo quản -20 oC sử dụngDNA khơng bị biến tính 1.2 Ứng dụng tách chiết DNA Mọi nghiên cứu sinh học phân tử tiến hành có lượng DNA tinh đáp ứng cho nhu cầu thí nghiệm, tách DNA kỹ thuật vơ hữu ích cho kỹ thuật di truyền 1.2.1 Chuẩn đoán bệnh, rối loạn di truyền Trước kia, việc chuẩn đoán rối loạn di truyền thường dựa tiêu lâm sàn thử nghiệm sinh hóa Tuy nhiên, chi tiêu đa phần xác tốn chi phí cao, đặc biệt dùng để xác định cho người lành mang gen bệnh hay cho thai nhi Sinh học phân tử với tính đặc hiệu cao giải vấn đề Việc phân tích tiến hành nguồn DNA thu từ tế bào đối tượng, mà lượng DNA lấy từ tế bào có nhân Thơng qua kĩ thuật PCR trường hợp gen bệnh tạo dòng, sử dụng làm mẫu dò để phát trực tiếp gen bệnh gen phương pháp Southerm blot Trường hợp đối tượng thai nhi, thực trước sinh, trẻ có nguy bị mắc bệnh DNA tách chiết từ ngoại phôi bì dinh dưỡng (trophoblast) đem phân tích cho kết tình trạng bệnh thai nhi 1.2.2 Sản xuất chất phòng chữa bệnh Việc tách DNA kèm theo kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp, biến nạp, tải nạp sở cho việc sản xuất vacxin chất kháng sinh Với kỹ thuật sinh học phân tử, người ta tạo dòng tồn gen có tham gia vào q trình sản xuất kháng sinh; từ xác định số lượng bước trình sinh tổng hợp sản phẩm bước Kỹ thuật tái tổ hợp DNA có khả giúp tăng xuất tổng hợp kháng sinh góp phân điều chế loại kháng sinh 1.2.3 Liệu pháp gen Liệu pháp gen kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào thể thay cho gen bệnh, đưa gen cần thiết vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt mục tiêu liệu pháp Tạo vectơ tái tổ hợp mang gen cần chuyển  Đưa vectơ virus mang gen lành vào tế bào nuôi cấy  Ghép tế bào chứa gen chuyển vào thể 1.2.4 Pháp y DNA vật chất bền vững, có khả tồn nhiều năm dạng khơ, ngồi thể lâu sau chết, điều kết hợp với kỹ thuật PCR cho phép phân tích lượng vật chất cực nhỏ (DNA lấy từ tóc, máu khơ, ) kể bị phân hủy phần Nhờ so sánh với DNA đối tượng tình nghi, góp phần phá án 1.2.5 Xác định chủng loại, tính đa dạng di truyền Các mẫu cần xác định tính đa dạng di truyền tiến hành tách DNA sau phân tích đa dạng di truyền thị RAPD – PCR Việc phân tích thi DNA cho phép đánh giá cách xác mức độ đa dạng di truyền loài, xác định khoảng cách di truyền đặc trưng cá thể, quần thể Ngoài việc phân tích DNA giúp xác định xác chủng, loại lồi sinh vân có đặc điểm hình thái, sinh lí giống 1.2.6 Chọn giống trồng vật nuôi Trong phương phpas chọn giống cổ điển, tiêu chọn lọc thuộc kiểu hình, hình thái sinh hóa Các tiêu thương không ổn định chịu ảnh hưởng mạnh yếu tố môi trường Việc sử dụng thành phần kiểu gen, DNA mảker để chọn giống cho phép bỏ qua biến động không di truyền, đồng thời theo dõi biến động di truyền không biểu kiểu hình nhờ chọn lóc giống có đặc tính ưu điểm bậc C CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP VẬN DỤNG Câu 1: Hãy giải thích tại DNA sinh vật có nhân thường bền vững nhiều so với loại RNA? TL: DNA sinh vật có nhân thường bền vững RNA vì: + DNA cấu tạo từ hai mạch xoắn quanh trục, RNA cấu tạo từ mạch + Hai mạch xoắn kép DNA có liên kết Hydro bổ sung cho + DNA thường liên kết với protein nên bảo vệ tốt + DNA phân bố nhân nên khơng có enzyme phân hủy chúng, RNA thường tồn ngồi nhân, nơi có nhiều enzyme phân hủy nucleic acid Câu 2: Nhiệt độ mà đó phân tử DNA sợi kép bị tách thành hai mạch đơn gợi nhiệt độ nóng chảy (điểm chảy) Hãy cho biết DNA có cấu trúc điểm chảy cao ngược lại? TL: + Những phân tử DNA dài nhiệt độ nóng chảy cao + Phân tử DNA có nhiều nucleotide loại G loại C điểm chảy cao Ngược lại, đoạn DNA có nhiều nucleotide loại A Loại C nhiệt độ nóng chảy thấp Câu 3: Vì DNA nhân có kích thước lớn có thể xếp gọn nhân có kích thước vơ hạn chế? TL: + Các phân tử DNA nén chặt thể tích hạn chế nhân, việc nén chặt thể nhiều mức dộ Thấp nucleosome, chromatin, vùng xếp cuộn nhiễm sắc thể + Ngoài có protein liên kết với DNA có vài trò nén chặt DNA nhờ liên kết ion nhánh bên mang điện tích âm với histone với nhóm phosphate mang điện tích dương DNA + Việc xếp gọn DNA vào nhân không gây hạn chế khả tiếp xúc DNA với protein DNA quấn quanh lõi cấu tạo từ nhiều histone nên dù nén lại, phần lớn bề mặt DNA tiếp xúc với protein khác Câu 4: Nêu số đặc điểm cấu tạo DNA cho thấy DNA ưu việt RNA vai trò vật chất mang thơng tin di truyền TL: + RNA có thành phần đường ribose khác với thành phần đường DNA deoxyribose Đường deoxyribose khơng có gốc –OH vị trí C2 Đay gốc hóa học phản ứng mạnh mẽ có tính ưa nước  RNA bền DNA môi trường nước + Thành phần base nito RNA Uracil đucợ thay thymine DNA Về cấu trúc hóa học T khác U bổ sung thêm gốc methyl Đây gốc kỵ nước, kết hợp với cấu trúc dạng sợi kép giúp DNA bền RNA + DNA thường có cấu trúc dạng sợi kép giúp chế sửa chữa DNA diễn dễ dàng hơn, vật chất di truyền bền vững bị điến đổi RNA + Base nito U cần biến đổi hóa học để biến đổi thành C, T cần đến hai biến đổi hóa học biến đổi thành C  DNA khó bị biến đổi đột biến RNA  DNA có khả mang thơng tin di truyền tốt sơ với RNA Câu 5: Vì qua trình phát triển, hệ gen vi sinh vật nhân sơ không có dấu hiệu bị lão hóa, đó hện gen sinh vật nhân thực lại có xu hướng ngắn đi? TL: + Hệ gen vi sinh vật nhân sơ plasmid có dạng vòng nên q trình chép khơng bị ngắn khơng bị lão hóa sau nhiều lần nhân đơi, sinh sản +Trong đó, hệ gen sinh vật nhân thực lại dạng thắng, nên sau lần nhân đơi có xu hướng ngắn đi, đó, sau khoảng thời gian sinh trưởng phát triển, sinh vật nhân thực có xu hướng bị lão hóa Câu 6: Vì q trình tách chiết DNA phải đảm bảo thiết bị, hóa chất phải vô trùng tuyệt đối không đụng tay trần vào thiết bị? TL: Trong trình tách chiết DNA phải thực điều kiện vơ trùng kích thước phân tử DNA nhỏ, quan sát mắt thường Bên cạnh đó, thiết bị tách chiết bị nhiễm trùng dẫn đến sản phẩm acid nucleic tách bị lẫ acid nucleic vi sinh vật bị nhiễm làm cho sản phẩm tinh loại bỏ acid nucleic vi sinh vật khỏi sản phẩm Câu 7: Trong trình tách DNA cần phải ý điều gì? TL: + Thu nhận lượng DNA đủ lớn tinh + Các phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học (phân tử bị gãy nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ + Tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào + Phân tử DNA có kích thước lớn thao tác cần tránh tác nhân học hay hóa học mạnh làm đứt gãy phân tử Câu 8: Làm để loại bỏ protein khỏi sản phẩm? TL: Các protein loại khỏi mẫu qua xử lí phenol chloroform li tâm Câu 9: Tách chiết acid nucleic có vai trò nghiên cứu sinh học phân tử? TL: + Tất nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử tiến hành có lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh + Tạo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu sinh học phân tử, phân loại đa dạng di truyền KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình tìm kiếm tổng hợp thông tin từ nhiều nguồn tài liệu sinh học phân tử, kỹ thuật di truyền, sơ sở đó, chuyên đề tóm tắt lại số kiến thức loại acid nucleic trình tách chiết, tinh kèm theo ứng dụng quy trình thực tế Bên cạnh chun đề bổ sung số câu hỏi thảo luận nhằm giúp người đọc hiểu sâuvà vận dụng kiến thức trình bày Kiến nghị Trong khoảng thời gian hạn chế, chun đề khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp để đề tài hoàn thiện TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 311tr Phạm Thành Hổ (2008), Di truyền học, NXB Giáo dục, 619tr Phạm Thành Hổ (2015), Sinh học đại cương, NXB Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 386tr Nguyễn Như Hiền (2014), Sinh học tế bào, NXB Giáo dục Việt Nam, 255tr Campbell & Reece, Nhà xuất giáo dục Việt Nam dịch xuất năm 2011 ... hứng thú sinh học phân tử tách chiết DNA kèm theo ứng dụng chúng thực tiễn, chuyên đề “ Tìm hiểu trình tách chiết DNA số ứng dụng thực tiễn thực Mục đích đề tài Tổng hợp số kiến thức chung DNA, ... gene ứng dụng vào thực tiễn đời sống Trong chương trình sinh học phổ thông, kiến thức DNA trừu tượng, chủ yếu cung cấp khái quát cấu trúc, chưa sâu vào ứng dụng Nhằm giúp em học sinh nâng cao hiểu. .. động DNA Quy trình, phương pháp tách chiết DNA kèm theo ưu, nhược điểm phương pháp Chỉ số ứng dụng thực tiễn Giới thiệu số câu hỏi, tập vận dụng chuyên sâu B NỘI DUNG I KIẾN THỨC CƠ BẢN VỀ NUCLEIC