Phân Lập Và Tuyển Chọn Lactobacillus Sp. Từ Thực Vật Ủ Chua Có Tiềm Năng Sản Xuất Probiotic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN LACTOBACILLUS sp TỪ THỰC VẬT Ủ CHUA CĨ TIỀM NĂNG SẢN XUẤT PROBIOTIC Ngành: Cơng nghệ SH-TP-MT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng dẫn : TS Hoàng Quốc Khánh Sinh viên thực : Trần Quang Huy MSSV: 1311101070 Lớp: 13DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu Các tài liệu tham khảo có nguồn gốc xác thực Ngƣời thực Trần Quang Huy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hồng Quốc Khánh, ngƣời tận tình hƣớng dẫn,chia sẻ khó khăn chỉnh sửa đồ án cho em thời gian em thực đồ án viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời động viên giúp em có thêm động lực để hoàn thành đồ án Xin cảm ơn thầy Ngơ Đức Duy, nhiệt tình hƣớng dẫn giúp đỡ em trình định danh sinh học phân tử Xin cảm ơn anh, chị đồng nghiệp viện sinh học nhiệt đới giúp đỡ tơi q trình thực đồ án Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, tạo điều kiện thuận lợi cho em thực thí nghiệm để hồn thành đồ án Xin cảm ơn trƣờng ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung thầy khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Môi Trƣờng nói riêng tận tình dạy dỗ, cung cấp kiến thức vững vàng cho em bốn năm học tập trƣờng Cuối xin cảm ơn ba mẹ sinh cho điều kiện để học tập để trở thành ngƣời nhƣ hôm Xin chân thành cảm ơn! Ngƣời thực Trần Quang Huy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Phiếu giao đề tài ĐATN Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan rau lên men 1.2 Tổng quan probiotic .4 1.3 Lịch sử nghiên cứu probiotic 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp 1.4.1 Chi Lactibacillus 1.4.2 Chi Bifidobacterium 10 1.4.3 Chi Sacharomyces 10 1.4.4 Chi Bacillus 11 1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic .13 1.5.1 Chi, loài chủng probiotic .14 1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm probiotic 14 I Đồ án tốt nghiệp 1.5.3 Nguồn phân lập probiotic 15 1.5.4 Probiotic an toàn 15 1.6 Vi khuẩn lactic 17 1.6.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 17 1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại 17 1.6.3 Chi Lactobacillus .18 1.6.4 Quá trình lên men lactic 22 CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 24 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy .25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .27 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn 27 2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái khuẩn lạc .27 2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả sinh acid lactic .27 2.2.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram 27 2.2.5 Phƣơng pháp khảo sát khả di động 28 2.2.6 Phƣơng pháp xác định kiểu hô hấp 28 2.2.7 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính catalase 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính protease 29 II Đồ án tốt nghiệp 2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính amylase 30 2.2.10 Phƣơng pháp xác định khả kháng khuẩn .30 2.2.11 Phƣơng pháp định danh sinh học phân tử .31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua 33 3.2 Đặc điểm sinh học chủng LAB đƣợc tuyển chọn 36 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng CP1 MC3 36 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng CP1 MC3 37 3.3 Phổ kháng khuẩn hai chủng lactic nghiên cứu 40 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 sinh học phân tử 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo Phụ lục III Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VK Vi khuẩn DC Đối chứng G- Gram âm G+ Gram dƣơng KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MT Môi trƣờng MRS De Man - Rogosa – Sharpe ST Sinh trƣởng VSV Vi sinh vật IV Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các vi sinh vật có tiềm probiotic 12 Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm 19 Bảng 3.1 Kết hình thái khuẩn lạc 11 chủng đƣợc phân lập 32 Bảng 3.2 Kết xác định hình thái tế bào 34 Bảng 3.3 Tổng hợp đặc điểm sinh lý sinh hóa hai chủng nghiên cứu 38-39 Bảng 3.4 Kết thử phổ kháng khuẩn hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 41 V Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Kim Chi số loại rau củ lên men truyền thống Hình 1.2 Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic FAO & WHO 16 Hình 1.3 Quá trình lên men lactic 22 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc số mẫu sau làm 33 Hình 3.2 Định tính aicid lactic thuốc thử Uphemen 35 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng CP1 nhuộm Gram kính hiển vi x100 36 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng MC3 nhuộm Gram kính hiển vi x100 36 Hình 3.5 Cây phát sinh loài hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 lồi có liên quan 43 VI Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngày nay, với phát triển kinh tế xã hội, chất lƣợng sống không ngừng đƣợc nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe ngƣời ngày đƣợc trọng Do vậy, việc tạo chế phẩm sinh học nhằm cải thiện tăng cƣờng sức khỏe ngƣời đƣợc tạo ngày nhiều Một chế phẩm sinh học probiotic, chúng đƣợc tạo từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa ngƣời Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế mang lại nhiều ảnh hƣởng tích cực sức khỏe ngƣời, thơng qua đặc tính probiotic vốn có chúng Điển hình điều trị chứng bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, khắc phục số hạn chế việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose sữa uống bệnh nhân khơng có khả dung nạp lactose sữa Bên cạnh đó, chúng có khả ảnh hƣởng đến hoạt tính biến dƣỡng nhƣ đồng hóa cholesterol, tạo vitamin giải phóng enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu chất dinh dƣỡng cần thiết, khử chất có khả gây ung thƣ hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả đề kháng cho thể vật chủ, Những chủng vi sinh vật probiotic thƣờng đƣợc nghiên cứu ứng dụng chủ yếu vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có đặc tính ƣu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ vật ni Những đặc tính là: khả sống sót phát triển tốt điều kiện bất lợi đƣờng tiêu hóa ngƣời nhƣ acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng có khả sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl,… tạo môi trƣờng bất lợi, từ ức chế vi sinh vật gây bệnh thiết lập cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột Bên cạnh đó, chúng có khả sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy trình tiêu hóa hấp thu chất thể vật chủ Trang Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Tổng hợp đặc điểm sinh lý sinh hóa hai chủng nghiên cứu Đặc điểm hình thái, Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Chi Lactobacillus Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 Hình dạng Que dài Que dài Que dài Sắp xếp tế bào 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn G+ G+ Tế bào Tính chất Gram G+ Khuẩn lạc Hình dạng Tròn lồi Tròn lồi Tròn lồi Màu sắc Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Kích thƣớc Tùy lồi 1,0-2,0 mm 1,0-2,0 mm Vi hiếu khí Vi hiếu khí Đồng hình Dị hình - - - - tính - - - tính - - - Quan hệ với Vi hiếu khí oxy Lên men lactic Tùy loài Khả tạo bào tử Khả di động Hoạt catalase Hoạt Protease Trang 39 Đồ án tốt nghiệp 10 Lên men đƣờng Glucose + + + Galactose + + + Maltose + + + Manitol Tùy loài + + Lactose + + + Saccharose + + + Dextrin Tùy loài - - Sorbitol Tùy lồi - - Ghi chú: „-„ âm tính ; „+‟ dƣơng tính Nhƣ nghiên cứu trƣớc đó, chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 có khả đối kháng lại với Ba.subtilis, tức có khả kháng khuẩn, nhiên thực phẩm nhƣ mơi trƣờng sống ngày có chứa nhiều vi sinh vật xâm nhập vào hệ tiêu hóa gây bệnh cho ngƣời động vật Chính vậy, chủng probiotic có phổ kháng khuẩn rộng, tức ức chế đƣợc nhiều loại vi sinh vật khác đƣợc quan tâm trọng nhiều việc sản xuất chế phẩm probiotic Do đó, để đƣợc sử dụng probiotic, chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 phải có phổ kháng khuẩn rộng 3.3 Phổ kháng khuẩn hai chủng lactic nghiên cứu Để tìm hiểu khả này, sử dụng phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch, khảo sát hoạt tính đối kháng hai chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu với chủng vi khuẩn kiểm định chuyên gây bệnh đƣờng ruột cho ngƣời động vật Hoạt tính Trang 40 Đồ án tốt nghiệp ức chế đƣợc đánh giá thơng qua kích thƣớc vành kháng khuẩn (( D-d)/2, mm) Kết đƣợc thể bảng 3.4 Từ bảng 3.4, hai chủng có khả ức chế Gram âm Gram dƣơng Nhờ có tồn chúng ruột ngƣời gây bất lợi cho vi khuẩn gây bệnh gây thối đƣờng ruột Khả kháng khuẩn mà ngƣời thực đo đƣợc không khác biệt với chủng Lactobacillus phân lập đƣợc từ phân trẻ em thí nghiệm Hồng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2011) [3], có khác biệt kích thƣớc vành kháng khuẩn Đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có khả ức chế vi khuẩn Salmonella Từ kết cho thấy hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 tạo hợp chất kháng khuẩn gồm acid hữu hợp chất kháng khuẩn khác Các hợp chất kháng khuẩn bacteriocin, hydroxy peroxyde, diacetyl, reutorin Chính thành phần tạo khả ức chế vi khuẩn thị dịch ly tâm vi khuẩn Khi xét tỷ lệ ức chế vi khuẩn thị, ngƣời thực nhận thấy chủng Lactobacillus CP1 có khả kháng mạnh kháng đƣợc nhiều vi khuẩn thị chủng Lactobacillus MC3, đặc biệt ức chế Salmonella Khi tiến hành đo vòng kháng khuẩn đĩa peptri, phƣơng pháp đo thô sơ, dựa mắt thƣờng dùng thƣớc mm để đo Kết có độ tin cậy khơng cao, chƣa có độ nhạy kết quả, ngồi cần đƣợc chuẩn hóa độ dày mơi trƣờng, nồng độ vi khuẩn thị thể tích dịch ly tâm cho vào giếng thạch Trang 41 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Kết thử phổ kháng khuẩn hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 Trung bình bề rộng vành kháng Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm Khả gây định bệnh [4] E.coli Viêm khuẩn ,mm khuẩn [3] Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus CP1 MC3 CP1 MC3 2,33 2,10 ++ ++ 2,83 2,50 ++ ++ 3,17 ++ - 3,67 3,01 ++ ++ ruột,tiêu chảy Pseudomonas Viêm màng tim Viêm đƣờng hô hấp, Salmonella Tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn S.aureus Gây ngộ độc 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 sinh học phân tử Để xác định xác tên lồi chủng Lactobacillus CP1 MC3, ngƣời thực gửi chủng đến phòng xét nghiệm cơng ty Nam Khoa- TP Hồ Chí Minh Kết định danh đến lồi phƣơng pháp giải trình tự gen 16sRNA tra cứu BLAST SEARCH Kết hợp với nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đặc điểm sinh lý-sinh hóa đến kết luận kết giải trình tự gen xác có độ tin cậy cao Trang 42 Đồ án tốt nghiệp Kết giải trình tự gen 16s chủng Lactobacillus CP1 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGA ACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTG GTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGA TGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCG GCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTC ACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGA GACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACG AAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC Kết luận: Chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus plantarum strain LPL-1 với độ tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự gen 16s chủng Lactobacillus MC3 ATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCT ATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGC GATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCAT ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAA CACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTA TGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGT GCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAA ACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACT CGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGT GCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG AGGAGTACGACCGCAAGGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGT Kết luận: Chủng Lactobacillus MC3 Lactobacillus fermentum strain 17-2b với độ tƣơng đồng 100% Trang 43 Đồ án tốt nghiệp 40 53 CP1 99 Lactobacillus plantarum strain LPL-1 Lactobacillus plantarum strain SRCM102022 Lactobacillus plantarum strain TMW 1.1623 Lactobacillus acidophilus partial Lactobacillus fermentum strain 17-2b MC3 Leuconostoc lactis strain CAU1761 10 Hình 3.5 Cây phát sinh loài hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 lồi có liên quan Trang 44 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ mẫu thực phẩm rau củ lên men, ngƣời thực thu đƣợc 11 chủng VK sinh acid chọn đƣợc chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 có đặc điểm: thuộc chi Lactobacillus, tế bào hình que, Gram dƣơng, vi hiếu khí, lên men lactic đồng hình, catalase âm tính, khơng tạo hoạt tính protease amylase, lên men nhiều nguồn đƣờng khác Cả hai chủng có khả kháng khuẩn với Ba.subtilis, phổ kháng khuẩn rộng với vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột, đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có khả kháng với Salmonella, vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nguy hiểm Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa, kết hợp với kết định danh đến lồi Dựa vào khóa phân loại Bergey‟s (1986) kết luận chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus plantarum LPL-1, chủng Lactobacillus MC3 Lactobacillus fermentum 17-2b Qua kết nghiên cứu trên, ngƣời thực nhận thấy rằng, chủng Lactobacillus CP1và chủng Lactobacillus MC3 mang đặc điểm sinh học có tiềm probiotic Do sử dụng để làm probiotic cho ngƣời động vật 4.2 Kiến nghị Xác định chất yếu tố đối kháng LAB với vi khuẩn kiểm định Xác định thêm khả tồn chủng LAB hệ thống tiêu hóa Trang 45 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Thị Ái Liên (2012), Nghiên cứu đặc điểm vai trò lactobacillus chế phẩm probiotic., Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Đỗ Quế Mi Hƣơng (2009), Thử nghiệm so sánh phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm probiotic., Đồ án tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Hoàng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2012), "Phân lập, định danh xác định chủng Lactobacillus có tiềm probiotic từ phân trẻ sơ sinh.", Tạp Chí Phát Triển Khoa Học Công Nghệ 14, tr 62-76 Trần Linh Thƣớc (2013), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm., NXB Giáo Dục Việt Nam, TP Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân (2007), Bacilulus clausii vai trò probiotics điều trị tiêu chảy, Hội thảo chuyên đề, Hội nhi khoa Tp HCM Tài liệu tiếng anh Guarner F Schaafsma G J (1998), "Probiotics.", International Journal of Food Microbiology 39, tr 237–238 Minelli E B and Benini A (2008), "Relationship between number of bacteria and their probiotic effects.", Microbial Ecology and Health Diseases 20, tr 1651-2235 Cardoso E M and Miura E Trois L (2008), "Use of probiotics in HIVinfected children: a randomized double-blind controlled study", Journal of Tropical Pediatrics 54, tr 19-24 Chill D and Maida N Carr F J (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical Reviews in Microbiology 28, tr 281–370 Trang 46 Đồ án tốt nghiệp 10 Cencic A and Chingwaru W (2010), " Antimicrobial agents deriving from indigenous plants", RPFNA 2, tr 83-92 11 Stiles J Chumchalova J, Josephsen J and Plockova M, (2004), "Characterization and purification of acidocin CH5, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus CH5", Journal of Applied Microbiology 96, tr 1082-1089 12 S K DASH (2009), "Selection criteria for probiotics.", Focus on Dietary fibres - Pre/Probiotics 20(3), tr 26-28 13 FAO/WHO (2002), Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Working Group Report,, London, Ontario 14 Fuller R (1991), "Probiotics in human medicine", Gut 32, tr 439–442 15 Guarner F and Schaafsma G J (1998), "Probiotics", International Journal of Food Microbiology, 39, tr 237–238 16 Antoine J M Kalliomaki M, Herz U, Rijkers G T, Wells J M and Mercenier A, ( 2010), "Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: prevention and management of allergic diseases by probiotics", Journal of Nutrition 140, tr 713S-721S 17 Marcelino Kongo (2013), Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and Livestock Purposes, Tập 1, InTech, Janeza Trdine 9, 51000 Rijeka, Croatia, tr.202-204 18 Kumar A Kumar M, Nagpal R, Mohania D, Behare P, Verma V, Kumar P, Poddar D, Aggarwal P K, Henry C J, Jain S and Yadav H, (2010), "Cancerpreventing attributes of probiotics: an update.", International Journal of Food Science and Nutrition 61(5), tr 473-496 19 Laparra J M Sanz Y (2010), "Interactions of gut microbiota with functional food components and Research 61, tr 219–225 Trang 47 nutraceuticals.", Pharmacological Đồ án tốt nghiệp 20 Levin R (2011), "Probiotics-the road map", International Journal of Probiotics and Prebiotics 6, tr 133-40 21 Lilley D M and Stillwell R H (1965), " Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms", Science 147, tr 747–748 22 Longdet I Y, Kutdhik R J Nwoyeocha I G (2011), "The probiotic efficacy of Lactobacillus casei from human breast milk against Shigellosis in Albino rats", Advances in Biotechnology and Chemical Processes 1, tr 12-16 23 Maity T K Misra A K (2009), "Probiotics and human health: Synoptic review", Brazilian Journal of Food Agriculture 9(8), tr 1778-1796 24 Metchnikoff E (1907), The prolongation of life, London, UK: William Heinemann 25 Nissen L cộng (2009), " Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp strains: a functional study in the small intestinal cell model.", International Journal of Food Microbiology 135, tr 288-294 26 Zoumpopoulou G Papadimitriou K, Foligne B, Alexandraki V, Kazou M, Pot B D and Tsakalidou E, (2015), "Discovering probiotic microorganisms: in vitro, in vivo, genetic and omics approaches", Frontiers in Microbiology 6, tr 58 27 Parvez S cộng (2006), "Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976", World Journal of Microbiology and Biotechnology 22, tr 455-459 28 Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature", Int J Environ Res Public Health 11, tr 4745-4767 29 Vaughan R B (1965), "The romantic rationalist: A study of Elie Metchnikoff", Medical History 9, tr 201–215 Trang 48 Đồ án tốt nghiệp 30 Chang C J Yao T C, Hsu Y H and Huang J L, (2009), "Probiotics for allergic diseases: Realities and myths", Pediatrics, Allergy and Immunology 21(6), tr 900-919 31 Sachi haruguChi Ayaka iuChi , Wiyada Mongkolthanaruk , Jiro ariMa , Mitsutoshi nagase , cộng (2012), "Characterization of Novel Amylase from Amylolytic Lactic Acid Bacteria Pediococcus ethanolidurans Isolated from Japanese Pickles (Nuka-zuke)", Food Sci Technol Res 18(6), tr 861 – 867 32 Anupama Gupta (2015), Characterization of potentially active new probiotic strains isolated from different sources and to study their prospects as nutraceutical agents, University of Horticulture and Forestry, Nauni-Solan 33 F and De Vuyst Leroy, L, (2004), "Functional lactic acid bacteria starter cultures for the food fermentation industry.", Trends in Food Science and Technology 15, tr 67-78 Tài liệu mạng 34 http://microbeonline.com/gram-staining-principle-procedure-results/ 35 https://microbiologyinfo.com/catalase-test-principle-uses-procedure-resultinterpretation-with-precautions/ 36 https://www.hccfl.edu/media/680327/starch%20hydrolysis.pdf Trang 49 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 1 Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn vi sinh vật phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch chủng CP1 1: Ba.subtilis; 2: Pseudomonas;3: Salmonella;4: E.coli; 5:S.aureus Kết thử nghiệm khả sinh acid lactic làm tan CaCO3 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Kết giải trình tự Trình tự gen so sánh chủng MC3 với chủng ngân hàng gen NCBI Lactobacillus fermentum 17-2b, mức độ tƣơng đồng 98% Query 14 GCTAGTTCGTGGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 73 |||||| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct GCTAGTACAT-GCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 59 Query 74 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 133 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 119 Query 134 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA 193 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA 179 Query 194 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT 253 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT 239 Query 254 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC 313 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 240 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC 299 Query 314 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC 373 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 300 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC 359 Query 374 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA 433 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 360 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA 419 Query 434 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 493 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 420 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 479 Query 494 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 553 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 480 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 539 Đồ án tốt nghiệp Trình tự gen so sánh chủng CP1 với chủng ngân hàng gen NCBI Lactobacillus plantarum LPL-1, mức độ tƣơng đồng 100% Query GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960681 1960622 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT Query GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA 61 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960621 1960562 GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA Query CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA 121 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960561 1960502 CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA Query TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 181 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960501 1960442 TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG Query GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC 241 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960441 1960382 GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC Query CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG 301 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960381 1960322 CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG Query GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG 361 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960321 1960262 GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG Query AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG 421 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960261 1960202 AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG 480 Đồ án tốt nghiệp ... nguồn thực vật ủ chua, tiềm sản xuất probiotic Mục tiêu đề tài: Phân lập khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn thực vật ủ chua Nhiệm vụ đề tài: Phân lập đƣợc 01 chủng Lactobacillus. .. phân lập probiotic Nguồn phân lập có nguồn gốc từ ngƣời nhƣ ruột già, ruột non, sữa mẹ; nguồn gốc từ động vật, thực phẩm nhƣ sữa thực phẩm lên men Các chủng probiotic đƣợc phân lập từ ngƣời có. .. chúng có khả sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy q trình tiêu hóa hấp thu chất thể vật chủ Trang Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ lí nên ngƣời thực chọn đề tài “ Phân lập tuyển chọn Lactobacillus sp từ