1 Tổng quan PCR 1.1 khái niệm - PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, dịch vài sách Phản ứng chuỗi trùng hợp có sách gọi "phản ứng khuếch đại gen" PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống E coli hay nấm men PCR sử dụng nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đốn bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống 1.2 Nguyên tắc - Kỹ thuật tổng hợp PCR thể tuân thủ nguyên tắc ché DNA thể : Đoạn DNA cần nhân phải mở xoắn thành mạch đơn, cần có cặp mồi ( mồi xuôi, mồi ngược),cần nguyên liệu , điều kiện môi trường thích hợp enyme DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzyme DNA olymerase chịu nhiệt hệ thống điều nhiệt cho giai đoạn phản ứng tổng hợp với đoạn mồi thiết kế chủ động nhờ kĩ thuật PCR mà với lượng nhõ DNA ban đầu thu nhận lượng DNA cần thiết để tiến hành thí nghiệm DNA - Một phản ứng PCR chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mội chu kỳ gồm giai đoạn:giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp giai đoạn kéo dài chuỗi 1.3 Thực nghiệm PCR - PCR dùng để khuếch đại đoạn DNA ngắn, xác định phần Đó gen đơn, hay phần gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR copy mảnh DNA ngắn, lên đến 10kb (kb = kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base) DNA sợi đơi, đo với DNA bổ sung … gọi cặp base Một vài phương pháp copy mảnh kích thuớc lên đến 40kb nhiều so với nhiễm sắc thể DNA tế bào eukaryote – ví dụ tế bào người chứa tỉ cặp base - Như thực hành nay, PCR cần nhiều thành phần Những thành phần là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNApolymerase để xây dựng DNA - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase - Phản ứng PCR thực chu kỳ nhiệt Đây máy đun nóng làm nguội ống phản ứng nhiệt độ xác cho phản ứng Để ngăn ngừa bay hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy máy PCR đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng ít, người ta cho lớp dầu (natural oil) lên bề mặt hỗn hợp phản ứng Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD 1.4 Ứng dụng PCR - Vân tay di truyền :Vân tay di truyền kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định người cách so sánh DNA người với mẫu có, ví dụ như, mẫu máu thu từ trường vụ án so sánh di truyền với mẫu máu người tình nghi Có thể cần lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc Về lý thuyết cần mạch DNA đơn đủ Kiểm tra huyết thống Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments (1) Father (2) Child (3) Mother The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint - - - - Mặc dù kết "dấu vân tay" (trừ cặp song sinh giống hệt nhau), mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ anh chị em ruột, xác định từ hai nhiều dấu vân tay di truyền, sử dụng để thử nghiệm quan hệ cha (Hình 4) Một biến thể kỹ thuật sử dụng để xác định mối quan hệ tiến hóa sinh vật Chẩn đoán bệnh di truyền Phát bệnh di truyền gen định q trình lâu dài khó khăn, rút ngắn đáng kể cách sử dụng phương pháp PCR Mỗi gen câu hỏi dễ dàng khuếch đại qua PCR cách sử dụng loại sơn lót thích hợp sau trình tự để phát đột biến Bệnh virus, phát phương pháp PCR thơng qua khuếch đại DNA virus Phân tích sau nhiễm trùng, từ vài ngày đến vài tháng trước triệu chứng thực tế xảy Chẩn đoán sớm cho bác sĩ dẫn quan trọng điều trị Tách dòng gene Nhân gen khơng nên nhầm lẫn với nhân toàn sinh vậtmơ tả q trình lập gen từ sinh vật sau chèn vào sinh vật khác PCR thường sử dụng để khuếch đại gen, mà sau chèn vào vector (vector phương tiện chèn gen vào thể) plasmid (một phân tử DNA vòng) (Hình 5) DNA sau chuyển thành sinh vật khác nhau, nơi gen sản phẩm nghiên cứu chặt chẽ Thể gen nhân (thể gen có nghĩa để sản xuất protein mà xác định sản xuất) cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men Figure 5: Cloning a gene using a plasmid (1) Chromosomal DNA of organism A (2) PCR (3) Multiple copies of a single gene from organism A (4) Insertion of the gene into a plasmid (5) Plasmid with gene from organism A (6) Insertion of the plasmid in organism B (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B Gây đột biến điểm - Đột biến cách để làm thay đổi trình tự nucleotide DNA Có tình quan tâm đến biến đổi (thay đổi) chuỗi ADN định, ví dụ, đánh giá chức gen trong ống nghiệm tiến hóa protein Đột biến đưa vào trình tự DNA chép theo hai cách khác trình PCR Đột biến trang web hướng cho phép người thử nghiệm để giới thiệu đột biến địa điểm cụ thể sợi DNA Thông thường, đột biến mong muốn kết hợp mồi sử dụng cho chương trình PCR Đột biến ngẫu nhiên, mặt khác, dựa việc sử dụng polymerase dễ bị lỗi trình PCR Trong trường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị trí tính chất đột biến khơng thể kiểm sốt Một ứng dụng đột biến ngẫu nhiên để phân tích mối quan hệ cấu trúc chức protein Bằng cách thay đổi cách ngẫu nhiên chuỗi DNA, người ta so sánh protein kết với ban đầu xác định chức phần protein Phân tích mẫu DNA cổ - Sử dụng PCR, trở thành phân tích ADN hàng ngàn năm tuổi Kỹ thuật PCR sử dụng thành công động vật, chẳng hạn voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, DNA người, ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích xác ướp Ai Cập đến việc xác định Sa hoàng Nga 1.5 Ưu, nhược điểm phương pháp PCR - Ưu điểm : Thời gian thực nhanh, cần khuếch đại trình tự đáng quan tâm Thực đơn giản tốn ( thực đồng thời ) Yêu cầu độ tinh mậu không cao - nhược điểm : cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch có đoạn mồi phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại kích thước DNA cần khuếch đại không vượt 3kb Khả ngoại nhiễm lớn ( thao tác nhiều lần) Sai sót sử dụng E-Taq-plymerase khoang 104 ( sai sót cho lần chép) ... đoán sớm cho bác sĩ dẫn quan trọng điều trị Tách dòng gene Nhân gen không nên nhầm lẫn v i nhân tồn sinh v tmơ tả q trình cô lập gen từ sinh v t sau chèn v o sinh v t khác PCR thường sử dụng để... đại qua PCR cách sử dụng loại sơn lót thích hợp sau trình tự để phát đột biến Bệnh virus, phát phương pháp PCR thông qua khuếch đại DNA virus Phân tích sau nhiễm trùng, từ v i ngày đến v i tháng... sử dụng để khuếch đại gen, mà sau chèn v o vector (vector phương tiện chèn gen v o thể) plasmid (một phân tử DNA v ng) (Hình 5) DNA sau chuyển thành sinh v t khác nhau, nơi gen sản phẩm nghiên