Xác định gen dehydrin kiểu SKn của cây sồi Nhật Bản (Fagus cretana Blume) bằng phương pháp in silico

Các dehydrin được xếp vào nhóm II của họ LEA. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên cứu in silico, chúng tôi đã xác định được một gen DHN của cây sồi Nhật Bản từ tập hợp các EST của loài này.

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG XÁC ĐỊNH GEN Dehydrin KIỂU SKn CỦA CÂY SỒI NHẬT BẢN (Fagus cretana Blume) BẰNG PHƯƠNG PHÁP in silico Cao Phi Bằng Trường Đại học Hùng Vương TÓM TẮT Các dehydrin xếp vào nhóm II họ LEA Chúng đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ tế bào Trong cơng trình này, nhờ sử dụng phương pháp nghiên cứu in silico, xác định gen DHN sồi Nhật Bản từ tập hợp EST lồi Kết phân tích motif bảo thủ phân tích phả hệ gen thuộc nhóm SKn FcDHN có tính axit có độ ưa nước cao Nghiên cứu xây dựng mơ hình 3D cho thấy protein FcDHN có cấu trúc xoắn a lưỡng cực, cấu trúc có vai trò quan trọng chế bảo vệ tế bào dehydrin Từ khóa: Dehydrin (DHN), Fagus cretana, đặc điểm gen, xác định gen, in silico, phả hệ MỞ ĐẦU Cây sồi Nhật Bản (Fagus crenata) loài ưu đồng thời thường loài tạo nên phần lớn sinh khối khu rừng rụng thuộc vùng khí hậu ơn đới Nhật Bản (Takahashi et al., 2.000; Masaki et al., 2008) Hơn nữa, khu rừng sồi Nhật Bản giúp bảo vệ đất rừng trì đa dạng sinh học (Watanabe et al., 2012) Dehydrin (DHN) mã hóa protein thuộc nhóm II họ Late Embryogenesis Abundant protein (LEA) (Close, 1996) DHN đóng vai trò quan trọng trả lời thích nghi thực vật với điều kiện bất lợi mơi trường, đặc biệt vai trò bảo vệ tế bào trình nước (Rorat, 2006; Hanin et al., 2011) Các protein DHN cho có vai trò quan trọng chồi ngủ trình luyện lạnh gỗ (Rorat, 2006; Rinne et al., 2010) Các DHN có khối lượng phân tử biến đổi phạm vi rộng khoảng 9-200kD, chúng đặc trưng có mặt trình tự bảo thủ giàu lysine gồm có 15 amino axit, EKKGIM (E/D)KIKEKLPG, có tên phân mảnh K (Rorat, 2006; Hanin et al., 2011) Các DHN có motif đặc trưng khác phân mảnh Y giàu tyrosine ( (V/T)D (E/Q)YGNP) phân mảnh S giàu serine (được hình thành từ tập hợp 4-10 serine) Dựa vào cấu trúc, DHN chia thành năm phân nhóm cấu trúc: Kn, SKn, KnS, YnKn YnSKn (Allagulova et al., 2003; Rorat, 2006) Gần đây, phân nhóm SKS lần báo cáo sồi (Liu et al., 2012) Nhiều nghiên cứu thực để khám phá cấu trúc chức DHN thực vật thân cỏ kiểu mẫu Arabidopsis (Hundertmark & Hincha, 2008) gần số thân gỗ nho (Yang et al., 2012), sồi (Liu et al., 2012) Với vai trò đặc biệt quan trọng việc bảo vệ tế bào cảm ứng mạnh điều kiện bất lợi vô sinh hữu sinh, DHN coi thị phân tử tính chống chịu với KHCN (30) - 2014 91 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG điều kiện bất lợi môi trường thực vật (Hanin et al., 2011) Trong nghiên cứu này, hướng tới xác định trình tự DHN sồi Nhật Bản Các đặc trưng vật lý hóa học protein, kết phân tích phả hệ biểu gen giới thiệu cơng trình PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở liệu Tập hợp EST (Expressed Sequence Tags) loài tải từ trang web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/?term= txid28930 [Organism:exp]) Các trình tự DHN Arabidopsis lấy từ Hundertmark Hincha (2008) 2.2 Xác định gen DHN sồi Nhật Bản Các protein DHN Arabidopsis (Hundertmark & Hincha, 2008) dùng làm khn dò, chương trình TBLASTN sử dụng để tìm kiếm gen tương đồng liệu EST sồi Nhật Bản NCBI (Fagus crenata (taxid:28929)) với giá trị e-value mức e-5 để tránh sai sót Chương trình CAP3 Sequence Assembly Program dùng để lắp ráp liệu EST sồi Nhật Bản lựa chọn (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (Huang & Madan, 1999) Pfam (cơ sở liệu họ protein, (Bateman et al., 2004)) sử dụng để xác nhận diện vùng bảo thủ cấu trúc protein ứng viên DHN 2.3 Xác định motif bảo thủ Các protein DHN sồi Nhật Bản Arabidopsis dãy cách sử dụng phần mềm MEME (Multiple Expectation Maximization for motif Elicitation) phiên trực tuyến (Version 4.9.1) (Bailey et al., 2006) 2.4 Tạo phả hệ Các trình tự protein DHN nghiên cứu dãy cách dùng phần mềm MAFFT, phiên trực tuyến (version 7) với cài đặt mặc định (Katoh & Standley, 2013) Cây phả hệ xây dựng từ trình tự protein DHN dãy nhờ phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp Maximum Likelihood tuân theo tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), liệu xử lý tất vị trí phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại (Tamura et al., 2011) 2.5 Các đặc điểm hóa - lý cấu trúc khơng gian Các đặc điểm vật lý, hóa học protein nghiên cứu khảo sát nhờ phần mềm ExPASy (Expert Protein Analysis System; (Gasteiger et al., 2005)) Cấu trúc không gian phân tử protein xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2 (Kelley & Sternberg, 2009) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định gen DHN Sồi Nhật Bản Bảng Dehydrin sồi Nhật Bản đặc điểm chúng 92 Tên Nhóm Kích thước (aa) Khối lượng (kD) pI GRAVY FcDHN KnS 188 22,1 5,39 -1,691 KHCN (30) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Tập hợp EST sồi Nhật Bản tìm kiếm với protein DHN khn dò Arabidopsis nhờ sử dụng chương trình TBLASTN Bước đầu chúng tơi xác định gen mã hóa cho DHN (Bảng 1) Kết phân tích vùng bảo thủ nhờ sử dụng Pfam FcDHN có chứa vùng bảo thủ Dehydrin (PF00257) Protein dùng làm khn để tìm protein tương đồng lồi khác (paralogs) có sở liệu NCBI, kết trình bày bảng Phép kiểm tra khẳng định FcDHN tìm thuộc họ dehydrin Bảng Các paralogs gần với FsDHN có sở liệu NCBI Các protein tìm thấy nhờ sử dụng chương trình BLASTP sở liệu ‘non-redundant protein sequences (nr)’ tất sinh vật màu lục (Viridiplantae (taxid:33090)) Miêu tả NCBI Chỉ số Chỉ số cực đại tổng Mức độ so sánh Giá trị Mức độ E-value tương đồng Kí hiệu Genbank Dehydrin protein [Manihot esculenta] 108 108 99% 3E-27 60% AGC51777.1 Dehydrin [Citrus sinensis] >gb|AAP56259.1| dehydrin [Citrus sinensis] 105 105 94% 1E-25 63% NP_001275806.1 PREDICTED: phosphoprotein ECPP44 [Citrus sinensis] 104 104 94% 2E-25 62% XP_006473752.1 Dehydrin [Citrus x paradisi] 104 104 94% 2E-25 62% AAN78125.1 Hypothetical protein CICLE_v10002349mg [Citrus clementina] > gb|ESR48553.1| hypothetical protein CICLE_v10002349mg [Citrus clementina] 102 102 94% 1E-24 61% XP_006435313.1 Dehydrin [Camellia sinensis] 94,0 94,0 86% 2E-21 59% ACT10283.1 Dehydrin [Tamarix hispida] 90,9 90,9 100% 1E-20 49% ACN42853.1 Dehydrin [Populus davidiana] 86,3 86,3 98% 1E-18 61% ABS12342.1 Dehydrin [Populus davidiana] 86,3 86,3 98% 1E-18 61% ABS12341.1 Dehydrin [Malus domestica] 86,7 86,7 87% 1E-18 53% AFG33218.1 3.2 Đặc điểm dehydrin sồi Nhật Bản Các DHN sồi Nhật Bản có có độ dài 188 amino axit, tương ứng với khối lượng phân tử 22,1 kD FcDHN có điểm đẳng điện (pI) 5,39; đồng thời, FcDHN có tính ưa nước cao với giá trị GRAVY -1,691 (bảng 1) Các kết phù hợp với báo cáo DHN nhiều loài khác (Rorat, 2006; Hanin et al., 2011; Liu et al., 2012) KHCN (30) - 2014 93 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 3.3 Xác định motif bảo thủ, phân tích phả hệ phân loại FsDHN Kết phân tích motif bảo thủ phần mềm MEME cho thấy, hai vùng bảo thủ dehydrin phân mảnh K (trình tự KKG[IF]MEKIK[ED]KLPG[HG], hình 1A) phân mảnh S (LHRS[GDN]SSSSSSS[ED][ED][ED], hình 1B) có mặt FcDHN Ngược lại, FcDHN không chứa phân mảnh Y vốn diện nhiều DHN biết (Hanin et al., 2011) Từ đó, đặt giả thuyết sồi Nhật Bản có DHN khác cần có nghiên cứu bổ sung để tìm chúng Hình 1: Biểu tượng trình tự axit amin phân mảnh K (A) phân mảnh S (B) Cây phả hệ thiết lập từ protein DHN sồi Nhật Bản Arabidopsis thể hình FcDHN nằm nhánh với ba protein khác Arabidopsis At1G76180, At1G20440, At1G20450 At4G38410 phả hệ Đây dehydrin thuộc phân nhóm KnS Arabidopsis Kết hợp phân tích phả hệ phân tích motif bảo thủ xếp FcDHN thuộc nhóm SKn, nhóm có phân mảnh bảo thủ thuộc S K, phân mảnh K nằm đầu tận Carboxyl phân tử protein Hình 2: Cây phả hệ xây dựng từ dehydrin sồi Nhật Bản Arabidopsis 94 KHCN (30) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 3.4 Cấu trúc không gian dehydrin sồi Nhật Bản Hình Mơ hình 3D cấu trúc bậc hai dehydrin sồi châu Âu Cấu trúc không gian protein FcDHN xây dựng nhờ chương trình Phyr2 (hình 3) Kết phân tử có cấu trúc xoắn a lưỡng cực Cấu trúc xoắn a lưỡng cực phổ biến DHN loài khác, đảm bảo cho DHN có khả tương tác với phân tử protein khác hay màng sinh học Nhờ cấu trúc mà phân tử dehydrin thể chức bảo vệ tế bào (Rorat, 2006; Hanin et al., 2011) KẾT LUẬN Trong công trình chúng tơi xác định gen DHN sồi Nhật Bản dựa ngân hàng EST lồi Kết phân tích phả hệ motif bảo thủ FcDHN thuộc nhóm SKn Protein có kích thước 188 amino axit khối lượng 22,1kD, có tính axit, lực nước cao FcDHN có cấu trúc xoắn a lưỡng cực đặc trưng DHN Đây kết bước đầu có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt hệ gen sồi Nhật Bản chưa giải trình tự, mở đường cho việc nghiên cứu chức DHN loài Tài liệu tham khảo Allagulova CR, Gimalov FR, Shakirova FM, Vakhitov VA (2003) The plant dehydrins: Structure and putative functions Biochemistry-Moscow 68 (9): 945-951 Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW (2006) MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs Nucleic acids research 34 (suppl 2): W369-W373 Bateman A, Coin L, Durbin R, Finn RD (2004) The Pfam protein families database Nucleic Acids Res 32: D138-D141 Close TJ (1996) Dehydrins: Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins Physiologia Plantarum 97 (4): 795-803 Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A (2005) Protein identification and analysis tools on the ExPASy server The proteomics protocols handbook: Springer, 571-607 Hanin M, Brini F, Ebel C, Toda Y, Takeda S, Masmoudi K (2011) Plant dehydrins and stress tolerance: versatile proteins for complex mechanisms Plant Signaling & Behavior (10): 1503-1509 KHCN (30) - 2014 95 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Huang X, Madan A 1999 CAP3: A DNA sequence assembly program Genome Res (9): 868-877 Hundertmark M, Hincha DK (2008) LEA (late embryogenesis abundant) proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana BMC genomics (1): 118 Katoh K, Standley DM (2013) MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability Mol Biol Evol 30 (4): 772-780 10 Kelley LA, Sternberg MJ (2009) Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server Nat Protoc 4: 363-371 11 Liu CC, Li CM, Liu BG, Ge SJ, Dong XM, Li W, Zhu HY, Wang BC, Yang CP (2012) Genome-wide Identification and Characterization of a Dehydrin Gene Family in Poplar (Populus trichocarpa) Plant Molecular Biology Reporter 30 (4): 848-859 12 Masaki T, Oka T, Osumi K, Suzuki W (2008) Geographical variation in climatic cues for mast seeding of Fagus crenata Population Ecology 50 (4): 357-366 13 Rinne PLH, Welling A, van der Schoot C (2010) Perennial life style of Populus: dormancy cycling and overwintering Genetics and Genomics of Populus: Springer, 171-200 14 Rorat T (2006) Plant dehydrins - Tissue location, structure and function Cellular & Molecular Biology Letters 11 (4): 536-556 15 Takahashi M, Mukouda M, Koono K (2.000) Differences in genetic structure between two Japanese beech (Fagus crenata Blume) stands Heredity 84 (1): 103-115 16 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods Mol Biol Evol 28 (10): 2731-2739 17 Watanabe M, Yamaguchi M, Matsumura H, Kohno Y, Izuta T (2012) Risk assessment of ozone impact on Fagus crenata in Japan: consideration of atmospheric nitrogen deposition European Journal of Forest Research 131 (2): 475-484 18 Yang Y, He M, Zhu Z, Li S, Xu Y, Zhang C, Singer SD, Wang Y (2012) Identification of the dehydrin gene family from grapevine species and analysis of their responsiveness to various forms of abiotic and biotic stress BMC Plant Biol 12: 140 SUMMARY IDENTIFICATION OF SKn-type Dehydrin GENE FROM JAPANESE BEACH (Fagus crenata Blume) By in silico METHOD Cao Phi Bang Hung Vuong University Dehydrins belong to groupe II of LEA family They play an important role in the cell protection In this work, we utilized in silico approach to identify and analyze a dehydrin gene from japanese beach from EST collection Based on the phylogenetic tree and the conserved motifs, this dehydrin is classified into the SKn groupe FcDHN is acidic and high hydrophilic Its predicted 3D modeling structure presents amphipathic α-helices that play an impotant role in cell protection Keywords: Dehydrin (DHN), Fagus cretana, gene characters, gene identification, in silico, phylogenetic tree 96 KHCN (30) - 2014 ... Hincha (2008) 2.2 Xác định gen DHN sồi Nhật Bản Các protein DHN Arabidopsis (Hundertmark & Hincha, 2008) dùng làm khn dò, chương trình TBLASTN sử dụng để tìm kiếm gen tương đồng liệu EST sồi Nhật. .. dụng phần mềm Phyre2 (Kelley & Sternberg, 2009) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định gen DHN Sồi Nhật Bản Bảng Dehydrin sồi Nhật Bản đặc điểm chúng 92 Tên Nhóm Kích thước (aa) Khối lượng (kD) pI GRAVY... phân tử protein khác hay màng sinh học Nhờ cấu trúc mà phân tử dehydrin thể chức bảo vệ tế bào (Rorat, 2006; Hanin et al., 2011) KẾT LUẬN Trong cơng trình xác định gen DHN sồi Nhật Bản dựa ngân