Trích ly CO2 siêu tới hạn dầu hạt neem để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp

Nhiệm vụ và nội dung - Tổng quan về: cây neem, thành phần của dầu neem, ứng dụng của dầu neem, khả năng kháng khuẩn của dầu neem, các phương pháp trích ly dầu neem, kỹ thuật trích ly bằ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM VÀ TRƯỜNG CAO ĐẲNG

NGHỀ TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Hiếu

TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Phan Thế Đồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Thị Lệ Quyên

II Nhiệm vụ và nội dung

- Tổng quan về: cây neem, thành phần của dầu neem, ứng dụng của dầu neem, khả năng kháng khuẩn của dầu neem, các phương pháp trích ly dầu neem, kỹ thuật trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn

- Trích ly dầu neem từ hạt bằng: phương pháp Soxhlet dùng dung môi: etanol, hỗn hợp hexan - etanol; và bằng lưu chất co2 siêu tới hạn (có và không sử dụng đồng dung môi etanol)

- So sánh tỷ lệ thu hồi dầu từ các phương pháp trên

- Phân tích và đánh giá các chỉ số hóa lí (axit, peroxit, iot và xà phòng) của các sản phẩm dầu thu được và dầu thương mại

- Phân tích và so sánh thành phần axit béo trong dầu thu được từ các phương pháp trích ly trên và dầu thương mại

MSHV: 13111025 Nơi sinh: Bình Định

Mã số: 60540101

- Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men và nấm mốc) của dầu neem trích được bằng CO2 siêu tới hạn

- Thử nghiệm khả năng ức chế Aspergillus flavus của dầu neem trích được bằng co2

siêu tới hạn trong bảo quản hạt bắp

III Ngày giao nhiệm vụ

06/07/2015

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ

04/12/2015

V Cán bộ hướng dẫn

TS Nguyễn Hữu Hiếu

TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long

Tp Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 01 năm 2016

Trưởng Khoa Kỹ Thuật Hóa Học

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đen Thầy TS Nguyễn Hữu Hiếu và TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long, người đã tận tình hướng dẫn tôi ttong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong gia đình tôi, những người

đã tạo điều kiện vật chất, đồng thời ủng hộ hết lòng về mặt tinh thần cho tôi ừong suốt thời gian thực hiện luận vãn

Tôi xin ttân ừọng cảm ơn tập thể quý thầy, cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Bách Khoa Tp HCM và các quý thầy cô Trường Cao đẳng Nghề Tp HCM, những người đã nhiệt tình hỗ ừợ chúng tôi các hóa chất và thiết bị cần thiết, nhờ vậy chúng tôi mới

có thể tiến hành tốt các nhiệm vụ nghiên cứu ừong luận văn

Sau cùng, tôi xin cảm ơn các anh, chị và các bạn học ở phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm, những người bạn đồng hành cùng tôi ừong thời gian thực hiện luận vãn cao học tại trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM

Tp Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 01 năm 2016

Học viên thực hiện

TRẦN THỊ LỆ QUYÊN

ii

ABSTRACT

The subject entitled: “Study the neem oil exhaction by supercritical co2 using in the preservation of grain corn" was conducted at the Microbiology laboratory of University of Technology, Vietnam National University HCMC and Vocational Training College City HCM from March 2015 to December 2015 The objectives of this study: neem oil exttacted from the seeds by solvent: ethanol, mixed hexane - ethanol, co2 supercritical not use the solvent and supercritical co2 using ethanol cosolvent; evaluate the animicrobial properties

of neem extract including bacteria, yeast and molds, and the potential application in preservation of seeds

The disc diffusion test and the determination of minimum inhibitory concenttation (MIC) were used to evaluate the antimicrobial properties of neem extract

Extraction efficiency of oil extracted from the mixture of etanol - hexane is the largest (48.06%), neem oil exttaction with supercritical co2 is lowest (43.38%) but quality neem oil exhaction with supercritical co2 is the best

The results indicated that the neem exhact could inhibit all of the microbial strains studied The MIC values for the strains tested varied from 200 - 1600 ppm Yeast, molds and Gram (+) bacteria had the lower MIC values than those of Gram (-) bacteria At the

concentration of 600 ppm the neem extract can inhibit the development of Aspergillus flavus

on com and this inhibiting activity was stable during 10 weeks of preservation

In summary, the neem exhact could be considered as an antimicrobial agent with relatively low MIC value This exhact has a high potential application in the preservation of dried nuts such as grain com

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Trích ly co2 siêu tới hạn dầu hạt neem để ứng dụng làm chất bảo quản hạt bắp” được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ hóa học và Dầu khí, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp HCM và Phòng thí nghiệm Vi Sinh Trường Cao Đẳng Nghề Tp HCM thời gian từ tháng 03/2015 đến tháng 12/2015 với mục tiêu: trích ly dầu neem từ hạt bằng dung môi: etanol, hỗn hợp hexan - etanol, co2 siêu tới hạn có và không sử dụng đồng dung môi etanol; bước đầu khảo sát khả năng kháng vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm men và nấm mốc của dầu neem; đồng thời khảo sát khả năng ứng dụng của dầu neem ừong bảo quản hạt bắp

Phương pháp khuếch tán trên đĩa giấy và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC đã được sử dụng để đánh giá định tính và định lượng cho tính chất kháng vi sinh vật của dầu neem

Tỷ lệ dầu thu được từ trích ly bằng hỗn hợp etanol - hexan là lớn nhất (48,06%), trích

ly bằng dung môi co2 siêu tới hạn có tỷ lệ thu hồi dầu thấp nhất (43,33%) nhưng có chất lượng dầu tốt hơn

Ket quả cho thấy dầu neem có khả năng kháng các chủng vi sinh thử nghiệm Nồng

độ MIC đối với các chủng thử nghiệm thay đổi từ 200 ppm đến 1600 ppm tíong đó nấm men, nấm mốc và nhóm vi khuẩn Gram (+) có giá trị MIC thấp hơn so với nhóm vi khuẩn

Gram (-) Ở nồng độ 600 ppm dịch chiết neem ức nấm mốc Aspergillus flavus trên hạt bắp

và hoạt lực của dầu neem không bị suy giảm ttong 10 tuần thử nghiệm

Tóm lại dầu hạt neem có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt với giá trị MIC tương đối thấp và có khả năng ứng dụng trong bảo quản hạt bắp

4

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận vãn này là trung thực, không sao chép từ bất

kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Trần Thị Lệ Quyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

ABSTRACT ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC V DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về cây neem 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Công dụng của cây neem 3

2.1.3 Các hoạt chất sinh học chính trích ly từ cây neem 4

2.1.4 Tình hình nghiên cứu về cây neem 8

2.2 Cây bắp 11

2.2.1 Cấu tạo hạt bắp 11

2.2.2 Thành phần hóa học 13

2.2.3 Bảo quản hạt bắp 14

2.3 Các phương pháp trích ly dầu neem 15

2.3.1 Phương pháp ép cơ học 15

2.3.2 Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ 15

2.3.3 Phương pháp trích ly bằng dungmôi siêu tới hạn 16

2.4 Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn 16

2.4.1 Định nghĩa 16

vi

2.4.2 Sơ đồ thiết bị 19

2.4.3 Nguyên tắc hoạt động 19

2.4.4 ưu-nhược điểm 20

2.4.5 ứng dụng 21

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22

3.2 Nguyên liệu và hóa chất 22

3.3 Thiết bị và dụng cụ 24

3.4 Mục tiêu nghiên cứu 24

3.5 Nội dung nghiên cứu 25

3.6 Trích ly dầu neem 26

3.6.1 Trích ly dầu neem bằng phương pháp Soxhlet 26

3.6.2 Trích ly bằng dung môi co2siêu tới hạn 26

3.7 Tỷ lệ thu hồi dầu 28

3.8 Phân tích các chỉ số axit, chỉ số iot, chỉ số xà phòng, chỉ số peroxit 29

3.8.1 Chỉ số axit 29

3.8.2 Chỉ số iot 29

3.8.3 Chỉ số xà phòng 29

3.8.4 Chỉ số peroxit 30

3.9 Phân tích thành phần axit béo 30

3.10 Khảo sát khả năng kháng vsv của dầu neem 31

3.10.1 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng kháng vsv của dầu neem 32

3.10.2 Thí nghiệm 2: khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu vsv (MIC) của dầu neem 33 3.10.3 Thí nghiệm 3: thử nghiệm khả năng ức chế Aspergillus flavus của dầu neem trong bảo quản hạt bắp 36

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

4.1 Tỷ lệ thu hồi dầu 40

4.2 Ket quả phân tích các chỉ số 42

4.2.1 Chỉ số axit 42

vii

4.2.2 Chỉ số peroxit 43

4.2.3 Chỉ số xà phòng 44

4.2.4 Chỉsốiot 45

4.3 Kết quả phân tích thành phần axit béo 46

4.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng vsv của dầu neem 46

4.5 Ket quả khảo sát MIC của dầu neem 50

4.6 Ket quả ứng dụng thử nghiệm dầu neem ừong bảo quản hạt bắp 52

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sự biến động hàm lượng azadữachtin ừong nhân hạt neem từ nhiều nơi khác

nhau 6

Bảng 2.2 Các thành phần phần chính ừong hạt bắp 11

Bảng 2.3 Thành phần nội nhũ sừng và nội nhũ bột của hạt bắp (% chất khô) 13

Bảng 2.4 Sự phân bố các chất trong các phần của hạt bắp 13

Bảng 2.5 Thành phần hóa học trung bình của hạt bắp (% chất khô) 14

Bảng 2.6 Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp trích ly siêu tới hạn 18

Bảng 2.7 So sánh các đặc tính của lưu chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn 18

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng để trích ly dầu neem 23

Bảng 3.2 Sắp xếp các mẫu thí nghiệm 37

Bảng 4.2 Bảng so sánh thành phần các axit béo tự do trích ly từ các phương pháp khác nhau (%) 46

Bảng 4.3 Đường kính trung bình vòng kháng vi khuẩn, nấm men và nấm mốc 47

Bảng 4.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên vi khuẩn của dầu neem 50

Bảng 4.5 So sánh kết quả thử nghiệm với các nhóm tác giả khác 51 Bảng 4.6 Nồng độ ức che tối thiểu (MIC) trên nấm men và nấm mốc của dầu neem.,52

9

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình cây neem 3

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của azadhachtin A (a) và azadhachtin B (b) 5

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của salanin 7

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của nimbin 7

Hình 2.5 Cấu tạo hạt bắp 11

Hình 2.6 Giản đồ pha hạng thái siêu tới hạn của một chất 17

Hình 2.7 Sơ đồ thiết bị trích ly bằng dung môi siêu tới hạn 19

Hình 3.1 Hạt neem dùng trong thí nghiệm 22

Hình 3.2 Quy trình xử lý hạt neem 22

Hình 3.3 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi etanol 26

Hình 3.4 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi co2 siêu tới hạn 27

Hình 3.5 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi co2 siêu tới hạn có sử dụng đồng dung môi etanol 27

Hình 3.6 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng vsv của dầu neem 31

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dầu neem 32

Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quá ttình khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu vsv của dầu neem 35

Hình 3.9 Sơ đồ thực hiện xử lý và bảo quản hạt bắp 39

Hình 4.1 Tỷ lệ thu hồi dầu từ các loại dung môi 40

Hình 4.2 Dầu neem thu được bằng cách trích ly từ các dung môi: etanol, etanol - hexan, co2 siêu tới hạn, co2 siêu tới hạn + etanol (từ trái qua) 41

Hình 4.3 Chỉ số axit của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau 42

Hình 4.4 Chỉ số peroxit của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau 43

Hình 4.5 Chỉ số xà phòng của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau 44

Hình 4.6 Chỉ số iot của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau 45

Hình 4.7 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng vsv của dầu neem 49

Hình 4.8 Ảnh hường của dầu neem ừên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các

mẫu hạt bắp thí nghiệm 53

Hình 4.9 Ảnh hưởng của dầu neem ưên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các

mẫu hạt bắp không cấy nấm mốc 55

Hình 4.10 Ảnh hưởng của dầu neem ưên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các

mẫu hạt bắp có cấy nấm mốc 57

BHI : Brain Heart Infusion

DMSO : Dimethyl sulfoxide

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Đối với người nông dân, quá trình tạo ra sản phẩm từ lúc ừồng ừọt tới lúc thu hoạch

là cả một quá trình gian khổ, nhung quá trình bảo quản sản phẩm sau thu hoạch sao cho không hao hụt về số lượng và chất lượng cũng là một vấn đề không đơn giản Sản phẩm sau thu hoạch có thể bị nhiễm độc tố do vi sinh vật (VSV) gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng Do đó, việc bảo quản các nguồn nông sản sau thu hoạch là hết sức cần thiết Giải quyết tốt vấn đề này sẽ kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm và hạ thấp được mức thiệt hại có thể xảy ra

Riêng tại nước ta và nhiều nước nhiệt đới khác, nấm mốc được xem là một trong những nguyên nhân gây tổn thất nông sản nghiêm trọng nhất Các chất hóa học xử lý nấm hiện nay vẫn đảm bảo hiệu quả phòng trị nhất định nhưng lại gây ra những hậu quả nghiêm họng như phá vỡ cân bằng sinh học do chúng tiêu diệt tất cả những loài có ích, gây ra hiện tượng bộc phát dịch hại Ngoài ra, sự lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật cũng là nguyên nhân làm cho nhiều loại dịch hại trở nên kháng thuốc và quan họng hơn là gây ô nhiễm môi trường, để lại nhiều tác hại nghiêm họng đối với sức khỏe con người

Do đó, người ta đã có xu hướng tìm những loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc để thay thế Trong đó, cây neem với những dẫn xuất của nó được chứng minh là có hiệu quả cao trong kiểm soát côn trùng mà không gây hại cho các loài thiên địch và không ảnh hưởng xấu đến môi trường

Cây neem (Azadirachta Indỉca A Juss) là một trong những loài thực vật có đặc tính

kháng côn trùng đang được nghiên cứu, sử dụng ngày càng nhiều ở nước ta và một số nước trên thế giới do chúng có khả năng phòng trừ hơn 400 loại dịch hại Cây neem có nguồn gốc từ Ấn Độ, du nhập vào nước ta cách đây gần 30 năm và được trồng nhiều ở các tỉnh miền Trung Hiện nay, rừng neem tại Ninh Thuận và Bình Thuận vẫn không ngừng phát triển với diện tích hơn 1.000 ha, đây là nguồn nguyên

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây neem

- Loài : indica A Juss

2.1.2 Công dụng của cây neem

Cây neem có rất nhiều công dụng ừong nông nghiệp và y học [2], Tại nhiều nước ttên thế giới, cây neem không những mang lại hiệu quả đáng kể về kinh tế vói nhiều sản phẩm đa dạng mà nó còn giải quyết được một số vấn đề về môi sinh Đây là một ừong số

ít những loài thực vật mà tất cả các bộ phận của nó đều mang lại những lọi ích thiết thực cho con người [3],

- Lá: lá có lượng đạm, khoáng, caroten tương đối cao nên có thể được sử dụng làm thức ăn cho gia súc Tại một số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con để gia tăng sự tiết sữa Ngoài ra, lá còn có tác dụng phòng ừị bệnh giun sán cho gia súc và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác [4], Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc

Hình 2.1 Hình cây neem

- Hạt: nhân hạt neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dùng làm thuốc giảm đau, thuốc sát trùng, thuốc ngừa thai [6], Ngoài ra, dầu neem còn được dùng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và nhiều ngành công nghiệp khác [7]

- Vỏ cây: vỏ cây có chứa nhiều hợp chất minbin có khả năng tiêu diệt các loại côn trùng

- Rễ: dầu neem từ rễ cây neem được dùng làm thuốc cổ truyền ừị bệnh ngoài da, suy nhược cơ thể do có chứa nhiều đường, nhựa, protein, ừyptophan Bộ rễ phát triển khỏe, giúp hạn chế xói mòn đất và góp phần cùng với lá rụng phục hồi dinh dưỡng cho tầng đất canh tác [3],

2.1.3 Các hoại chất sinh học chính trích ly từ cây neem

Từ neem, có thể chiết xuất ra rất nhiều họp chất có khả năng phòng trừ nhiều loại côn trùng, bên cạnh đó chúng còn được dùng để làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, thuốc ngừa thai, mỹ phẩm, và nhiều ứng dụng thực tiễn khác Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh neem có khả năng ức chế hơn 400 loài dịch hại, bao gồm: côn trùng, nấm, vi khuẩn, virut, tuyến trùng, Trong đó, azadứachtin A (AZA), azadirachtin B (AZB), salanin, nimbin là những hoạt chất sinh học có tác dụng phòng trị côn trùng, được chiết chủ yếu từ hạt neem [1],

5

❖ Azadirachtin

Azadirachtin là hợp chất chính trong cây neem, có công thức phân tử là C35H44O15,

nhiệt độ nóng chảy 154 - 158°c, có hoạt tính kháng côn trùng mạnh nhất, đặc biệt là tác động xua đuổi và ức chế sinh trưởng

Azadirachtin có cấu trúc tương tự như hormone “ecdysone”, hormone này có tác dụng kiểm soát tiến trình biến đổi nội hóa học của côn trùng khi côn trùng chuyển từ dạng

ấu trùng sang dạng nhộng để trưởng thành Azadirachtin được xem như chất ngăn cản sự tổng hợp các hormone cần thiết cho cơ thể côn trùng, do đó phá vỡ chu kỳ sống của côn trùng [8],

Azadirachtin tập trung nhiêu nhất trong nhân hạt neem Trung bình 1 g nhân hạt neem chứa từ 2 đến 4 mg azadirachtin Đặc biệt ở Senegal, 1 g nhân hạt có thể chứa đến 9

mg azadir ach tin [8],

Hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt neem cũng biến động tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện khí hậu ở nhiều vùng khác nhau Trong mỗi cây cũng có sự biến động về hàm lượng azadirachtin [8],

Hình 2.2 Công thức câu tạo của azadirachtin A (a) và azadirachtin B (b) [8]

(b)

tốt nhất khi nó chuyển sang màu vàng hay vàng xanh, lúc này hàm lượng azadirachtin cao

nhất Không nên để quả quá chín và rụng vì hạt thường bị giảm chất lượng khi bị rơi

xuống đất [4],

❖ Salanin

Salannin cũng có hoạt tính gây ngán ăn mạnh và đặc biệt là chất chống lại sự lột

xác của côn trùng Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất này tác động mạnh lên sự lột

xác của con bọ cánh cứng trên dưa chuột (Acalymma vitta) và bọ cánh cứng Nhật Bản

(Popillia japonica) Trong hạt neem, hàm lượng salanin thường từ 15 - 1247 mg/g [8],

7

❖ Nimbin

Nimbin cũng là một bong những hoạt chất đầu tiên được tách chiết từ hạt và lá neem Nimbin được phát hiện có trong mô sẹo nuôi cấy từ vỏ thân cây neem nhưng biến mất sau 3 tháng Nimbin có hoạt tính kháng virut mạnh, đặc biệt hiệu quả đối với virut gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa, bệnh trên gia cầm [6], Nimbin là thành phần chủ yếu gây ra vị đắng ở hạt neem cũng như trong dầu neem Nimbin chiếm khoảng 2% trong nhân hạt neem Nimbin cũng có hoạt tính kháng virut mạnh giống

Hình 2.4 Công thức câu tạo của nimbin [8]

2.1.4.1 Trên thể giới

8

Cây neem đã được trồng phổ biến ở Ấn Độ và Burma như một loại cây thuốc có giá trị và cho đến nay, Ấn Độ vẫn là nước hồng cây neem nhiều nhất thế giới Tại đây, cây neem được hồng khắp nơi và được xem như là loài cây tiêu biểu của quốc gia Hơn

14 hiệu cây neem cho 418.633 tấn hạt/năm đã đem lại nguồn lợi hàng năm khoảng 1 vạn tấn dầu và 4 vạn tấn bánh dầu [9],

Năm 1959, nhà côn trùng học người Đức Heinrich Schmutterer chứng kiến nạn dịch châu chấu ở Sudan Ông quan sát thấy neem là cây duy nhất không bị châu chấu tấn công Từ đó ông bắt đầu quan tâm nghiên cứu các hoạt chất trong cây neem [1]

Năm 1962, Heinrich Schmutterer và các nhà khoa học Ân Độ đã chứng minh rằng dầu hạt neem có khả năng xua đuổi được châu chấu và dầu neem từ hạt có hiệu lực hơn

so với dầu từ lá neem [11],

Năm 1971, lần đầu tiên Morgan và cộng sự đã cô lập và xác định được họp chất azadhachtin, họp chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với côn trùng từ hạt neem [6],

Từ năm 1971 đến 1992, đã có nhiều công trình nghiên cứu về: thành phần hóa học của cây neem; đặc điểm sinh thái của cây neem; vấn đề chiết xuất hoạt chất sinh học từ neem; phương thức hoạt động của azadhachtin lên côn trùng; tính gây ngán ăn của dầu neem từ neem đối với côn trùng; ảnh hưởng của dầu neem từ neem lên nhện, tuyến trùng, giun tròn và lên nấm, [9], Các nghiên cứu này được báo cáo và trình bày trong 3 cuộc hội thảo quốc tế về neem tổ chức ở Đức và Kenya; 2 hội thảo ở Mỹ; tạp chí “Neem Newletter” ở Ấn Độ,

Năm 2013, Mishra và cộng sự thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn của dầu neem

thô trên các đối tượng vi khuẩn E coli và s aureus kết quả dầu neem thô có khả năng ức

chế hoàn toàn hai chủng vi khuẩn thử nghiệm

Năm 2014, Charde và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của dầu từ lá neem, tiêu đen

và nhục đậu khấu lên các chủng vi khuẩn Propionibacterium acnes, s aureus và s epidermidis gây bệnh mụn trứng cá kết quả ba loại dầu đều có tác dụng kháng khuẩn rất

9

tốt Ngoài ra tác giả cũng chỉ ra rằng phối hợp ba loại dầu với nhau sẽ cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với từng dầu riêng lẻ

2.1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 1981, GS Lâm Công Định đã tiến hành những khảo nghiệm ừồng thử cây neem giống Senegal ở Bình Thuận Bước đầu cho thấy cây neem thích nghi tốt đối với vùng đất này [2],

Bên cạnh đó, vịêc nghiên cứu hoạt chất tách chiết từ cây neem cũng đã được nghiên cứu tại một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội (công trình nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Đăng Diệp, PGS TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn, Đại học quốc gia Hà nội, và TS Nguyễn Trường Thành, Viện bảo vệ thực vật Hà Nội) Theo đánh giá chung, thuốc trừ sâu thảo mộc từ neem tuy không mạnh bằng thuốc trừ sâu hóa học, nhưng có phổ tác động rộng, thời gian tác động chậm đặc trưng cho thuốc trừ sâu sinh học [12]

Từ đầu những năm 1990, việc trồng cây neem đã được đẩy mạnh ở hai tỉnh khô hạn của nước ta là Bình Thuận và đặc biệt là Ninh Thuận Tỉnh Ninh Thuận tiến hành trồng thử cây neem giống Senegal và Ấn Độ ừên vùng đất cát hoang, chạy dọc theo biển

có khí hậu rất khắc nghiệt, lượng mưa trung bình hằng năm nhỏ và chỉ tập trung trong

2-3 tháng Hiện nay đã hồng được 2-380 ha, một số diện tích trồng từ năm 1996 (7 ha) đã cho hoa và trái Điều này chứng tỏ cây neem thích hợp với vùng đất khô cằn này và việc trông cây neem trước mắt là phục vụ cho mục đích phủ xanh đất trống, cải tạo môi trường sống

và đồng thời tạo nguồn nghiên liệu có giá trị phục vụ cho nhiều mục đích sử dụng [12],

Năm 1991, Giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây neem

(Azadirachtin indica A Juss) được nhập nội vào Việt Nam và công bố những nghiên cứu

về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này ừên vùng đất cát nóng Tuy Phong thuộc tỉnh Bình Thuận [2],

Năm 1999 - 2000, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm tác động của dầu neem lên sự ký sinh và phát hiển bọ hà khoai lang Ket quả

10

cho thấy dầu neem có hiệu lực phòng trừ loài bọ hà này Dầu neem có tác dụng xua đuổi

bọ hà đến ký sinh, đồng thời làm giảm sự sinh sản của chúng ngay từ tuần đầu tiên [13],

Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt neem hồng tại Việt Nam và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn hên sâu khoang [14],

Năm 2003, Trần Thị Hồng Anh đã khảo sát hoạt tính ức chế sâu hại của sản phẩm chiết xuất từ neem

Năm 2013, Lê Thị Thanh đã nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem từ lá neem lên

sự sinh trưởng của loại nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư hên xoài Ket quả cho

thấy limonoid trích từ lá neem với nồng độ 5000 ppm có tỷ lệ ức chế nấm cao nhất đạt 79,2% vào ngày thứ 5 của thử nghiệm, tốc độ phát triển tản nấm thấp nhất (1,5 mm/ngày)

Limonoid trích ly từ lá neem có khả năng ức chế nấm Coỉỉetotrichum sp với tỷ lệ bệnh là

10% và chỉ số bệnh là 2%, đồng thời có khả năng làm chậm quá hình chín so với đối chứng

Như vậy, qua các kết quả trên cho thấy neem là một cây có chứa rất nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học rất tốt và có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng dầu neem trong chế biến và bảo quản thực phẩm còn nhiều hạn chế

11

2.2 Cây bắp

2.2.1 Cẩu tạo hạt bắp

Bắp có hình dạng và kích thước khác

biệt nhau rất nhiều giữa các giống Dựa vào

đặc tính này người ta có thể phân biệt được

chúng Ngay ttong cùng một ttái bắp hạt cũng

thay đổi về hình dạng và độ lớn Hạt ở đầu

cuống ttái bắp dường như có cùng khối lượng

với hạt giữa ttái bắp, có dạng ngắn hơn và to

hơn Hạt của các giống bắp khác nhau nhưng

đều cấu tạo gồm từ 3 phần chính: vỏ, phôi và

nội nhũ Tỷ lệ giữa các thành phần của hạt

bắp được trình bày trong bảng sau

Bảng 2.2 Các thành phần phần chính ừong hạt bắp [15]

Phần trăm trong hạt

(theo % chất khô) 5,1-5,7 10,2-11,9 81,8-83,5 0,8-1,1

❖ Vỏ: hạt bắp là loại hạt ttần nên không có vỏ ừấu mà chỉ có lớp vỏ quả và vỏ hạt

Chiều dày lớp vỏ khoảng 35 - 60 pm

Vỏ quả gồm có 3 lớp:

■ Lớp ngoài cùng: te bào xếp theo chiều dọc của hạt nên gọi là lớp tế bào dọc

■ Lớp giữa: gồm những tế bào tương tự như lớp ở ngoài nhưng tế bào xếp thành chiều ngang Khi hạt còn xanh những te bào của lớp giữa chứa những hạt diệp lục Khi hạt đã chín trong tế bào này trống rỗng

■ Lớp ừong: gồm những tế bào hình ống xếp theo chiều dọc của hạt Chiều dày của

Hình 2.5 Cấu tạo hạt bắp

12

lớp vỏ ngoài thay đổi theo tùy loại và giống hạt Trong cùng một hạt thì chiều dày của

vỏ ngoài tại các vị trí khác nhau cũng không giống nhau [16],

Vỏ hạt gồm 2 lớp tế bào:

■ Lớp ngoài: gồm những tế bào xếp rất xít với nhau và chứa đầy chất màu (sắc tố)

■ Lớp ưong: gồm những tế bào không màu và không ngấm nước, dễ cho nước đi qua

❖ Lớp aleurone: gồm những lớp tế bào lớn, thành dày, ưong có chứa họp chất của nitơ

và những giọt nhỏ chất béo Lớp tế bào này có dạng nhỏ hình vuông hoặc chữ nhật Lớp aleurone dày khoảng 10 - 70 pm, trong lớp này hầu như không chứa tinh bột Chiều dày của lớp aleurone phụ thuộc vào giống, loại hạt và nhất là phụ thuộc vào điều kiện canh tác [15],

Nội nhũ

- Sau lớp aleurone là khối những tế bào lớn hơn, thành mỏng, có hình dạng khác nhau, xếp không có thứ tự rõ ràng, đó là tế bào nội nhũ

Nội nhũ của hạt bắp được chia làm 2 phần, nội nhũ sừng và nội nhũ bột:

+ Lớp nội nhũ bột nằm bên ừong, gần phôi, mềm và đục, chứa nhiều hạt tinh bột Các hạt tinh bột của lớp nội nhũ lớn và ươn nhẵn Liên kết các tế bào ưong lớp nội nhũ bột lỏng lẻo Trong phần nội nhũ bột, màng lưới các hạt protein mỏng và không bao bọc được xung quanh hết các hạt tinh bột

+ Lớp nội nhũ sừng cứng và ưong mờ, nằm gần lớp vỏ, chứa nhiều hạt protein Hạt tinh bột của lớp nội nhũ hình đa giác, kích thước nhỏ, kết dính nhau rất sít

2.2.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của hạt bắp thay đổi tùy theo điều kiện khí hậu, giống, loại,

kỹ thuật canh tác, đất đai, Thành phần hóa học của hạt bắp phân bố không đều ừong hạt, nó có tỷ lệ khác nhau giữa 3 phần chính là vỏ, nội nhũ và phôi

Bảng 2.4 Sự phân bố các chất trong các phần của hạt bắp

LI

14

Giữa các giống bắp khác nhau thành phần hóa học cũng khác nhau

Bảng 2.5 Thành phần hóa học trung bình của hạt bắp (% chất khô)

2.2.3 Bảo quản hại bắp

❖ Bảo quản thông thường

Từ thập kỷ 70 trở về trước, hạt bắp thường được bảo quản theo công nghệ truyền thống là đóng vào bao đay, xếp vào các kho bảo quản theo công nghệ mở Thời gian hạt bắp được giữ chỉ 3 đen 4 tháng là phải xuất, sau thời gian này chất lượng hạt bắp giảm nhanh [17],

❖ Bảo bằng hóa chất

Hóa chất thường sử dụng như: bromua metyl, so2, natripữosuníit, picrinclorua

15

Hóa chất bảo quản nông sản có tác dụng:

+ Phòng chống sự sinh trưởng và phát triển của vsv

+ Hạn che các hoạt động sinh lý, sinh hoá của hạt như: sự hô hấp, sự nảy mầm, [18],

2.3 Các phương pháp trích ly dầu neem

Hiện nay, dầu neem có thể được thu được bằng cách: ép cơ học, trích ly bằng dung môi, trích ly bằng dung môi siêu tới hạn [19],

Trong đó, phương pháp ép cơ học là phương pháp được sử dụng rộng rãi để lấy được dầu từ hạt neem [19],

2.3.1 Phương pháp ép cơ học

Đây là cách thức đã được sử dụng từ rất lâu, dùng lực ép để ép lấy dầu từ hạt, thường

sử dụng máy ép [19],

♦♦♦ Ưu điểm: đơn giản, chi phí thấp

❖ Nhược điểm: dầu thu được thường có độ tinh khiết không cao

2.3.2 Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ

Vì các họp chất trong hạt neem có tính phân cực nên các loại dung môi hữu cơ phân cực được sử dụng để trích dầu từ hạt neem Các dung môi hữu cơ thường dùng như: etanol, ete dầu hỏa (petroleum ether) [20],

❖ Ưu điểm: hiệu suất thu hồi dầu và độ tinh khiết cao hơn so với ép cơ học [21],

❖ Nhược điểm: dầu thu được không hoàn toàn tinh khiết do dung môi sử dụng để trích

ly không được tách ra hết Và vì sử dụng dung môi hữu cơ nên không thân thiện với môi trường [22],

16

2.3.3 Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

Phương pháp trích ly này sử dụng dung môi là lưu chất ở ừạng thái siêu tới hạn để trích ly dầu từ hạt neem

❖ Ưu điểm: dầu thu được tinh khiết, thân thiện với môi trường, thu hồi được dung môi

❖ Nhược điểm: chi phí cao hơn với các phương pháp trên, điểm tới hạn tùy vào từng

loại lưu chất [23],

Dựa ttên những ưu, nhược điểm của từng phương pháp ở trên, phương pháp trích

ly bằng dung môi siêu tới hạn có những ưu điểm quan ttọng, đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều ttong nhiều lĩnh vực

Dung môi siêu tới hạn được ứng dụng ương trích ly tinh dầu tràm, gấc, quế, trầm hương [24], về neem, trcn thế giới đã có những nghiên cứu sử dụng dung môi siêu tới hạn

để trích ly hoạt chất sinh học như nimbin từ hạt neem [21], còn ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu Do đó, ương luận văn này, công nghệ trích ly bằng dung môi siêu tới hạn được nghiên cứu trích ly dầu từ hạt neem

2.4 Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

2.4.1 Định nghĩa

Một họp chất ở hạng thái siêu tới hạn khi họp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn Ở ừạng thái siêu tới hạn, họp chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí [25],

Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn là phương pháp trích ly sử dụng dung môi ở hạng thái siêu tới hạn [26],

17

Nhiệt độ

Hình 2.6 Giản đồ pha hạng thái siêu tói hạn của một chất [26], Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng và khí giao nhau Các đường cong là nơi hai hạng thái cùng hiện diện Quan sát dọc theo đường cong khí - lỏng hướng lên cao gặp

1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau Điểm này được gọi là điểm siêu tới hạn và họp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ

có các giá ừị được gọi lần lượt là áp suất tới hạn (Pc) và nhiệt độ tới hạn (Tc) Hai giá ừị này là đặc trưng cho từng chất [26],

Áp suất

Trạng

Pe

Điểm tới hạn

Khí Điểm ba

Chất lỏng siêu tới hạn

18 Bảng 2.6 Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp trích ly siêu tới hạn [26],

19

Hình 2.7 Sơ đồ thiết bị trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

Hệ thống siêu tới hạn gồm một nguồn cung cấp co2, một máy bơm, một bộ làm lạnh, một

bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách sản phẩm và bình ngưng tụ

co2 lỏng được bơm qua van điều chỉnh lưu lượng nhờ bơm cao áp vào bộ phận

20

trao đổi nhiệt để điều chỉnh thông số cho phù hợp với yêu cầu công nghệ Dòng co2lỏng cao áp được giữ ở điều kiện đẳng áp và tăng nhiệt độ dần dần để chuyển sang trạng thái siêu tới hạn [26]

Trong suốt quá trình trích ly, nhiệt độ và áp suất của bình trích ly luôn luôn được giữ ổn định ở một giá ừị định trước cho quá trình trích vì toàn hệ thống điều khiển được kết nối với máy tính [26],

Kết thúc quá trình trích ly, dịch trích ly được dẫn vào bình phân tách Tại đây quá trình tách chất tan ra khỏi dung môi thành những phân đoạn riêng được thực hiện bằng cách thay đổi các thông số áp suất và nhiệt độ Từ trạng thái siêu tới hạn sẽ được giảm áp đến trạng thái khí co2 sẽ trở thành chất khí và tách ra khỏi dịch trích ly để thoát ra ngoài

để lại sản phẩm mong muốn

Với quy mô phòng thí nghiệm co2 không được thu hồi Tuy nhiên, trong sản xuất công nghiệp, khí co2 tách ra sẽ được tuần hoàn trong quá trình trích ly [27],

- co2 không độc với con người và không duy trì sự cháy

- Điểm tới hạn của co2 (Pc = 73 atm; Tc = 31 °C) là một điểm có giá trị nhiệt độ và

áp suất không cao so vói các chất khác nên sẽ tốn ít năng lượng hơn để đưa co2 tói vùng tới hạn

- Có khả năng hòa tan các chất hữu cơ ở thể rắn cũng như thể lỏng, đồng thời cũng

21

hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại nặng

- Khả năng khuếch tán tốt

- Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết, vì thế chất chiết tương đối sạch

- Dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp

- Tốc độ phản ứng lớn

2.4.4.2 Nhược điểm

- Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền

- Không thích hợp với mẫu trích ly dạng lỏng [25],

2.4.5 ửng dụng

Lưu chất siêu tới hạn được ứng dụng ừong rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực khác nhau như ương lĩnh vực môi trường, thực phẩm, ừong công nghiệp, ừong y học,

22

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

3.1 Thòi gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ hóa học và Dầu khí, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp HCM và Phòng thí nghiệm Vi Sinh, Trường Cao Đẳng Nghề Tp HCM

3.2 Nguyên liệu và hóa chất

❖ Hạt neem khô được cung cấp từ Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Ninh

Thuận

Hình 3.1 Hạt neem dùng trong thí nghiệm

Xử lý nguyên liệu: hạt neem khô sau khi đem về, được loại bỏ các hạt bị hư, sau

đó bóc vỏ để thu được nhân hạt neem Nhân hạt neem được đem đi nghiền nhỏ, sau đó được đi ray có đường kính lỗ sàng 0,5 mm Mau nguyên liệu sau xử lý có độ ẩm 6 %, kích thước hạt < 0,5 mm

Hình 3.2 Quy trình xử lý hạt neem Dầu neem thị trường (trích ly bằng phương pháp ép cơ học), ký hiệu mẫu là DNTT,

- Nam moc: Aspergillus flavus, Aspergillus niger

- Nam men: Saccharomyces cerevisiae

Vi khuẩn đối chứng sử dụng E coli ATCC 25922

Huyền phù tế bào vi khuẩn, nấm được chuẩn bị như sau:

Trên mặt thạch có chứa vi khuẩn, dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng Sau đó, lắc đều và so độ đục vói ống McFarland Thực hiện đến khi ống nghiệm chứa huyền phù tế bào có cùng

độ đục với ống McFarland, dịch khuẩn thu được có nồng độ khoảng lxio8 vi khuẩn/ml Sau đó, tiến hành pha loãng 100 lần để có mật độ lxio6 vi khuẩn/ml

❖ Hóa chất sử dụng để trích ly dầu neem

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng để trích ly dầu neem

STT Hóa chất Công thức rrrl Thông sô Ấ Nhãn hiệu Xuất xứ

1 Hexan kỹ

thuật C6H6 99,5 % Công ty TNHH TOP

❖ Hóa chất và môi trường nuôi cấy vsv

- Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) lỏng: sử dụng để tăng sinh một số loài

vi khuẩn

24

- Nước muối sinh lý: sử dụng để pha loãng huyền dịch vi khuẩn

- Độ đục chuẩn (McFarland): được sử dụng để so sánh độ đục với huyền dịch

vsv nhằm xác định nồng độ vsv/ml

- Dung dịch đệm PBS với thành phần được trình bày ừong Phụ lục 2

- Môi trường Sabouraud: dùng cho thử nghiệm các loại nấm men và nấm mốc thành phần được trình bày ttong Phụ lục 2

- Môi trường MHA: sử dụng cho thử nghiệm khả năng kháng khuẩn với thành phần được thể hiện Irong Phụ lục 2

3.4 Mục tiêu nghiên cứu

• Trích ly dầu hạt neem bằng:

- Phương pháp Soxhlet với dung môi: etanol, hỗn hợp hexan - etanol

- Phương pháp trích ly co2 siêu tới hạn: có và không có sử dụng đồng dung môi etanol

• Bước đầu khảo sát khả năng kháng vsv bao gồm: vi khuẩn, nấm men và nấm mốc của dầu neem đưọc trích ly bằng dung môi co2 siêu tới hạn

• Đồng thời khảo sát khả năng ứng dụng của dầu neem được trích ly bằng dung môi

co2 siêu tới hạn ưong bảo quản hạt bắp

25

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Trích ly dầu hạt neem bằng dung môi: etanol, hỗn hợp hexan - etanol, CO2 siêu tới hạn có và không có sử dụng đồng dung môi etanol

- So sánh tỷ lệ thu hôi dầu từ các phương pháp trên

- Phân tích và đánh giá các chỉ số hóa lí (axit, peroxit, iot và xà phòng) của các sản phẩm dầu thu được và dầu thương mại

- Phân tích và so sánh thành phần axit béo trong dầu thu được từ các phương pháp trích ly trên và dầu thương mại

- Khảo sát khả năng kháng vsv của dầu neem trích được bằng dung môi co2 siêu tới hạn

Khảo sát khả năng kháng nấm mốc Aspergillus flavus của dầu neem trong quá trình

bảo quản hạt bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm