Xác định thành phần trái mướp đắng (momordica charantina Linn) thuộc họ bầu bí bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

Với mong muốn tìm hiểu một số hoạt chất có trong trái mướp ñắng nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu về tầm quan trọng của mướp ñắng trong công nghệ hóa học và dược phẩm ñã thúc ñẩy người n

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cam ñoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục 1

Danh mục các từ viết tắt 3

PHẦN MỞ ðẦU 4

PHẦN NỘI DUNG 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng 6

1.1.1 Mô tả cây mướp ñắng 6

1.1.2 Phân bố - Sinh thái 7

1.1.3 Tính chất và công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp ñắng trong dân gian 8

1.2 Các nghiên cứu hóa học về trái mướp ñắng 10

1.2.1 Các nghiên cứu trong nước 10

1.2.2 Các nghiên cứu trên thế giới 10

1.3 Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phân tích 11

1.3.1 Phương pháp sắc kí 11

1.3.1.1 Phương pháp phân tích bằng sắc kí cột 13

1.3.1.2 Phương pháp phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) 16

1.3.1.3 Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC) 18

1.3.1.4 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khí – khối phổ (GC/MS) 19

1.3.2 Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (IR) 20

1.3.3 Phương pháp phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 21

CHƯƠNG 2: KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1 Dụng cụ và hóa chất 23

2.1.1 Dụng cụ 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.2 Phương pháp thực nghiệm 23

2.2.1 Thu mẫu và xử lí mẫu 23

2.2.2 Xác ñịnh ñộ ẩm nguyên liệu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 ðịnh tính thành phần trái mướp ñắng tươi 25

3.1.1 ðiều chế cao EtOAc từ trái mướp ñắng tươi 25

3.1.2 Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong trái mướp ñắng tươi 26

3.1.2.1 Khảo sát sự hiện diện của Sterol 26

3.1.2.2 Khảo sát sự hiện diện của Tanin 28

3.1.2.3 Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid 29

3.1.2.4 Khảo sát sự hiện diện của Glycosid 30

3.2 ðịnh tính thành phần bột trái mướp ñắng khô 31

3.2.1 Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong bột trái mướp ñắng khô 31

3.2.1.1 Khảo sát sự hiện của Sterol 31

3.2.1.2 Khảo sát sự hiện của Tanin 31

3.2.1.3 Khảo sát sự hiện của Flavonoid 32

3.2.1.4 Khảo sát sự hiện của Glycosid 32

3.2.2 ðiều chế cao EtOAc từ bột trái mướp ñắng khô 33

PHẦN KẾT LUẬN – ðỀ XUẤT 38

1 Kết luận 38

2 ðề xuất 38

Tài liệu tham khảo 39

PHẦN MỞ ðẦU

1 Lý do chọn ñề tài:

Ngày nay, với sự tiến bộ của con người cùng với sự phát triển vượt bậc của ngành khoa học công nghệ ñã tạo ra hàng loạt các dược phẩm có nguồn gốc nhân tạo với tính năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng Nhưng ñằng sau ñó còn có những hạn chế, tác dụng phụ…gây ảnh hưởng ñến sức khỏe con người Do vậy khuynh hướng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài thực vật vừa có giá trị dinh dưỡng và dược tính chữa bệnh ñang ngày càng ñược quan tâm Trong ñó trái mướp ñắng (hay còn gọi là trái khổ qua) ñược xem là một loại thực vật hội ñủ các nhu cầu thiết yếu của con người hơn hẳn các loại thực vật khác trong tự nhiên

Trong cuộc sống hàng ngày, trái mướp ñắng ñược con người sử dụng như một loại thực phẩm thông dụng gần như không thể thiếu trong mỗi gia ñình Trong y học dược tính ñược của mướp ñắng ứng dụng ñiều trị các loại bệnh như: tiểu ñường, viêm phổi, sốt cao…Theo các nghiên cứu gần ñây thì thành phần trong trái mướp ñắng còn có tính diệt khuẩn cao và có cả hiệu lực chống ung thư Vào năm 1990, Liên Hiệp Quốc ñã chọn mướp ñắng là một trong sáu cây thuốc trị bệnh tiêu biểu trên thế giới

Nước ta ở vùng nhiệt ñới, thực vật phát triển quanh năm nên việc nghiên cứu trái mướp ñắng có nhiều triển vọng nhưng còn nhiều hạn chế về trình ñộ khoa học

và phương pháp nghiên cứu về mặt hóa học Với mong muốn tìm hiểu một số hoạt chất có trong trái mướp ñắng nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu về tầm quan trọng của mướp ñắng trong công nghệ hóa học và dược phẩm ñã thúc ñẩy người

nghiên cứu chọn nghiên cứu ñề tài “Xác ñịnh thành phần trái mướp ñắng (momordica charantina Linn) thuộc họ bầu bí bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng”

3 ðối tượng nghiên cứu:

ðề tài có ñối tượng nghiên cứu như sau:

+ Nguyên liệu: Trái mướp ñắng tươi (xanh)

+ Phương pháp sắc kí lớp mỏng

4 Phạm vi nghiên cứu:

- Do nội dung kiến thức khá rộng, cũng như khả năng nghiên cứu của bản thân nên

ñề tài cần xoáy sâu vào xác ñịnh thành phần của quả mướp ñắng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

- ðề tài thực hiện nghiên cứu quả mướp ñắng ở một số ñịa bàn và tiến hành phân tích thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

5 Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp nghiên cứu tài liệu

- Phương pháp quan sát

- Phương pháp thực nghiệm:

+ Dùng phương pháp sắc kí cột ñể ly trích dịch chiết

+ Dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng ñể xác ñịnh thành phần

PHẦN NỘI DUNG

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA VẤN ðỀ

1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng:

- Tên Khoa Học: Momordica Charantia Linn

- Tên gọi khác: Khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi

- Tên nước ngoài: Carilla fruit, balsam apple, balsam pear, bitter ground (Anh)

- Thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae)

1.1.1 Mô tả cây mướp ñắng:

Cây mướp ñắng là một loại dây leo, thân màu xanh lợt có góc cạnh, ở ngọn

hơi có lông tơ, cây mướp ñắng có ñời sống khoảng một năm Kích thước dây mướp ñắng khoảng bằng ngón tay út, dây bò từ 5 - 7m, dây leo ñược nhờ nhiều tua cuốn

Lá ñơn nhám, mọc so le, dài 5 - 10cm, rộng 4 - 8cm, phiến lá chia 5 - 7 thùy

hình trứng, mép có răng cưa ñều, mặt dưới lá có màu xanh nhạt hơn mặt trên, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn

Hoa mọc ñơn ñộc ở kẽ lá, hoa ñực, hoa cái cùng gốc, có cuống dài, cánh hoa

màu vàng nhạt, ñường kính của cánh hoa chừng 2cm, hoa ñực có ống ñài ngắn, tràng gồm 5 cánh mỏng hình bầu dục, nhị (nhụy) rời nhau Hoa cái có ñài và tràng giống với hoa ñực

Trái hình thoi dài 8 - 15cm, gốc và ñầu thon nhọn, trên mặt vỏ quả có nhiều

u sần sùi nổi lên to nhỏ không ñồng ñều Trái chưa chín có màu xanh, khi chín có

màu vàng hồng Vì thế ở Trung Quốc mướp ñắng (khổ qua) còn có tên là hồng

dương, hồng cô nương Khi chín, trái tét từ ñầu, tách ra làm 3 phần

Trái mướp ñắng có nguồn vitamin C khá phong phú cùng với nhiều loại axit cần thiết cho cơ thể con người Trái mướp ñắng khi còn xanh chứa 188g vitamin C trong 100g phần ăn ñược, nếu ñể chín tỷ lệ vitamin C còn một nữa

Trái mướp ñắng khi nấu mất ñi 40% lượng vitamin này Ở Ấn ðộ và Philipin người ta còn dùng ngọn non và lá non của dây mướp ñắng ñể làm rau ăn

Hạt mướp ñắng dẹt dài 13 - 15mm, rộng 7 - 8mm, trông gần giống hạt bí

ngô nhưng có khứa và có màng bao bọc, quanh hạt khi chín màng có màu ñỏ máu như màng gấc

Hình 1.1.Cây và trái mướp ñắng tươi

Hình 1.2 Cây, trái và hoa mướp ñắng

1.1.2 Phân bố - Sinh thái:

Chi Momordica.L có tổng số 45 loài, phân bố ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới ở khắp các châu lục Ở Châu Á có 5 - 7 loài

Trên thế giới mướp ựắng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt ựới từ châu Phi sang Châu Á và Châu Mỹ Có tài liệu cho rằng cây mướp ựắng ựược trồng lần ựầu tiên từ thời xa xưa ở Ấn độ, Nam Trung Quốc và Châu Phi Cùng với việc buôn bán nô lệ cây ựược du nhập sang Châu Mỹ Ở Ấn độ, Châu Phi vẫn ựang tồn tại quần thể mướp ựắng mọc hoang dại và trồng trọt với nhiều thứ khác nhau Quần thể mướp ựắng trồng ựã trở nên rất phong phú với các giống cây ựa dạng ựược tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo

Mướp ựắng cũng thấy nhiều ở các tỉnh miền nam Trung Quốc như : Phúc Kiến, Quảng đông, Quảng Tây, Giang Tô, Triết GiangẦTại Ấn độ, cũng như một

số nước ở đông Nam Á như Mã Lai, Thái Lan, PhilipinẦcũng có mướp ựắng Nói chung mướp ựắng ựược trồng nhiều ở các nước thuộc khắ hậu nhiệt ựới như: các nước đông Nam Á, đông Phi Châu, các nước ở Nam Mỹ

Ở Việt Nam cây ựược trồng ở khắp nơi trong nước ta từ Nam ựến Bắc, hầu hết các tỉnh từ ựồng bằng, trung du ựến miền núi ựể lấy trái làm thực phẩm Mướp ựắng thường ựược trồng xen với bầu, bắ, mướpẦ

Mướp ựắng ở Việt Nam hiện nay bao gồm nhiều giống Theo Phan văn Thanh và Nguyễn Tập, 1999, căn cứ vào hình dạng, kắch thước và màu sắc chia thành 3 nhóm giống khác nhau

Cây có biên ựộ sinh thái tương ựối rộng, nhiệt ựộ thắch hợp cho cây sinh trưởng từ 20 - 240C, hoặc cao hơn Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa và quả sau 7 - 8 tuần gieo trồng Hoa thụ phấn nhờ côn trùng Sau khi trái già, cây tàn lụi và kết thúc vòng ựời sau 4 - 5 tháng tồn tại

1.1.3 Tắnh chất và công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp ựắng trong dân gian:

Hầu hết các bộ phận của cây mướp ựắng ựều có công dụng chữa bệnh Trong

Y Học Cổ Truyền thì người ta ựã sử dụng các thành phần của cây mướp ựắng ựể chữa một số bệnh như sau:

• Rễ

Rễ mướp ñắng dùng ñể trị lị Tại Ấn ðộ, dịch rễ (cũng như lá và quả) mướp ñắng ñược dùng ñể trị bệnh ñái ñường tốt, do có tác dụng làm giảm ñường glucose trong máu Rễ mướp ñắng có thể trị bệnh gan và ta có thể áp dụng ở mọi dạng bệnh

• Thân (dây)

Thân cây mướp ñắng dùng ñể trị một số bệnh như: uống xổ lòng (dùng cho phụ

nữ uống sau khi sinh), bệnh gan vàng da

• Lá

Lá có vị ñắng, tính mát Lá non ăn trị bệnh nóng bức trong mình Giã lá, vắt nước, thêm chút muối uống trị bệnh nóng mê man Chữa chứng “ ðơn ñộc sưng ñỏ, mụt nhọt, ñau nhức”, chữa rắn cắn, giúp cơ thể mau bình phục khi mệt mỏi, háo khát, hồi hộp, ñi ñường xa vất vả, lao ñộng quá sức có thể dùng lá mướp ñắng non nấu canh ăn

Ngoài ra lá cây mướp ñắng còn chữa ñược nhọt ñộc, sưng tấy, vết thương nhiễm ñộc Dịch lá mướp ñắng còn có tính chất hơi nhuận trường, là hạ sốt, diệt giun

• Hạt

Hạt có chất béo, vị ñắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải ñộc, giải cảm, lợi tiểu, chữa ho viêm họng, rắn cắn, trẻ ñộng kinh

Theo “Từ ðiển Cây Thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi thì hạt mướp ñắng có tính

bổ dương, tráng khí, trẻ em lên cơn co giật do sốt cao hoặc kinh phong

Theo sách “ Những cây thuốc Việt Nam và vị thuốc Việt Nam ” của ðỗ Tất Lợi thì hạt mướp ñắng dùng với liều 3 gam hạt khô, dưới dạng sắc lấy nước uống, có thể chữa ho, làm hạ sốt

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần ñây, cho biết các hoạt chất trong mướp ñắng còn có tác dụng chống thụ thai, chống ung thư (do sự ức chế tổng hợp protein), làm hạ huyết áp, chống virus HIV…

1.2 Các nghiên cứu hóa học về trái mướp ñắng:

1.2.1 Các nghiên cứu trong nước:

- Ths.Võ Hồng Thái ñã nghiên cứu Khảo sát thành phần Triterpen Glycosid trong hạt mướp ñắng, Momordica Charantia L, họ bầu bí (Cucurbitaceae)

- Theo tạp chí Dược liệu, tập 6, số 2 + 3/2001, nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, ðoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng, Lê Minh Phương ñã Nghiên cứu thành phần hóa học cây mướp ñắng

Nhóm này chứng minh tác dụng hạ ñường huyết của cây mướp ñắng trên thỏ gây gây ñái tháo ñường là do sự hiện diện của các glucosid có trong trái mướp ñắng

- Một số kết quả nghiên cứu bước ñầu về mặt thực vật của cây mướp ñắng trồng ở

Việt Nam của nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Nguyễn Tập

- Theo Yumiko Kimura, Toshihidro Akihisa, Motohiko Ukiya của trường ñại học

Nihon Nhật Bản ñã nghiên cứu Dịch chiết của trái mướp ñắng từ metanol và xác ñịnh dựa trên cơ sở phương pháp phổ

- Theo nhóm nghiên cứu của trường ðại học Deakin ở Australia Phân tích thành phần hóa học của quả mướp ñắng cho thấy dịch chiết của quả mướp ñắng trong

CHCl3 - Metanol có chứa lipid, axit béo, amino axit, protein, chất khoáng

- Theo ông Hikaru Okabe và các cộng sự của ông ñã Cô lập và nhận danh ñược một

số triterpen glycoside từ quả và hạt của cây mướp ñắng

1.3 Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phân tích:

1.3.1 Phương pháp sắc kí:

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) là

người ñã ñặt nền móng phát minh ra kĩ thuật sắc kí, vào năm 1903 khi ông ñang nghiên cứu về chlorophyll Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu, nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ Tên này vẫn tiếp tục ñược dùng dù các phương pháp hiện ñại không còn liên quan ñến màu sắc

Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge ñược trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân bố

Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể ñược áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ ñó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau ðồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau

- Phương pháp sắc kí là một trong các kĩ thuật hóa học phân tích dùng ñể tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không ñồng ñều của chúng giữa pha tĩnh và pha ñộng khi cho pha ñộng ñi xuyên qua pha tĩnh Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong “pha ñộng” thường là do dòng chảy của dung môi, di chuyển qua “pha tĩnh”, pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc ñộ khác nhau chúng sẽ ñược tách ra khỏi nhau theo thời gian khác nhau

Sắc kí cũng là quá trình trao ñổi chất như các phương pháp hóa lí khác: chưng cất, chiết, kết tinh…nhưng khác với phương pháp khác ñó ở chỗ sự phân chia sắc kí ñược thực hiện do quá trình hấp phụ - giải hấp phụ ñược lặp ñi lặp lại trong suốt quá trình tách

- Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào hiện tượng hấp phụ của các chất hữu cơ trên chất hấp phụ (trong phương pháp này chất hấp phụ gọi là pha tĩnh và tính tan của chúng trong dung môi hữu cơ gọi là pha ñộng khi ñi qua chất hấp phụ)

Sự hấp phụ phụ thuộc vào cấu tạo phân tử của chất hấp phụ, theo nguyên tắc chất phân cực hấp phụ chất phân cực và ngược lại chất không phân cực hấp phụ chất không phân cực ðộ tan của chất hữu cơ trong dung môi phụ thuộc vào cấu trúc của chất và dung môi

Tùy thuộc vào cách thức thực hiện, từ ñó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau như:

Dựa vào ñộ phân cực mà chia chất hấp phụ làm hai loại chính: loại chất hấp phụ phân cực (như Fe2O3 > Al2O3 > Silicagel > cacbohidrat) và chất hấp phụ không

phân cực (như than hoạt tính, nhựa vonphatit EW) Các chất hấp phụ phân cực

thường hay hút nước trong không khí ẩm, làm cho bề mặt của nó không có khả năng hấp phụ ñược nữa Vì vậy trước khi làm thí nghiệm người ta phải hoạt hóa lại

ñể ñuổi nước khỏi bề mặt chất hấp phụ ở nhiệt ñộ 110 - 1200C từ 1, 5 giờ ñến 2 giờ Tùy theo lượng nước có trong oxit nhôm trung tính (hãng Merk) cỡ hạt 0,063 - 0,200nm mà chia chúng thành 5 ñộ hoạt hóa khác nhau:

Hoạt ñộ I: 0 – 0, 50 % nước II: 2, 4 – 3 % nước III: 4, 3 – 4, 5 % nước IV: 6, 5 – 9, 5 % nước V: 13 – 15 % nước ðối với các chất bị hấp phụ, khả năng phân cực của chúng ñược xếp theo thứ tự tăng dần ñộ phân cực: hidrocacbon < ankyl halogenua < các ete < amin bậc 3

và hợp chất nitro < andehit, xeton < amin bậc 1< amit của axit < ancol < axit cacboxylic

ðể có thể ñẩy ñược các chất nghiên cứu ra khỏi chất hấp phụ thì ái lực của chất hấp phụ với dung môi phải mạnh hơn ái lực của chất nghiên cứu Do ñó dung môi sẽ thế chỗ chất nghiên cứu Tác dụng này của dung môi gọi là tác dụng rửa giải của nó Trên các chất hấp phụ phân cực tác dụng rửa giải của dung môi ñược sắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau: ete dầu hỏa < xiclohexan < CCl4 < benzen < CHCl3 < ñietylete < etyl axetat < axeton < methanol < H2O < axit axetic

ðối với các chất hấp phụ không phân cực thì thứ tự trên ngược lại

1.3.1.1 Phương pháp phân tích bằng sắc kí cột:

- Phương pháp sắc kí cột dùng ñể tách các chất trong hỗn hợp và tinh chế chất

Trong sắc kí cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố ñịnh ñược nhồi

trong các ống hình trụ gọi là “cột” Tùy theo tính chất của chất ñược sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố), trao ñổi ion (cột trao ñổi ion)…Ở ñây trình bày sắc kí cột hấp phụ

- Nguyên tắc:

Sắc kí hấp phụ ñược tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng ñứng gọi là “cột”

với chất hấp phụ ñóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha ñộng chảy qua chất hấp phụ

ðối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó ñối với dung môi rửa cột ñể lấy ra ñược lần lượt trước hoặc sau

Chất hấp phụ trong sắc kí cột thường dùng là: oxit nhôm, silicagel, than hoạt tính, polyamid…

Silicagel là pha tĩnh ñược sử dụng rộng rãi nhất ñể tách các hợp chất thiên nhiên

Dung môi trong sắc kí cột có thể từng loại riêng biệt hoặc là hỗn hợp 2, 3 loại dung môi với tỷ lệ thích hợp

Với các chất hấp phụ cổ ñiển, dung môi sử dụng có ñộ phân cực tăng

Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh, ñầu dưới có khóa, ñầu trên có nút mài ñể nối với một phễu chứa dung môi Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, ñầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng một khóa kim loại ñể ñiều chỉnh tốc ñộ chảy của dung môi

Khi tiến hành chạy cột người ta thường dùng các cột có kích thước khác nhau tùy thuộc vào lượng chất ñem phân tích Việc lựa chọn kích thước rất quan trọng Thông thường cột có ñường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt Một vài cột có kích thước bán sẵn tương ứng với chiều dài và kích thước cột

ðường kính (cm) Chiều dài (cm)

1 15

2 25

3 40

4 60

- Kĩ thuật triển khai:

Kĩ thuật tách trên cột phụ thuộc rất nhiều vào cách nhồi cột và cách cho chất lên cột

Chuẩn bị cột: rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

Yêu cầu của cột sắc kí là chất rắn dùng làm cột phải phân tán ñồng ñều ở mỗi ñiểm trong cột thành một khối ñồng nhất

Cho chất hấp phụ vào cột còn gọi là nhồi cột

Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô

+ Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như: silicagel, sephadex…thì phải ngâm trong dung môi hữu cơ một thời gian trước khi cho vào cột ñể tránh bị nứt cột Lắc, trộn ñều bột hấp phụ với dung môi hành một hỗn dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống ñáy cột Trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn chảy ñều ra cột hứng, không ñược ñể khô dung môi trong cột Tiếp tục cho dung môi chảy một thời gian ñể ổn ñịnh cột mặt thoáng trên ñầu cột phải nằm ngang

+ Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở Chất hấp phụ ñược nhồi từ từ vào cột ở dạng khô nhờ một phễu cuống dài Dùng que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và ñều chung quanh cột theo chiều từ dưới lên ñể bột xuống ñều Khi chất hấp phụ ñược cho hết vào cột mới cho dung môi vào và chảy liên tục Không ñược ñể khô dung môi trong cột

Rửa cột: còn ñược gọi là giải ly chất ra khỏi cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc ñộ chảy của cột mà người ta có thể

tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén

+ Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực Cột

áp suất thường có nhược ñiểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn

+ Rửa cột bằng áp suất nén: Người ta thường cho dòng khí nén vào ñầu cột Cột cùng với áp suất nén phải có nút ñảm bảo kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột

Một hợp chất có thể bị giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào ñộ phân cực của dung môi giải ly

1.3.1.2 Phương pháp phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (Thin Layer

Chromatography – TLC):

- Giới thiệu:

Sắc lí lớp mỏng hay còn gọi là sắc kí bản mỏng hay sắc kí phẳng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng Trong ñó pha ñộng là chất lỏng ñược ñi ngang qua một lớp chất hấp phụ trơ như: silicagel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này ñược tráng thành một lớp mỏng, ñều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plactic

Do chất hấp phụ ñược tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là Sắc

Kí Lớp Mỏng (SKLM), bản mỏng là các tấm kính phẳng có kích thước 5 x 12cm hoặc 20 x 20cm

Năm 1938 Izmailov và Chaiber lần ñầu tiên dùng bột oxit nhôm trải trên lớp kính ñể phân tích dịch chiết alkaloid từ thực vật Sau ñó nhờ có công của Stahl tiêu chuẩn hóa các chất hấp phụ, thiết bị, qui trình phân tích, cách phát hiện… mà phương pháp này ñược phát triển

Ngày nay SKLM ñã là một phương pháp phân tích cơ bản không thể thiếu ñối với các nhà hóa học cũng như các nhà phân tích

- Nguyên tắc sử dụng:

Trong sắc kí lớp mỏng có 4 cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao ñổi ion, rây phân tử, nhưng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn Các chất cần tách trong SKLM có thể khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang ñối với phương chuyển ñộng của dung môi

SKLM là một phương pháp sắc kí dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành một lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha ñộng là dung môi di chuyển qua pha tĩnh

Cụ thể ta thực hiện như sau: Cho chất phân tích vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản ñể chấm một ít dung dịch mẫu, chấm chất này thành một vết nhỏ gọn, lên tấm lớp mỏng Sấy nhẹ ñể ñuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng ðặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng ñứng trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên trên cao trong tấm bảng, mẫu chất sẽ bị phân chia thành những chất riêng biệt Các vết sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp vật lí (nhìn trực tiếp bằng mắt, soi dưới ñèn tử ngoại…), bằng phương pháp hóa học (phun lên tấm bảng các loại dung dịch thuốc thử)

Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không ñổi trong một hệ dung môi xác ñịnh Trị số Rf ñược tính như sau:

Rf = a

b

Với a: Khoảng cách từ ñiểm chấm tại vạch xuất phát ñến tâm của vết

b: Khoảng cách từ vạch xuất phát ñến mức dung môi

Kỹ thuật sắc kí hiện nay vẫn là cơng cụ đắc lực trong ngành hĩa hữu cơ, đặc biệt trong hĩa hợp chất thiên nhiên:

+ Cho biết đặc điểm của hợp chất vừa trích ly, cơ lập được (một chất tinh khiết sẽ

cĩ giá trị Rf khơng đổi trong hệ dung mơi xác định)

+ Cĩ thể tiên đốn sơ bộ là trong hỗn hợp chiết ban đầu cĩ bao nhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết

+ ðể thăm dị tìm hệ dung mơi thích hợp cho quá trình sắc kí cột Trước khi dùng sắc kí cột để tách một lượng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thường hay sử dụng SKLM để thăm dị tìm hệ dung mơi thích hợp cho quá trình sắc kí cột

+ SKLM là cơng cụ đắc lực để theo dõi quá trình sắc kí cột, để nhận định các phân đoạn thu được từ sắc kí cột Việc quan sát các vết trên bản mỏng rất quan trọng để

cĩ thể nhận định rằng phân đoạn đĩ là hỗn hợp hay tinh khiết hoặc để gộp các phân đoạn cĩ cùng Rf với nhau

+ ðể theo dõi tiến trình của một phản ứng

1.3.1.3 Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC)

Sắc kí khí cĩ thể dùng để nghiên cứu các tính chất của hệ, cũng như nghiên cứu động học của các quá trình hĩa học Máy để tách sắc kí khí và thu phổ gọi là sắc kí khí (GC) Trong quá trình phân tích, khí được thổi liên tục từ bình chứa qua một hệ thống gồm bộ nạp mẫu, cột, detector và lưu lượng kế

Bộ nạp mẫu dùng để đưa mẫu khí hoặc lỏng vào cột sắc kí Do đĩ, mỗi loại cột chỉ tách những chất nhất định và trong những điều kiện nhất định Các yếu tố cần lưu ý khi sử dụng sắc kí gồm:

+ Khí mang: Các khí mang phải được bảo đảm tính chất khuyếch tán cần thiết, phù hợp với độ nhạy cần thiết, trơ với tướng tĩnh lỏng, chất phân tích, vật liệu làm cột và detector Khí mang cĩ khả năng hấp phụ càng nhỏ càng tốt, cĩ độ sạch cao, dễ sử dụng và giá thành chấp nhận được Các khí mang thơng thường là nitơ, argon, heli…Tốc độ dịng khí mang ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích vì hiệu suất cột phù thuộc vào nĩ ðộ nén khí trong cột (áp suất khí mang) cĩ ảnh hưởng

nhất ñịnh ñến các ñại lượng ño ñược trong sắc kí Tốc ñộ khí mang và áp suất thường ñược xác ñịnh bằng thực nghiệm và trên một máy sắc kí khí cụ thể

+ Cột sắc kí: Cột sắc kí là một sản phẩm hoàn chỉnh, trong ñó có vật liệu làm cột, kích thước chất mang…Mỗi cột có những chất mang khác nhau ñể phân tích những loại chất khác nhau

+ Nhiệt ñộ: Tùy thuộc vào nhiệt ñộ hóa hơi của mẫu mà sử dụng chế ñộ nhiệt

ñộ thích hợp Nhiệt ñộ thích hợp ñã chọn phải giữ không ñổi trong suốt thời gian thí nghiệm Có thể dùng ñẳng nhiệt hay chương trình nhiệt ñộ ñể phân tích Quá trình sắc kí xảy ra ở nhiệt ñộ không ñổi trong thời gian bơm mẫu và không ñổi trên toàn

bộ chiều dài của cột tách, gọi là ñẳng nhiệt Còn trường hợp thay ñổi nhiệt ñộ theo thời gian theo chương trình nhất ñịnh, gọi là chương trình nhiệt ñộ

1.3.1.4 Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí – khối phổ (GC/MS):

Phương pháp sắc kí khí – khối phổ GC/MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) dựa trên cơ sở nối ghép sắc kí khí với một máy khối phổ, ñể xác ñịnh một cấu tử nào ñó trong hỗn hợp chất cần phân tích ðây là phương pháp nhanh và rất hiệu quả trong việc xác ñịnh thành phần của các chất tổng hợp ñược ðể hiểu thêm về phương pháp này, cần ñiểm qua về máy khối phổ Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu bằng cách ño chính xác khối lượng phân tử chất ñó Chất nghiên cứu trước tiên ñược chuyển thành trạng thái hơi, sau ñó chuyển thành các ion Các ion tạo thành ñưa vào máy khối phổ

Quá trình biến ñồi các phân tử trung hòa thành các ion ñược gọi là ion háo Các ion có khối lượng m và ñện tích e Tỷ số m/e ñược gọi là số khối z Khi tách ion có số khối khác nhau và xác ñịnh xác suất có mặt của chúng, người ta vẽ ñồ thị mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay gọi là cường ñộ I) và số khối z ðồ thị ñó gọi là phổ khối lượng ðể ñánh giá chất lượng của khối phổ kế, người ta dùng khái niệm “ñộ phân giải” (R):

R=m/∆m Trong ñó : m là khối lượng ion

m

∆ là hiệu số khối lượng hai ion có thể tách khỏi nhau