Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 736-2006 về sữa tươi - Xác định dư lượng Chloramphenicol - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ áp dụng để xác định dư lượng Chloramphenicol trong sữa tươi. Mời các bạn tham khảo.
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7362006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 10 TCN 7362006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7362006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (freshmilk determination of Chloramphenicol) (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNNKHCN ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn) 1. Đối tượng và phạm vi áp dụng Qui trình này áp dụng để xác định dư lượng Chloramphenicol trong sữa tươi; Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với sữa tươi là: 0,1 àg/kg (ppb) 2. Giải thích thuật ngữ Dư lượng Chloramphenicol trong sữa tươi: Lượng Chloramphenicol còn tồn dư trong sữa tươi chưa biến đổi thành dạng khác 3. Ngun tắc Chloramphenicol được chiết ra từ mẫu bằng dung mơi thích hợp, sau đó được làm sạch và đưa vào phân tích sắc ký.Chloramphenicol được phát hiện và định lượng trên hệ thống LC/MS 4. Hố chất và thuốc thử Hố chất và thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho sắc ký 4.1. Ethyl acetate 4.2. Methanol 4.3. Axit formic 4.4. Hexan 4.5. Acetonitril 4.6. Cột chiết pha rắn C18: Varian Mega – BE (1g, 6ml); PRS: BondElut LRCPRS 500 mg 4.7. Màng lọc syringe (0,2 m, PTFE) 4.8. Chloramphenicol (CAP) 99,5% 5. Thiết bị, dụng cụ: 10 TCN 7362006 5.1. Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ đa cấp LC/MSn; máy tính và phần mềm phân tích 5.2. Ống ly tâm polypropylene 59 ml có nắp 5.3. Ống thuỷ tinh 30ml có nắp; 5.4. Ống polypropylen 5ml có nắp; 5.5. Bình định mức 25ml, 50ml, 100ml, 200ml và 1000ml; 5.6. Pipet (thuỷ tinh) 2ml, 5ml, 20ml, 25ml; 5.7. Pipet tự động 100 l, 250 l ; 1000 l; 5.8. Máy ly tâm lạnh, tốc độ 6000 vòng/phút; 5.9. Cân phân tích kỹ thuật 200g có độ chính xác đến 0,1 mg; 5.10. Bơm chân khơng 0,4 bar ,12w; 5.11. Máy cơ quay chân khơng; 5.12. Máy đo pH có độ chính xác đến 0.01; 5.13. Hút dung mơi tự động 5 ml, 30 ml, 50 ml 6. Lấy mẫu và bảo quản mẫu: Lấy mẫu theo TCVN 5531:1991 Mẫu được bảo quản ở –200C. Mẫu phải được giải đơng trước khi phân tích 7. Cách tiến hành 7.1. Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 100 g/ml: Cân 10mg chuẩn CAP (99,5%) vào bình định mức 10 ml. Hồ tan và định mức bằng methanol. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 g/ml. Tiếp tục pha lỗng 10 lần trong methanol được dung dịch chuẩn có nồng độ 100 g/ml. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong 1 tháng Dung dịch chuẩn trung gian 1 g/ml: Lấy 500 l dung dịch gốc nồng độ 100 g/ml vào bình định mức 50 ml. Hồ tan và định mức bằng dung dịch axit focmic 0,1%. Dung dịch chuẩn làm việc: Pha dãy chuẩn dung dịch làm việc như sau: Dung dịch chuẩn trung gian ( l ) 1000 400 200 100 Dung dịch axit focmic 0,1%( l ) 4000 4600 4800 4900 Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc (ng/ l) 0,2 0,08 0,04 0,02 Bơm các dung dịch có nồng độ 0; 0,02; 0,04; 0,08; 0,2 ng/ l lên hệ thống LC/MSn và lập đường chuẩn 10 TCN 7362006 7.2. Chiết tách: Lấy chính xác 10ml sữa tươi vào ống ly tâm 59 ml. Cho tiếp 20 ml ethyl acetate, lắc mạnh trong 1 phút rồi ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Tiếp theo chuyển lớp ethyl acetate bằng pippet sang bình quả lê 100 ml Lập lại bước trên lần 2 Cho bay hơi tới khơ bằng hệ thống cơ quay chân khơng ở 50oC. Sau đó cho vào bình 30 ml cất, lắc 5 giây rồi siêu âm đuổi khí trong 2 phút 7.3. Làm sạch: Chuyển dung dịch vào ống ly tâm 30 ml. Tráng bình bằng 5 ml Hexan Lắc đều ống ly tâm trong 30 giây rồi ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ lớp Hexan phía trên. Lập lại bước trên lần 2 Chuyển dung dịch lên cột SPE để loại bỏ lớp chất lỏng, điều chỉnh tốc độ 2 giọt/giây. Tráng cột lần 1 bằng 1 ml nước cất, lần 2 bằng 2 ml nước cất. Để khơ cột trong 1 phút. Rửa giải bằng 4 ml methanol Cho bay hơi tới khơ bằng cơ quay chân khơng ở 50 oC. Hồ tan cặn bằng 250 l axit focmic 0,1% Lọc qua màng lọc syringe 0,2 m trước khi đưa lên máy 7.4. Phân tích sắc kí: Mẫu sau khi chiết tách, làm sạch được bơm 100 l lên máy LC/MSn . Nhiệt độ interface: 2750 C Áp suất khí Nitơ: 6 – 35 psi ( 0.4142.414KPa) Phân cực ion: Khơng phân cực () Tốc độ dòng : 250 l/phút Chạy Gradient: Thời gian (phút) 0 – 5 6 – 18 20 22 Acetonitril (%) 20 90 Axit Focmic (%) 98 80 10 Trong đó: CAP được qt phổ ở các bước sau: Bước 1: () MS m/z 300 – 350 Bước 2 : () MS2 m/z 321,2 Acetonitril 24% Bước 3: () MS2 m/z 323,2 Acetonitril 24% 8. Tính tốn và biểu thị kết quả 10 TCN 7362006 8.1 Xử lý kết quả thu được: Dựa trên cơ sở so sánh phổ khối của mẫu phân tích và phổ khối của các chất chuẩn để định tính . Phân tích định lượng theo phương pháp đường chuẩn 8.2 Kết quả được tính: theo phương pháp đường chuẩn. Lượng Chloramphenicol được xác định theo cơng thức: X AVH 2V2 H 1V1 P Trong đó: A là nồng độ chất chuẩn, tính bằng miligam trên mililit; V là thể tích chất chuẩn bơm vào máy, tính bằng microlit; H2 là diện tích píc của mẫu; V2 là thể tích cuối cùng của mẫu, tính bằng microlit; H1 là diện tích của pic chuẩn; V1 là thể tích bơm vào máy, tính bằng microlit; P là lượng cân mẫu, tính bằng lít; 8.3 Biểu thị kết quả: g/l đến 3 chữ số sau dấu phẩy 9.Tài liệu tham khảo: Tài liệu làm căn cứ chính để xây dựng tiêu chuẩn: LIB No. 4281 Volume 18.No.5, May 2002 (Mỹ) Agilent technologies, Inc, 2003 (Mỹ) Chloramphenicol identification by liquid chromatography tandem massspectroetry AFSSAFOUGERES KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng ... 7.1. Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 100 g/ml: Cân 10mg chuẩn CAP (99,5%) vào bình định mức 10 ml. Hồ tan và định mức bằng methanol. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 0 g/ml. Tiếp tục pha lỗng 10 lần trong methanol được dung dịch chuẩn có nồng độ... 10 TCN 7362006 Hà Nội 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 7362006 SỮA TƯƠIXÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL... Dung dịch chuẩn làm việc: Pha dãy chuẩn dung dịch làm việc như sau: Dung dịch chuẩn trung gian ( l ) 100 0 400 200 100 Dung dịch axit focmic 0,1%( l ) 4000 4600 4800 4900 Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc (ng/