Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9969:2013 về Chất béo sữa - Xác định thành phần của axit béo bằng sắc ký khí lỏng qui định phương pháp xác định thành phần của axit béo trong chất béo sữa (milk fat) và chất béo thu được từ các sản phẩm sữa). Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9969 : 2013 ISO 15885:2002 CHẤT BÉO SỮA - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA AXIT BÉO BẰNG SẮC KÝ KHÍ LỎNG Milk fat - Determination of the fatty acid composition by gas-liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 9969:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 15885:2002; TCVN 9969:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng Cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố CHẤT BÉO SỮA - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA AXIT BÉO BẰNG SẮC KÝ KHÍ LỎNG Milk fat - Determination of the fatty acid composition by gas-liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định thành phần axit béo chất béo sữa (milk fat) chất béo thu từ sản phẩm sữa) Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8103 (ISO 14156), Sữa sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipit hợp chất hòa tan lipit TCVN 9968 (ISO 15884), Chất béo sữa - Chuẩn bị metyl este axit béo Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Thành phần axit béo chất béo sữa (fatty acid composition of milk fat) Phần khối lượng axit béo riêng rẽ xác định quy trình quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH: Thành phần axit béo chất béo sữa (số gam axit tự đơn lẻ) 100 g axit béo tổng số (axit tự do) biểu thị phần trăm khối lượng Nguyên tắc Các metyl este axit béo (FAME) chất béo sữa chuẩn bị chuyển hóa este Các metyl este tách xác định sắc ký khí lỏng mao quản Từng FAME định lượng cách đối chiếu với thành phần chất béo sữa biết Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước loại khống nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác 5.1 Metyl este axit béo (FAME) đối chứng dùng cho mục đích nhận biết, có độ tinh khiết cao (> 90 %), metyl este axit oleic, linoleic linoleic bao gồm FAME với nguyên tử cacbon từ C4 đến C22 mạch thẳng số chẵn, bão hòa CHÚ THÍCH: Một tập hợp FAME đối chứng thu từ hỗn hợp có bán sẵn hỗn hợp phòng thử nghiệm chuẩn bị từ chất riêng rẽ 5.2 Chất béo sữa đối chứng, dùng cho mục đích định lượng Sử dụng chất béo sữa biết thành phần axit béo (ví dụ: Mẫu chuẩn CRM 164 1)) 5.3 Dung môi chất béo, n-alkan ( n-pentan, n-hexan n-heptan), không chứa chất xuất vùng quan tâm sắc đồ 5.4 Khí mang, hydro, heli nitơ, có độ tinh khiết tối thiểu 99,999 % với hàm lượng oxi x 10 -6 5.5 Các loại khí khác, khơng chứa tạp chất hữu (hàm lượng C nHm x 10 -6) Sử dụng khí nitơ khí hydro có độ tinh khiết nhỏ 99,995 % khơng khí nhân tạo Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Máy sắc ký khí lỏng, gồm có phận sau: 6.1.1 Bộ bơm mẫu Duy trì bơm mẫu kiểu bơm phun (bơm chia dòng bơm cài đặt chương trình nhiệt độ, PTV) nhiệt độ 220 oC (trường hợp sử dụng PTV nhiệt độ cuối bơm phải 220 oC) Trường hợp sử dụng bơm cột lạnh, trì bơm nhiệt độ thấp điểm sôi dung mơi vài độ 6.1.2 Lò cột, có khả chạy chương trình từ nhiệt độ gần với nhiệt độ mơi trường đến 260 o C 6.1.3 Cột, mao quản silica thủy tinh miệng rộng hẹp, có chiều dài bề dày pha tĩnh thích hợp để có đặc tính thực Điều CHÚ THÍCH 1: Các pha tĩnh bán sẵn thị trường có chứa pha bị biến tính axit nitroterephtalic khơng bị biến tính poly(etylen glycol) pha phân cực khác cho thấy phù hợp CHÚ THÍCH 2: Các pha tĩnh thay pha phân cực khác với điều kiện cho độ phân giải FAME tương tự 6.1.4 Detector ion hóa lửa, làm việc nhiệt độ cao nhiệt độ cuối lò cột (6.1.2) đến 20 oC 6.1.5 Bộ phận nén khí mang, loại ngăn khuếch tán oxy, trì áp lực đầu cột tốc độ khí mang tuyến tính, với kiểm sốt tốc độ dòng thích hợp để đạt tốc độ dòng u cầu Nếu sử dụng bơm chia dòng kiểu bơm phun, kiểm sốt tốc độ dòng rãnh tách để có tỷ lệ chia từ 1:50 đến 1:100 CHÚ THÍCH: Các ví dụ tốc độ dòng là: 15 cm/s đến 25 cm/s nitơ, 25 cm/s đến 35 cm/s khí heli từ 35 cm/s đến 55 cm/s khí hydro nhiệt độ ban đầu lò 6.2 Xyranh bơm, loại thủ cơng dung tích tối đa 10 l bơm tự động, theo khuyến cáo thiết bị Thông thường xyranh 10 l chia vạch 0,2 l Nếu cần chia vạch 0,1 l sử dụng xyranh l 6.3 Hệ thống liệu, xử lý thơng tin yêu cầu Điều 7, 10 11 1) Mẫu chuẩn có bán sẵn từ Bureau chuẩn, Hiệp hội Châu Âu, Brussel, Bỉ Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm 7 Yêu cầu hiệu Chuẩn bị hỗn hợp mẫu thử metyl butyrat, metyl stearat metyl oleat nồng độ 0,1 mg/ml dung môi chất béo (5.3) Tách hỗn hợp sắc ký khí sử dụng điều kiện vận hành giống điều kiện vận hành mẫu chất béo sữa Pic chất thử nghiệm lớn ba phần tư toàn thang đo hệ thống liệu (6.3) Cần thu khả tách lớn metyl butyrat khỏi pic dung môi đạt độ phân giải (độ phân giải đường nền) metyl stearat metyl oleat 1,5 Tính độ phân giải, R, công thức sau: R d / W1 W2 Trong đó: d khoảng cách hai đỉnh pic tương ứng metyl stearat oleat, tính milimet (mm); W1 chiều rộng pic metyl stearat, đo tiếp điểm tiếp tuyến điểm uốn đồ thị với đường nền, tính milimet (mm); w2 chiều rộng pic metyl oleat, đo tiếp điểm tiếp tuyến điểm uốn đồ thị với đường nền, tính milimet (mm) Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu khơng bị hư hỏng thay đổi suốt trình bảo quản vận chuyển Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị mẫu thử phần mẫu thử Đối với mẫu chất béo sữa, xem TCVN 9968 (ISO15884) Đối với sản phẩm khác, xem TCVN 8103 (ISO 14156) 10 Cách tiến hành 10.1 Điều kiện vận hành Chọn điều kiện vận hành [nghĩa là: chiều dài cột, đường kính trong, chiều dày mang pha tĩnh, nhiệt độ lò ban đầu, tốc độ gia nhiệt, nhiệt độ cuối lò, tốc độ dòng khí mang] để đáp ứng yêu cầu nêu Điều 10.2 Bơm mẫu Theo hướng dẫn nhà sản xuất bơm mẫu Khi sử dụng bơm chia dòng phun, dùng microxyranh (6.2) lấy từ 0,5 l đến 1,5 l phần mẫu thử (Điều 9) Hút mẫu vào xyranh Lắp kim bơm vào bơm nóng, sau s đến s, rút nhanh kim khỏi bơm Nếu tiến hành bơm theo kỹ thuật cột lạnh, pha lỗng phần mẫu thử (Điều 9) với dung mơi chất béo (5.3), (ví dụ: tỷ lệ pha loãng 1:10) Bơm phần mẫu thử chuẩn bị nhiệt độ lò thấp nhiệt độ sôi dung môi sử dụng vài độ 10.3 Phân tích định tính Phân tích FAME đối chứng (5.1) điều kiện làm việc phần mẫu thử Ghi lại thời gian lưu lượng chất đối chứng CHÚ THÍCH 1: Các este rửa giải theo thứ tự số nguyên tử cacbon tăng dần theo thứ tự số liên kết đôi tăng dần số (n) nguyên tử C (ví dụ: metyl palmitat rửa giải trước metyl stearat) Các FAME có 18 nguyên tử cacbon rửa giải theo thứ tự: metyl stearat, metyl oleat, metyl linoleat, metyl linolenat Các FAME mạch nhánh rửa giải trước este mạch thẳng có chứa số nguyên tử cacbon theo thứ tự: metyl este [(n - 2)] iso mạch nhánh rửa giải trước metyl este [(n - 3)] anteiso mạch nhánh CHÚ THÍCH 2: Sắc ký đồ Hình ví dụ việc nhận biết thử FAME chất béo sữa Nhận biết pic mẫu thử cách so sánh với liệu thời gian lưu thu hỗn hợp chuẩn sử dụng sắc ký đồ nêu Hình 10.4 Phân tích định lượng 10.4.1 u cầu chung Chuyển hóa metyl chất béo sữa đối chứng (5.2) Điều Phân tích hỗn hợp FAME thu điều kiện làm việc phần mẫu thử Kết thúc ghi sắc ký đồ sau rửa giải xong axit docosanoic (C22:0) Ước tính phần trăm thành phần đại diện theo pic có sắc phổ, sử dụng phương pháp chuẩn hóa, giả sử tất thành phần mẫu đại diện có mặt sắc ký đồ Khi đó, tổng diện tích pic có liên quan đại diện cho 100 % thành phần mẫu (rửa giải 100 %) Xác định diện tích pic metyl este axit béo (nghĩa tất pic sắc phổ, trừ pic dung môi, pic chất ổn định pic có mặt phép thử trắng) 10.4.2 Tính diện tích pic Tính phần trăm, PAi, pic thành phần i tổng diện tích pic, theo cơng thức sau: PAi Ai Ai 100% Trong đó: Ai diện tích pic tương ứng với thành phần i; Ai tổng diện tích tất pic tương ứng với thành phần metyl este axit béo Các điều kiện vận hành Kích thước cột Đường kính 0,32 Loại bơm mm, dài 30 m, chiều dày màng film 0,25 , Thủ công Pha tĩnh J&W DB wax Kiểu bơm Chia dòng Khí mang Hydro Thể tích bơm l Áp lực đầu cột 0,4 bar Tỷ lệ chia dòng khoảng 1:25 xác định 40 oC Nồng độ mẫu mg/ml hòa tan Nhiệt độ bơm n-hexan Nhiệt độ detector 280 oC 250 oC Hình - Tách FAME từ chất béo sữa GLC 10.4.3 Xác định tính hệ số điều chỉnh 10.4.3.1 Xác định Để xác định hệ số hiệu chỉnh, fi, dùng để chuyển phần trăm diện tích pic sang phần trăm khối lượng thành phần, khối lượng biết, i, thành phần i chất béo sữa đối chứng(5.2) chia cho phần trăm diện tích pic tương ứng sắc ký đồ chất béo sữa đối chứng 10.4.3.2 Tính kết Tính hệ số hiệu chỉnh, fi, theo cơng thức sau: fi Ai i i Ai i Ai Trong đó: i phần khối lượng thành phần i chất béo sữa đối chứng (5.2), tính theo axit béo tự do; i tổng phần khối lượng thành phần khác có chất béo sữa đối chứng(5.2), tính theo axit béo tự 10.4.3.3 Chuẩn hóa hệ số hiệu chỉnh Chuẩn hóa hệ số hiệu riêng rẽ theo hệ số hiệu metyl palmitat để thu hệ số hiệu tương đối thành phần i, f'i, theo công thức sau: f 'i fi fp Trong đó: fp hệ số hiệu metyl palmitat (f'i metyl palmitat = 1) 10.4.4 Xác định phần mẫu thử Phân tích phần mẫu thử chuyển hóa metyl (Điều 9) xác định diện tích pic theo 10.4.2 11 Tính biểu thị kết 11.1 Tính Tính phần khối lượng thành phần i riêng rẽ có phần mẫu thử, sau: i ,s Trong f ' i PAi ,s f ' i PAi ,s 100% i,s theo công thức i,s phần khối lượng thành phần i có mẫu thử, xác định gam axit béo tự 100 g axit béo tổng số, tính %; PAi,s phần trăm diện tích pic tương ứng thành phần i có mẫu thử Nêu thành phần mẫu chưa xác định ("chưa biết") vào báo cáo cuối cùng, sử dụng hệ số hiệu chỉnh f' = để tính kết 11.2 Biểu thị kết Biểu thị kết đến hai chữ số thập phân 12 Độ chụm 12.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu sử dụng phương pháp chuẩn bị metyl este theo TCVN 9968 (ISO 15884) tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm thực theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) 12.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm người phân tích, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn hơn: - % giá trị tuyệt đối 1g/100 g, thành phần axit béo có mặt vượt g 100 g axit béo tổng số; - 12 % giá trị tuyệt đối 0,5 g/100 g, thành phần axit béo có mặt với lượng từ g đến g 100 g axit béo tổng số 12.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người phân tích khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp lớn hơn: - 15 % giá trị tuyệt đối 4g/100 g, thành phần axit béo có mặt vượt g 100 g axit béo tổng số; - 20 % giá trị tuyệt đối g/100 g, thành phần axit béo có mặt với lượng từ g đến g 100 g axit béo tổng số 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) tất thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, xem tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết thử e) kiểm tra độ lặp lại nêu kết thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn ... chuẩn bị metyl este theo TCVN 9968 (ISO 15884) tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm thực theo TCVN 691 0-1 (ISO 572 5-1 ) TCVN 691 0-2 (ISO 572 5-2 )... không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị mẫu thử phần mẫu thử Đối với mẫu chất béo sữa, xem TCVN 9968 (ISO1 5884) Đối với sản phẩm khác, xem TCVN 8103 (ISO 14156) 10... sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 691 0-1 :2001 (ISO 572 5-1 :1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 691 0-2 :2001 (ISO 572 5-2 :1994), Độ